一種利用亞麻刺盤孢霉靜息細胞高效催化去氫表雄酮的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用亞麻刺盤孢（Colletotrichumlinli）ST-1的靜息細胞高效轉化去氫表雄酮的方法。本發明將靜息細胞轉化及底物助溶相結合，在提高底物利用率的同時也提高了產物得率。磷酸鈉緩沖液為轉化反應提供了穩定的pH環境，吐溫80助溶的同時又可促進菌體的生長，利用新的轉化工藝，產物摩爾得率較傳統轉化方法提高了78.3%，產物的轉化率也從傳統方法的67.3%提高到了90.4%。
【專利說明】一種利用亞麻刺盤孢霉靜息細胞高效催化去氫表雄酮的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種新的利用亞麻刺盤孢霉{Colletotrichum Iini ) 5T-7靜息細胞高效催化去氫表雄酮的方法。
【背景技術】
[0002]三羥基雄甾烯酮(7 α，15 a -diOH-DHEA)是合成新型口服避孕藥屈螺酮的重要前體，傳統的化學合成方法，步驟繁雜，工藝復雜，且大量有機溶劑的使用也給環境帶來了很大的污染。現在通過微生物法催化底物去氫表雄酮(DHEA)就可以一步得到目的產物三羥基雄甾烯酮。簡化了反應步驟，同時也減少了有機溶劑的使用。
[0003]但是現有的菌株對底物的轉化也存在一定的局限。首先，原始菌株對底物的轉化能力較差，并且轉化過程存在較多的副產物；其次，去氫表雄酮是疏水性的白色粉末，其在水中的溶解度極低，所以大大限制了轉化時底物的投料濃度和底物的轉化率。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有三羥基雄留烯酮生產過程中的技術難點及存在的問題，對現有的轉化工藝進行改良，希望可以提高底物的利用率，節約生產成本。本發明所述的亞麻刺盤孢霉Iini ) 5T-7保藏在位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6051，分類命名為亞麻刺盤孢霉{CoIletotrichum Iini )，保藏日期為2012年4月24日。
[0005]具體的步驟如下:
I)靜息細胞的制備
從斜面挑取適量菌絲接種至種子培養基中(250mL的錐形瓶裝液量為30mL)，在30°C，220rpm的條件下，搖床培養72 h，，然后按8 %_10 % V/V的接種量轉接至新的種子培養基中(500mL的錐形瓶裝液量為IOOmL)同上述搖床培養條件，繼續培養24 h得到均勻的二級種子，再將二級種子按8 %-10 % V/V的接種量轉接至發酵培養基相同搖床條件培養24 h，此時菌體處于對數生長期，離心，菌體用等體積PH 7.0的濃度為0.01M的磷酸鈉緩沖液洗滌2遍(以除去發酵液中的其余成分)，收集菌體，重新懸浮于PH5.5-7.5的磷酸鈉緩沖液中，緩沖液濃度為0.02-0.2 M，制備成細胞濃度為10-12 g/L的靜息細胞懸液，待轉化使用。
[0006]2)靜息細胞轉化
取適量(I)中所述的靜息細胞懸液，投加底物，底物終濃度為10 g/L，同時添加I %-2%的吐溫80作為助溶劑(吐溫80對底物進行預溶后投料，轉化效果一樣)，30 0C >220 r/min的搖床條件下轉化36 ho
[0007]3)生長細胞轉化
將步驟(1)中制備好的細胞液體培養物以8 %-10 %(w/w)的接種量接入發酵培養基，裝液量30mL/ 250mL，于30°C，220 r/min的轉速下培養24 h后，投加底物去氫表雄酮(DHEA)300 mg, 30 °C >220 r/min的搖床條件下繼續轉化36 h。
[0008]4)產物的檢測
均勻取ImL步驟(2/3)中轉化液用800 μ L的乙酸乙酯進行萃取(可適當利用超聲和震蕩來提高萃取效率)，然后12000 r/min下離心2min，吸取上清液，如此反復萃取5遍，收集上清液，烘干，用8倍體積乙腈復溶，后用0.22 μ m的有機膜過濾除雜，最后采用HPLC的方法檢測轉化結果。高效液相色譜(Agilent TC-C18,4.6X250 mm, 5 μ m)的檢測條件，流動相:乙腈:水(7:3);柱溫30 V ;檢測波長206 nm;流速0.5 mL/min ;進樣量10 μ L。
[0009]其中
步驟(1)中所述的固體培養基的成分及配比為:土豆200 g/L;葡萄糖20 g/L;瓊脂20g/L ；pH自然,補充蒸懼水至I L,自然pH, 121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；
步驟(1)所述種子培養基 的成分及配比為:葡萄糖15 g/L;酵母粉15 g/L;玉米漿3 g/L ;豆餅粉10 g/L;補充蒸懼水至I L,自然pH, 121 °C下高壓蒸汽滅菌20min ；
