一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法
【專利摘要】本發明屬于生物發酵工程【技術領域】，具體涉及一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法。其發酵周期短，發酵菌絲體產量高。本發明采用的技術方案包括為：將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，得種子液；將種子液按體積百分比為10～15%的接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27～30℃的條件下，液體發酵培養24～36h，然后加入脫落酸溶液，繼續培養56～72h，得到桑黃菌絲體和發酵液；將得到菌絲體和發酵液通過板框壓濾機壓濾，然后將濾餅在70～80℃的溫度下烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發酵菌絲體。
【專利說明】一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法
[0001]一、【技術領域】:
本發明屬于生物發酵工程【技術領域】，具體涉及一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法。
[0002]二、【背景技術】:
桑黃是一種多年生的藥用真菌，是我國最有發展前景的珍稀、瀕危中藥之一。主要分布于秦嶺、陜西與甘肅交界的“子午嶺”地區。生長于楊、桑、柳、白樺、櫸樹、桃等闊葉樹的枯立木及樹干上。《中藥大辭典》記載，其可治血崩、血淋、帶下、閉經等婦科疾病。現代研究發現桑黃具有明顯的抗肝纖維化作用，并且又是目前國際公認的生物治癌領域有效率排在第
一的聞等真菌。
[0003]隨著生物技術的發展，桑黃藥理作用不斷被揭示，對桑黃多糖類等活性物質研究工作的深入，人們將中藥材桑黃作為一種重要生物資源，應用于抗腫瘤產品開發，在科技界和實業界都傾注了很高的熱情。
[0004]現在社會腫瘤發病率呈上升趨勢，腫瘤的轉移是導致治療失敗最主要的原因。桑黃多糖對腫瘤轉移有著顯著抑制作用，1999年Han等研究表明桑黃多糖與阿霉素(ADM)的活性比較，不僅可以抑制腫瘤生長還可以抑制腫瘤轉移，單獨使用桑黃多糖顯著提高了植入黑素瘤B16F10的小鼠的存活率，抑制了裸鼠體內植入的NC1-H23的生長并減少黑素瘤B16F10的肺轉移率。阿霉素 (ADM)對腫瘤轉移的抑制作用較輕，與桑黃多糖合用可使阿霉素(ADM)對腫瘤生長的抑制作用增強，但不論與大劑量或小劑量的阿霉素(ADM)合用都使桑黃多糖對腫瘤細胞轉移的抑制率低于單獨使用桑黃多糖。
[0005]1968年，Ikekawa等報道了云芝和桑黃等11種真菌對小鼠接種肉瘤180ICR的抗腫瘤作用，桑黃水提取物對腫瘤的抑制率最強，抑瘤率可達到96.7%，而且這種提取物對肉瘤180細胞不表現細胞毒性。1993年韓國政府已正式許可桑黃成為菌類抗腫瘤藥品。
[0006]目前桑黃作為新的生物藥品和抗腫瘤制品開發利用，在國內才開始起步，在日本和韓國已有了產品上市。1993年韓國政府正式許可桑黃成為菌類抗腫瘤藥品。桑黃子實體國際市場價每公斤2300美元。由于市場需求量增大，價格高，對桑黃進行掠奪性開采現狀還是無法杜絕，野生子實體孢子無法大量形成，桑黃本身生理生態的特殊性和復雜性，造成野生桑黃資源難以恢復，甚至即將枯竭。所以對桑黃資源的保護和開發迫在眉睫。因此，采用生物技術進行深層發酵，獲取含有效成分的桑黃菌絲體，形成穩定的醫藥工業產品來源是非常重要的。既促進了桑黃產業的規模化發展，又保護了瀕危和緊缺的桑黃資源，保證了中藥資源的永續利用。
[0007]目前已有一些科研院所及生物公司在用發酵法生產桑黃菌絲體，尚未有從桑黃生物代謝的角度分析研究，對發酵法生產桑黃菌絲體發酵水平的提高有限，發酵周期長，成本高，整體的生產效率較低，遠不能滿足進一步實現工業化發酵生產的需要。
[0008]脫落酸又被稱為S-誘抗素，是一種生物抗逆誘導物，最初被認為是一種生長抑制物質，對種子(果實)的發育、成熟，植物和種子休眠，器官脫落等起重要作用。隨著研究的不斷深入，發現脫落酸在植物干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫反應中起重要作用，它是植物的抗逆誘導因子，因而被稱為植物的“脅迫激素”。
[0009]液體發酵法生產桑黃菌絲體的發酵條件與自然界的桑黃生長有很大不同，對于長期在自然界生長發育的桑黃菌絲生長來說發酵過程不是一種最適的生長發育環境，而利用脫落酸誘導生物產生各種應對的抵抗能力提高桑黃菌絲體在發酵條件下抗逆作用，使菌絲體生長速度加快，產量提高。
[0010]三、
【發明內容】
:
本發明為了解決上述【背景技術】中的不足之處，提供一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其發酵周期短，發酵菌絲體產量高。
[0011]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其特征在于:所述的發酵方法包括以下步驟:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按體積百分比為10~15%的接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發酵培養24~36h，然后加入脫落酸溶液，然后繼續培養56~72h，得到桑黃菌絲體和發酵液的混合液；
步驟三:將步驟二得到的桑黃菌絲體和發酵液的混合液通過板框壓濾機壓濾，然后將濾餅在70~80°C的溫度下烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發酵菌絲體。
[0012]所述的種子培養條件為:溫度28°C，搖床培養108h。
[0013]所述的脫落酸溶 液的濃度為0.5~1.5ppm/L ;脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度。
[0014]所述的液體培養基為常規綜合pda液體培養基。
[0015]所述的真空濃縮的真空度0.09~0.1MPa,噴霧干燥工藝的入口溫度136~141°C，出口溫度81~82°C，蠕泵轉速8r/min，風機轉速906r/min，工作壓力0.23~0.24MPa0
[0016]與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下:本發酵方法生產桑黃菌絲體產量與已報道的桑黃發酵工藝技術相比，具有發酵周期短且發酵菌絲體產量高的優點，發酵周期92h，菌絲體產量達29.13g/L。
