本發明屬于藥物技術領域，涉及次甲基青蒿素的一種新應用，尤其涉及次甲基青蒿素在制備治療肝病藥物中的應用。
背景技術：
肝臟疾病作為人類最常見的疾病之一，對人類健康造成巨大威脅，其防治是現代醫學的重大課題。隨著人們生活水平的提高，飲食結構發生了很大的變化，酒精和脂肪的攝入量增加，酒精性肝損傷的發病率呈上升趨勢。酒精主要是在肝臟代謝，過度飲酒會引起肝細胞損傷，嚴重時，可導致肝細胞壞死。酒精性肝損傷也是常見的致肝硬化的原因之一。目前我國有超過700萬的肝硬化患者，而且患病人數不斷增多。2015至2030年間，中國將有約1000萬人因與慢性肝炎相關的肝硬化和肝癌死亡。面對如此嚴峻的形勢，及時對疾病進行干預，遏制肝炎向肝硬變發展的病理過程，研制新的藥物，使之在預防和治療的環節發揮關鍵作用，具有重要意義。因此，開發安全有效的治療肝病的藥物有著積極的意義。
次甲基青蒿素是從菊科艾屬植物黃花蒿葉中提取分離得到的一種具有過氧橋的倍半萜內酯類化合物，其分子式為c15h20o5，結構式為
次甲基青蒿素是青蒿素結構中臨近羰基的甲基(9位)脫氫后轉化的成分，在黃花蒿中與青蒿素同時存在。其中，山東省中醫藥研究所在青蒿素生產工藝研究中，除了獲得青蒿素和大量的青蒿酸等成分外，還得到了次甲基青蒿素成分，開辟了青蒿素和次甲基青蒿素制備工藝新途徑,申報了國家發明專利《青蒿素及次甲基青蒿素的提取方法》，并于1995年8月獲得國家發明專利授權(專利號：zl89103384.x)，為國內首次申請次甲基青蒿素的提取制備方法。目前，青蒿素及其衍生物作為高效低毒的抗瘧疾藥己經得到了全世界的公認。現有文獻及技術資料中，并未有實驗數據證明次甲基青蒿素具有預防和治療肝病的藥理活性。
技術實現要素：
本發明提供了次甲基青蒿素的一種新應用，具體地，為次甲基青蒿素在制備治療肝病藥物中的應用，次甲基青蒿素的化學結構式為
進一步地，次甲基青蒿素與藥用載體組合為藥物制劑。
進一步地，藥物制劑包括滴丸劑、片劑、散劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、微囊劑、糖漿劑或口服溶液劑。
本發明所提供的應用的有益效果體現在：
本發明根據一系列實驗發現次甲基青蒿素可降低肝病患者的血清alt、ast和肝指數，提高肝臟功能，有效緩解酒精肝和肝炎造成的肝損傷；還可以明顯降低患者的ha、pcⅲ、ⅳ-c含量，具有明顯的抗肝硬化效果。因此，次甲基青蒿素具有預防和治療酒精性肝損傷、急性肝損傷和肝硬化的作用，故提供了次甲基青蒿素在制備預防和治療肝病藥物中的應用。本發明拓展了次甲基青蒿素的臨床應用范圍，為酒精性肝損傷、急性肝損傷和肝硬化等肝病治療發現了新的藥物來源，也有利于次甲基青蒿素的充分利用。
應當理解的是，以上的一般描述和后文的細節描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本發明。
具體實施方式
下面結合實驗數據及實施例，對本發明所提供的次甲基青蒿素在制備治療肝病藥物中的應用進行清除、完整地描述。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
以下實施例中的次甲基青蒿素均使用專利號為zl89103384.x的專利中所述的制備方法制備得到。
實施例一
次甲基青蒿素滴丸劑的制備
取次甲基青蒿素25g與聚乙二醇400055g混合,于80℃水浴中加熱熔融，80℃恒溫攪拌60min使得分散均勻，將藥液迅速轉移至75℃恒溫儲料管中。滴頭口徑為3.8/5.0mm，滴速控制在每分鐘60滴，二甲基硅油為冷卻劑，冷卻液溫度控制在10℃，調節滴丸丸重為80mg，滴制成丸，將滴丸表面上的冷卻液除去，并包薄膜衣，制作1000粒滴丸，分裝即得。口服適用于酒精性和肝炎引起的肝硬化患者。每次1-3粒，一日2-3次，30天為一療程，可連續使用2-3療程。
實施例二
次甲基青蒿素片劑的制備