步驟(1)所述發酵培養基的成分及配比為:葡萄糖15 g/L;酵母粉15 g/L;玉米漿3 g/L ;自然pH, 121°C高壓蒸汽下滅菌20 min。
[0010]本發明所述的利用亞麻刺盤孢霉(PoIletotrichum Iini ) ST-1靜息細胞轉化高效轉化去氫表雄酮的方法，包括靜息細胞的制備及其轉化條件優化。在靜息細胞轉化過程中，除添加2 %的吐溫80以外，無需添加其他輔底物，實驗發現吐溫80在轉化過程中不僅可以用作助溶劑也可以代替葡萄糖用作碳源促進菌體生長。此法可以顯著提高底物的利用率和產物得率，同時也降低了副產物的量，便于后續產物分離提取，此方法對留體生物轉化方面的研究具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明的添加2 % (w/v)吐溫80對亞麻刺盤孢霉ijOolletotrichum Iini)ST-1靜息細胞生長曲線的影響
【有益效果】
靜息細胞轉化體系營養單一，可避免雜菌生長；磷酸鹽的緩沖體系可調節pH，轉化過程酶活比較穩定，保證了良好的轉化能力；吐溫80不僅具有良好的底物助溶能力并且可以促進菌體生長，整個轉化過程底物的利用率和產物得率都有了明顯提高，且副產物的量也降低了。
【具體實施方式】
[0012]實施例1亞麻刺盤孢) ST-1生長細胞轉化與靜息細胞轉化比較
(I)制備亞麻刺盤孢的細胞液體培養物
挑取適量斜面培養基上的亞麻刺盤孢菌絲，接種于裝有30 mL種子培養基的250 mL錐形瓶中，30°C下，置于搖床上以220 r/min的轉速培養72 h進行活化，然后將一級種子以(8%-10% V/V)的接種量接入新的種子培養基(裝有100 mL種子培養基的500 mL錐形瓶中)同上搖床條件進行擴增培養24 h，得到相當濃度的細胞液體培養物。
[0013](2)制備亞麻刺盤孢的靜息細胞懸液將步驟(1)中制備好的細胞液體培養物以10 % (w/w)的接種量接入發酵培養基，裝液量100 mL/ 500mL，于30°C，220 r/min的轉速下培養24 h，離心收集菌體，用pH 7.0的濃度為0.01M的磷酸鈉緩沖液洗滌菌體2遍(除去發酵液中的其余成分)，收集菌體，懸浮于PH 6.5的磷酸鈉緩沖液中，緩沖液濃度為0.2M，制備成細胞濃度為10-12 g/L的靜息細胞懸液，待轉化使用。
[0014](3)靜息細胞轉化
取(2)中的靜息細胞懸液30 mL裝于250mL錐形瓶中，投加底物去氫表雄酮(DHEA)300mg, 30 °C >220 r/min的搖床條件下轉化36 h后,用HPLC的方法檢測底物的轉化情況。
[0015](4)生長細胞轉化
將步驟(1)中制備好的細胞液體培養物以10 % (w/w)的接種量接入發酵培養基，裝液量30mL/ 250mL，于30°C，220 r/min的轉速下培養24 h后，投加底物去氫表雄酮(DHEA)300 mg, 30 °C >220 r/min的搖床條件下繼續轉化36 h，用HPLC的方法檢測底物的轉化情況。
[0016]表1生長細胞與靜息細胞轉化情況比較
【權利要求】
1.一種利用亞麻刺盤孢ST-1靜息細胞高效轉化底物去氫表雄酮生產三羥基雄留烯酮的方法，其特征在于，底物投料時添加了 2 %的吐溫80，具體的步驟如下: 將生長至對數生長期的菌液離心，菌體用0.01M的磷酸鈉緩沖液洗滌2遍，收集洗滌過后的菌體懸浮于PH 6.5磷酸鈉緩沖液中，進行下一步的轉化實驗，轉化過程添加2 %的吐溫80。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述亞麻刺盤孢ST-1為本實驗室保藏的亞麻刺盤孢ST-1,該菌株命名為Colletotrichum Iinli,于2012年4月24日保藏在位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國科學研究院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6051。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靜息細胞為非固定化細胞，并且用0.01M的磷酸鈉緩沖液洗滌過2遍，除去了原有的培養基成分。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，利用新的優化后的轉化工藝，產物摩爾得率較傳統轉化方法提高了 78.3 %，底物的轉化率也從傳統方法的67.3 %提高到了 90.4 %。
【文檔編號】C12R1/645GK103911418SQ201410094309
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】許正宏, 史勁松, 李會, 張汝金, 尹思淇 申請人:江南大學