[0017]四、【具體實施方式】:
桑黃，俗稱鮑氏層孔、火木層孔、針層孔等，屬于擔子菌綱、多孔菌目，多孔菌科，層孔菌屬，是近幾年開發的一種多年生藥用真菌。通過對桑黃發酵菌絲體生產過程中添加脫落酸的初步研究，發現脫落酸對桑黃發酵工藝的發酵周期及菌絲體產量具有較大的影響，在優化后的發酵工藝下發酵，發酵周期可由沒添加脫落酸的120h縮短為92h，菌絲體產量由22.5g/L提高到29.13g/L，具有工業化生產的潛力。
[0018]本發明采用液體深層培養方法通過在發酵過程中添加不同脫落酸濃度對桑黃菌絲體產量的影響，研究桑黃發酵菌絲體發酵過程中最適的脫落酸濃度，篩選出了桑黃發酵過程中添加脫落酸濃度為0.5~1.5ppm/L，發酵周期92h，菌絲體產量達29.13g/L。
[0019]實施例1:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為:溫度28°C，搖床培養108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發酵培養24h，然后加入脫落酸溶液，脫落酸的濃度為
0.5ppm/L，脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度，然后繼續培養72h，得到桑黃菌絲體和發酵液的混合液；
步驟三:將步驟二得到的菌絲體和發酵液的混合液通過板框壓濾機壓濾，濾餅70~80°C烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發酵菌絲體，稱重。
[0020]實施例2:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為--溫度28°C，搖床培養108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發酵培養30h，然后加入脫落酸溶液，脫落酸的濃度為
1.0ppm/L，脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度，然后繼續培養62h，得到桑黃菌絲體和發酵液的混合液；
步驟三:同實施例1。
[0021]實施例3:` 步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為--溫度28°C，搖床培養108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發酵培養36h，然后加入脫落酸溶液，脫落酸的濃度為
1.5ppm/L，脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度，然后繼續培養72h，得到桑黃菌絲體和發酵液的混合液；
步驟三:同實施例1。
[0022]對照實驗:
步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為--溫度28°C，搖床培養108h，得種子液；
步驟二:將步驟一制得種子液按10~15%的體積比接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發酵培養120h，得到桑黃菌絲體和發酵液；
步驟三:同實施例1。
[0023]不同脫落酸濃度對發酵菌絲體漆酶產量及發酵周期的影響作用的對比如下表
麗每酸濃度I培養時間(h) I桑黃菌絲體產量(g/L)
對照為 O 120_22.50_
實施例1 一 9628.39
實施例2 ~9229.13
實施例 3 1108\29.13—所述的實施例一、實施例二、實施例三和對照試驗中所采用的種子發酵培養基為常規的培養基，其原料組成可以為:2%葡萄糖，0.4%蛋白胨，0.1% KH2P04,0.05% MgS04, VBllOmg/100mL, pH6.5。
[0024]所述的實施例一、實施例二、實施例三和對照試驗中所采用的液體發酵培養基為常規的培養基，其原料組成可以為:玉米粉1.5%、麩皮1.2%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏
0.5%、KH2P040 .l%、MgS040.05%、維生素 BI 10 mg/L。
【權利要求】
1.一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其特征在于:所述的發酵方法包括以下步驟: 步驟一:將桑黃菌種接種到液體培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數的13%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，得種子液； 步驟二:將步驟一制得種子液按體積百分比為10~15%的接種量接種于液體發酵培養基中，在溫度27~30°C的條件下，液體發酵培養24~36h，然后加入脫落酸溶液，然后繼續培養56~72h，得到桑黃菌絲體和發酵液的混合液； 步驟三:將步驟二得到的桑黃菌絲體和發酵液的混合液通過板框壓濾機壓濾，然后將濾餅在70~80°C的溫度下烘干，將濾液通過真空濃縮后在噴霧干燥機進行噴霧干燥成干粉，把兩者混合既得桑黃發酵菌絲體。
2.根據權利要求1所述的一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其特征在于:所述的種子培養條件為--溫度28°C，搖床培養108h。
3.根據權利要求1或2所述的一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其特征在于:所述的脫落酸溶液的濃度為0.5~1.5ppm/L ;脫落酸的濃度為步驟二中整個溶液濃度。
4.根據權利要求3所述的一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其特征在于:所述的液體培養基為常規綜合Pda液體培養基。
5.根據權利要求4所述的一種提高桑黃發酵菌絲體產量的液體發酵方法，其特征在于:所述的真空濃縮的真空度0.09~0.1MPa,噴霧干燥工藝的入口溫度136~141°C，出口溫度81~82°C，蠕泵轉速8r/min，風機轉速906r/min，工作壓力0.23~0.24 MPa。
【文檔編號】C12R1/645GK103820333SQ201410084714
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】雷萍, 吳亞召, 張文雋, 安軍民, 陳旭, 呂德平 申請人:陜西省微生物研究所