取次甲基青蒿素50g、微晶纖維素450g、starch1500100g、硬脂酸鎂10g，過60目篩混勻后，用75％乙醇為粘合劑制軟材，24目篩制粒于60℃干燥，24目篩整粒，加入處方量硬脂酸鎂混勻，壓1000片，分裝即得，每片含次甲基青蒿素50mg。口服，適用于酒精性和肝炎引起的肝硬化患者。每次1-2片，一日2-3次，30天為一療程，可連續使用2-3療程。
實施例三
次甲基青蒿素糖漿劑的制備
取次甲基青蒿素10g溶于80ml乙醇、40ml丙二醇溶液中，再加入桔子香精0.5ml、苯甲酸鈉3.0g、純化水220ml、阿斯巴甜1g，加熱攪拌10min(溫度45℃左右)，放冷，加單糖漿適量調整至1000ml，混勻，分裝，每瓶100ml。口服，適用于酒精性和肝炎所引起的肝硬化患者。每次5-10ml，一日1-2次，30天為一療程，可連續使用2-3療程。
其他藥物制劑，如散劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、微囊劑或口服溶液劑等，均可按常規方法進行。
以下通過藥效實驗進一步說明本發明實施例所提供的次甲基青蒿素在制備治療肝病藥物中的應用，但不用來限制本發明。
實驗一次甲基青蒿素對酒精所致大鼠肝損傷的實驗
1實驗方法
1.1建模、分組及給藥
取豬油50g、膽固醇10g、膽酸鈉3.3g、丙硫氧嘧啶0.2g、丙二醇15ml、吐溫-80適量和蒸餾水20ml，配制成均勻乳劑；取上述乳劑與白酒44度(v/v)按體積比3：2混勻，形成白色乳液即為酒脂乳劑。
將40只大鼠(spf級，雄性，體重200-250g，山東大學實驗動物中心提供，許可證號scxk(魯)20090001)隨機分成4組，每組10只，分為正常對照組、模型對照組、次甲基青蒿素低劑量組和次甲基青蒿素高劑量組。正常對照組灌胃給予0.7％羚甲基纖維素鈉溶液10ml/kg，其余3組給予酒脂乳劑10ml/kg，連續灌胃8周。次甲基青蒿素低劑量組和次甲基青蒿素高劑量組造模的同時給予次甲基青蒿素(山東省中醫藥研究院山東省中藥新型制劑中心提供)干預，給藥劑量為次甲基青蒿素高劑量組、次甲基青蒿素低劑量組分別給予100mg/kg、50mg/kg。
1.2標本采集及指標測定
末次灌胃后禁食15h。大鼠稱重，10％水合氯醛溶液以3ml/kg腹腔注射麻醉,頸動脈取血，室溫充分凝固后，3000r/min離心15min，得血清，使用試劑盒檢測血清的甘油三酯(triglyceride,tg)、谷草轉氨酶(aspartatetransaminase，ast)和谷丙轉氨酶(alanineaminotransferase，alt)指標。取血后摘取肝臟，在冷生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱重，計算肝指數，肝指數(％)＝肝重量(g)/體重量(g)x100％。取肝左葉，在冷生理鹽水中漂洗干凈，與生理鹽水制成100g/l的肝組織勻漿，使用試劑盒檢測肝組織勻漿的超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)和丙二醛(malondialdehyde，mda)指標。取肝右葉用100g/l甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(he)染色，光鏡下觀察病理改變。
1.3數據處理
所有實驗數據均采用spss11.5軟件進行處理,數據用x±s表示，各組均數間比較采用單因素方差分析。
2實驗結果
2.1一般情況觀察
正常對照組大鼠皮毛光澤，行動靈活。模型對照組大鼠皮毛發黃、黯淡、不整，體重較正常組增加緩慢，酒脂乳劑灌胃后有醉酒現象，對外界刺激反應遲鈍。次甲基青蒿素高劑量組和次甲基青蒿素低劑量組大鼠一般情況較好。
2.2次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型肝指數的影響
參見下表1.1，與正常對照組比較，模型對照組肝指數明顯升高(p<0.01)，初步判斷是由于肝臟病變，病變可能為增生、充血、水腫等，導致肝指數明顯升高。與模型對照組比較，次甲基青蒿素低劑量組和次甲基青蒿素高劑量組的肝指數明顯降低(p<0.05)，其中以次甲基青蒿素高劑量組尤為明顯，初步判斷次甲基青蒿素對肝臟病變具有緩解治療功能。
