一種豬NF-κappaBC-Rel亞基真核表達載體的構建的制作方法
【專利摘要】本發明提出了一種豬NF-κappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構建，其構建方法為：首先，根據C-Rel基因，設計了一對特異性引物P1、P2，用重組PCR的方法擴增出目的基因，使其兩段分別帶上EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點，把目的片段和載體雙酶切后用SolutionI進行連接反應，再把重組質粒轉化入DH5a大腸桿菌，建立PMD19-T-C-Rel重組質粒。其次，把重組質粒和pcDNA3.1(+)載體雙酶切后用SolutionI進行連接反應，再把重組質粒轉化入DH5a大腸桿菌最后，分別采用了PCR法，雙酶切法和測序法三種方法進行篩選和鑒定陽性菌落。測序結果顯示重組質粒序列與GenBank中的目的片段序列一致。證明目的基因已經插入pcDNA3.1(+)載體，重組質粒構建成功。
【專利說明】—種豬NF-K appaBC-Rel亞基真核表達載體的構建
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種真核表達載體的構建，特別是涉及一種豬NF-K appaBC-Rel亞基真核表達載體的構建。
【背景技術】
[0002]細胞核轉錄因子-kB(Nucleartranscriptionfactor-κ: appaB, NF-K: B)是一類能結合多種基因啟動子區的固定核苷酸序列并啟動基因轉錄功能的蛋白，通過調節細胞因子，趨化、生長因子，黏附分子及多種酶的基因表達，參與機體免疫調節和炎癥反應，它是細胞核內重要的轉錄調節因子，是細胞存活、細胞周期、細胞黏附和遷移的重要調節者。NF-κ B 是由 NF-κ B/Rel 蛋白家族的 5 個成員，包括 NF-κ BI (P50/P105)、NF- κ Β2 (Ρ52/Ρ100)、RelA(P65)、RelB和C-Rel以同源或異源二聚體形式組成的，即為不同的轉錄因子，發揮不同的轉錄激活特性。其中P50和P65亞基在細胞中廣泛存在，RelB僅在胸腺和淋巴結中表達，而C-Rel只在造血細胞和淋巴細胞中表達；目前已知的異源二聚體有P50/P65，p50/C-Rel，P65/C-Rel，其中最常見的是由P50與P65形成的P50/P65異源二聚體。在靜息狀態時，NF-κ B通常與其抑制物I κ B結合形成無活性的三聚體形式存在于細胞漿，當細胞受到細胞外信號刺激時，通過一個或多個信號轉導途徑，NF-κΒ與IkB解離，迅速發生核易位，形成有活性的NF-κ B，發揮其功能。在P50/P65活化的過程中，P50亞基用于與κΒ序列結合，而Ρ65亞基有兩個重要功能，即利用其C端的反式激活域增強靶基因的轉錄激活及與各種I κ B成員直接耦聯。
[0003]近年來，NF- KB被作為作用靶點治療或緩解多種人類自身免疫系統性疾病的一大研究熱點，因此構建一種NF- κ BC-Rel亞基的真核表達載體，以期為進一步C-Rel在多種免疫抑制性疾病感染機制中的作用的研究奠定基礎就顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004]為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種豬NF- KappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構建，為研究C-Rel基因在多種免疫抑制性疾病感染機制中的作用提供一個有效的工具。
[0005]為了實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0006]一種豬NF- KappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構建，所述載體為pcDNA3.1-C-Rel重組載體，該重組載體是通過以下方法構建獲得的:
[0007]步驟一、PMD19-T-C-Rel重組質粒的構建:采集豬前腔靜脈血，分離出淋巴細胞獲得cDNA，再用引物P1、P2擴增出C-Rel目的片段，構建PMD19-T_C-Rel重組質粒；
[0008]步驟二、C-Rel基因轉錄片段的獲得:以PMD19-T-C_Rel重組質粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，將酶切的目的片段用膠回收試劑盒回收，用于連接反應；
[0009] 步驟三、pcDNA3.1 (+)質粒的酶切:以pcDNA3.1 (+)質粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，酶切產物經1%的瓊脂凝膠電泳后，膠回收試劑盒進行大片段回收，-200C保存備用；
[0010]步驟四、連接反應:C_Rel基因片段和PCDNA3.1 (+)載體片段按3:1摩爾比例，在連接酶的作用下，置于4°C反應過夜；