表1.1次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型肝指數的影響
注：與正常對照組比較，*p<0.01；與模型對照組比較，**p<0.05。
2.3次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型血清tg、alt和ast的影響
alt和ast都是反映肝實際損傷最常用的指標，1％的肝細胞發生壞死時，血清alt水平即可升高1倍。ast數值超過alt往往提示肝實質損害嚴重，是慢性化程度加重的標志。參見表1.2，為與正常對照組比較,模型對照組tg、alt、ast明顯升高(p<0.01)，說明肝損傷嚴重。與模型對照組比較，次甲基青蒿素低劑量組和次甲基青蒿素高劑量組tg、alt、ast有顯著性降低(p<0.01)，說明次甲基青蒿素對肝損傷有所緩解，可治療肝損傷。
表1.2次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型血清tg、alt和ast的影響
注：與正常對照組比較，*p<0.01；與模型對照組比較，**p<0.01。
2.4次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型肝組織勻漿sod、mda的影響
sod和mda都是反映肝組織抗氧化指標的參數。參見表1.3，與正常對照組比較，模型對照組sod明顯降低(p<0.01)，mda明顯升高(p<0.01)，說明肝組織抗氧化能力降低。與模型對照組比較，次甲基青蒿素低劑量組和次甲基青蒿素高劑量組的sod明顯升高(p<0.01)，mda明顯降低(p<0.01)，說明次甲基青蒿素對肝組織抗氧化能力有緩解和治療作用。
表1.3次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型肝組織勻漿sod、mda的影響
注：與正常對照組比較，*p<0.01；與模型對照組比較，**p<0.01。
4.5次甲基青蒿素對大鼠酒精性肝損傷模型肝臟外觀及組織學變化的影響
正常肝臟呈紅褐色，邊緣銳利，質地柔軟，模型對照組肝臟明顯增大，邊緣鈍而厚，表面色澤灰黃，切面呈淡黃色。次甲基青蒿素低、高劑量組肝臟顏色黯紅，明顯比模型對照組深，其中以次甲基青蒿素高劑量組肝臟形態更為接近正常對照組。
病理切片觀察，正常大鼠肝小葉結構清晰,肝細胞索以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列,肝竇正常,胞核結構清晰。大鼠肝損傷模型組，肝小葉界限不清,肝細胞索紊亂,肝竇變窄,肝細胞出現散在和片狀氣球樣變,可見點狀壞死和炎細胞浸潤，胞核粉染,胞漿呈顆粒狀，病變以中央靜脈周圍為明顯。次甲基青蒿素低劑量組和次甲基青蒿素高劑量組對肝損傷有不同程度改善，炎細胞數目減少，胞漿內脂滴減少或消失，胞漿較豐富，肝索排列較整齊，尤以次甲基青蒿素高劑量組改善最為明顯。
3實驗結論
本實驗以大鼠酒精性肝損傷模型為研究對象，對次甲基青蒿素抗酒精肝的作用進行研究。綜上，次甲基青蒿素對酒精性肝損傷具有較好的預防和治療作用。
實驗二次甲基青蒿素對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的實驗
1實驗方法
1.1建模、分組及給藥
將48只小鼠(spf級，雌雄各半，體重18-20g，山東大學實驗動物中心提供，許可證號scxk(魯)2013001)隨機分成6組，每組8只，分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、次甲基青蒿素低劑量組、次甲基青蒿素中劑量組和次甲基青蒿素高劑量組。陽性對照組灌胃給予200mg/kg的聯苯雙酯，次甲基青蒿素低劑量組、次甲基青蒿素中劑量組和次甲基青蒿素高劑量組灌胃分別給予10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg的次甲基青蒿素(山東省中醫藥研究院山東省中藥新型制劑中心提供)，正常對照組和模型對照組灌胃均給予等體積的10ml/kg的生理鹽水。以上六組給藥1次/d，連續10d。末次給藥后，除正常對照組外，其他五組的每只小鼠的鼠腹腔注射6ml/kg花生油配制的5％ccl4溶液。摘眼球取血后處死小鼠，迅速取出肝臟備檢。