[0011]步驟五、將連接產物轉化入DH5a感受態細胞，即:取連接產物IOul加入200ulDH5a感受態細胞，冰浴30min，42°C 90s,再冰浴5min，加入1mlLB液體培養基，37°C震蕩培養60min，取200ul菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上，37°C培養12-18h ；
[0012]步驟六、挑選單個疑似菌落用EcoR I和Xho I進行雙酶切鑒定，將初步鑒定陽性的pcDNA3.1-C-Rel重組質粒進行測序，比較重組質粒序列與GenBank中的目的片段序列的
一致性。
[0013]進一步的，上述載體構建步驟一中，針對C-Rel基因的特異性引物為:
[0014]Pl:
[0015]5’ -GAATTCGCCACCATGGGACACTATTCACAACGTGGGTATAAC-3’ ；
[0016]P2:
[0017]5，-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAAAACTCAAATGCAA-3，。
[0018]相對于現有技術，本發明的有益效果為:本發明提供一種豬NF-κ appaBC-Rel亞基的真核表達載體，為研究C-Rel基因在多種免疫抑制性疾病感染機制中的作用提供一個有效的工具。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為PCR鑒定C-Rel基因真核表達目的產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020]圖中M 為 DL2000Marker ; I 為 PCR 產物。
[0021]圖2為PMD19-T-C_Rel雙酶切產物。
[0022]圖3為pCDNA3.1 (+) -C-Rel雙酶切鑒定結果。圖中M為DLMarkerIII ；1為PCDNA3.1 (+)-C-Rel質粒電泳結果；2為pCDNA3.1 (+)-C-Rel質粒雙酶切鑒定結果。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明方案做進一步詳細描述:
[0024]試驗例:
[0025]一、實驗材料
[0026]1.試驗菌株、細胞及質粒
[0027]E.coliDH5 a、pMD19_T、pDNA3.1 ( + )真核表達載體由四川農業大學動物生物技術中心保存；豬前腔靜脈血；
[0028]2.相關試劑
[0029]2 X TaqPCRMasterMix,限制性內切酶、EcoR1、XhoI，pMD19-TSimpleVector,Marker III, DL2000 ,質粒pcDNA3.1(+)購自Invitrogen ;瓊脂糖、溴化乙錠等購自Sigma公司；DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；
[0030]二、實驗方法
[0031](一)引物設計與合成[0032]以C-Rel為模板，設計并合成特異性引物P1、P2擴增C-Rel基因，跨度1803bp，Pl引入GCCACC序列及酶切位點EcoR I，P2引入CTCGAG序列及酶切位點Xho I，引物為:
[0033]Pl:5，-GAATTCGCCACCATGGGACACTATTCACAACGTGGGTATAAC-3，
[0034]P2:5，-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAAAACTCAAATGCAA-3，
[0035]( 二)C-Rel-基因片段的克隆及測序
[0036]1.豬外周血淋巴細胞的分離及cDNA的合成[0037]前腔靜脈采集豬血5mL，加入5mLCMF輕輕混勻，避光沿管壁將稀釋血液緩慢加入到等體積的淋巴細胞分離液表面，2000r/min，離心20min，取中間淋巴細胞層于另一離心管中，加入5mL生理鹽水重懸洗滌，2000r/min，離心10min，棄上清，重復洗滌I次后用含10%胎牛血清的1640按1.5X 106/mL重懸淋巴細胞轉至細胞瓶，添加終濃度為7g/mL刀豆蛋白ConA,置5%C02培養箱37°C誘導培養，24h后收集細胞沉淀。
[0038]加入ImLRNAi sopIus吹打混勻，靜置5min后加入200 μ L氯仿充分混勻，靜置5min, 12000r/min,離心5min ;取上清，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置15min,13000r/min, 15min ;棄上清,加入ImL冰乙醇,室溫靜置5min, 12000r/min,離心5min ;棄上清，用滅菌濾紙條吸干液體，室溫放置5min，待無酒精味后；加入20 μ LRNase-freeffater溶解RNA，獲得RNA在_20°C下保存備用。
[0039]2.獲得的RNA反轉錄
[0040](I)反轉錄體系IOul:
[0041 ] 5XPrimerScriptBuffer2ul
[0042]PrimerScriptRT-EnzymeMixI0.5ul
[0043]OligodT0.5ul
[0044]Randomprimer0.5ul
[0045]RNA3ul
[0046]H203.5ul
[0047](2)反轉錄條件:
[0048]37 °C25ul
[0049]85 °C5ul
[0050]4 °C①
[0051 ] (3)所得cDNA在-40V下保存備用.[0052]3.以cDNA為模板，進行PCR反應，分別獲得C-Rel片段。
[0053](I)PCR反應體系都是50 μ 1:
[0054]cDNA2 μ I
[0055]PrimeSTARMaxPremix(2Χ) 25 μ I
[0056]上下游引物(lOpmol/μI)各 I μ I
[0057]ddH2021 μ I
[0058](2)反應條件:
[0059]預變性98°C 5min
[0060]變性98OlOs[0061 ]退火 56°C 15s[0062]延伸72°C35s to2 35 個循環
[0063]孵育72 °C 5min
[0064]4 °Coo
[0065]4.PCR擴增產物的電泳檢測
[0066]取5ul的產物上樣于1%瓊脂糖凝膠，同時在另一上樣孔加3ulDL2000Marker作為對照，電泳完成后，在凝膠成像系統上觀察，目的產物如圖1所示，若無雜條帶，且擴增大小與預期相符，則用于回收和測序。
[0067]5.PCR擴增片段的純化
[0068](I)將含目的片段C-Rel的瓊脂糖塊切下，放入EP管中。
[0069](2)按每IOOmg瓊脂糖加入400_600ul的比例加入SI液，置于65°C水浴至膠完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次。
[0070](3)將獲得的DNA溶膠液全部轉移至一個干凈的HiBindDNAMini柱子中，室溫下
10,OOOxg離心I分鐘.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內。
[0071](4)移 300ulBindingBuffer (XP2)至柱子中,室溫下,10, OOOxg 下離心 Imin0
[0072](5)棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內.移700ulSPffffashbuffer (已用無水乙醇稀釋的)至柱子中，室溫下10，OOOxg離心lmin。
[0073](6)重復用7001113?驟3811131^€61'洗漆柱子.室溫下10，OOOxg離心lmin。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內.室溫下，13，OOOxg離心2min以甩干柱子基質殘余的液體。
[0074](7)把柱子裝在一個干凈的EP管上，加入15~30ul (具體取決于預期的終產物濃度)的ElutionBuffer到柱基質中央，室溫放置lmin, 13, OOOxg離心Imin以洗脫DNA。貯存于-20°C備用。
[0075]6.PCR回收產物與T載體的連接
[0076]連接體系如下:
[0077]
【權利要求】
1.一種豬NF-KappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構建，其特征在于，所述載體為pcDNA3.1-C-Rel重組載體，該重組載體是通過以下方法構建獲得的: 步驟一、PMD19-T-C-Rel重組質粒的構建:采集豬前腔靜脈血，分離出淋巴細胞獲得cDNA，再用引物P1、P2擴增出C-Rel目的片段，構建PMD19-T_C-Rel重組質粒； 步驟二、C-Rel基因轉錄片段的獲得:以PMD19-T-C-Rel重組質粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，將酶切的目的片段用膠回收試劑盒回收，用于連接反應； 步驟三、pcDNA3.1 (+)質粒的酶切:以pcDNA3.1 (+)質粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，酶切產物經1%的瓊脂凝膠電泳后，膠回收試劑盒進行大片段回收，-20°C保存備用； 步驟四、連接反應=C-Rel基因片段和pcDNA3.1(+)載體片段按3:1摩爾比例，在連接酶的作用下，置于4°C反應過夜； 步驟五、將連接產物轉化入DH5a感受態細胞，即:取連接產物IOul加入200ulDH5a感受態細胞，冰浴30min，42°C 90s,再冰浴5min，加入1mlLB液體培養基，37 °C震蕩培養60min，取200ul菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上，37°C培養12_18h ； 步驟六、挑選單個疑似菌落用EcoR I和Xho I進行雙酶切鑒定，將初步鑒定陽性的pcDNA3.1-C-Rel重組質粒進行測序，比較重組質粒序列與GenBank中的目的片段序列的一致性。
2.如權利要求1所述的載體的構建方法，其特征在于，該載體構建步驟一中，針對C-Rel基因的特異性 引物為:
【文檔編號】C12N15/79GK103882049SQ201410124019
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2014年3月28日
【發明者】徐志文, 朱玲, 付夢謹 申請人:四川農業大學