1.2標本采集及指標測定
小鼠稱重，10％水合氯醛溶液以3ml/kg腹腔注射麻醉,頸動脈取血，室溫充分凝固后，4℃下3500r/min離心10min，得血清，使用試劑盒檢測血清的ast和alt指標。取血后摘取肝臟，在4℃的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱重，計算肝指數。取小鼠右葉相同位置肝組織，用4℃生理鹽水沖洗后，濾紙拭干，以10％中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，he染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理變化。
1.3數據處理
所有實驗數據均采用spss11.5軟件進行處理,數據用x±s表示，各組均數間比較采用單因素方差分析。
2實驗結果
2.1次甲基青蒿素對小鼠ccl4急性肝損傷模型肝指數的影響
參見下表2.1，實驗結果表明，模型對照組的肝指數較正常對照組顯著增加(p＜0.05)，表明ccl4引起小鼠肝臟明顯腫大。與模型對照組比較，陽性對照組、次甲基青蒿素低劑量組、次甲基青蒿素中劑量組和次甲基青蒿素高劑量組的小鼠肝指數均顯著降低(p＜0.05)。次甲基青蒿素各劑量組與陽性對照組比較，肝臟指數均無顯著性差異。
表2.1次甲基青蒿素對小鼠ccl4急性肝損傷模型肝指數的影響
注：與模型對照組比較，*p＜0.05。
2.2次甲基青蒿素對小鼠ccl4急性肝損傷模型肝功能的影響
參見下表2.2，實驗結果表明，模型對照組較正常對照組血清alt和ast顯著升高(p＜0.05)，說明ccl4致小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組比較，陽性對照組、次甲基青蒿素中劑量組和次甲基青蒿素高劑量組均能顯著降低ccl4所引起的alt和ast的升高(p＜0.05或p＜0.01)，次甲基青蒿素低劑量組對ccl4所引起的alt和ast的升高無顯著影響。
表2.2次甲基青蒿素對小鼠ccl4急性肝損傷模型血清alt和ast的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01
2.3次甲基青蒿素對小鼠ccl4急性肝損傷模型肝臟外觀及組織學變化的影響
顯微鏡下觀察正常對照組小鼠肝小葉結構完整，肝索呈放射狀排列，清晰可辨，肝細胞結構和形態正常，排列整齊，未見肝細胞壞死、變性等病理改變。模型對照組小鼠肝小葉結構破壞，索狀排列紊亂，肝細胞呈不同程度腫脹壞死、變性，胞漿疏松透亮，部分細胞核固縮溶解，大量炎細胞浸潤。陽性對照組肝細胞壞死減輕，細胞排列較為整齊。次甲基青蒿素高、中劑量組肝小葉破壞程度和肝細胞水腫程度明顯減輕，肝細胞排列較整齊，損傷程度較輕；次甲基青蒿素低劑量組與模型組比較，肝細胞的損傷程度有輕度改善。
3實驗結論
本實驗首次以小鼠ccl4急性肝損傷模型為研究對象，對次甲基青蒿素抗急性肝損傷的作用進行研究。實驗結果表明，模型對照組肝組織破壞嚴重，血清alt、ast顯著升高；次甲基青蒿素高、中劑量組小鼠肝細胞受損程度明顯減少，血清alt、ast顯著降低；次甲基青蒿素低劑量組小鼠肝細胞損傷程度有輕度改善，血清alt、ast也有一定程度降低。表明次甲基青蒿素具有保護肝細胞、對抗肝損傷的作用，且呈濃度依賴性。
綜上，次甲基青蒿素對小鼠ccl4急性肝損傷模型具有降低血清alt、ast，保護肝損傷的作用。為次甲基青蒿素急性肝損傷的研究提供了藥效學依據，并為對其進一步研究和開發奠定基礎。
實驗三次甲基青蒿素對四氯化碳所致大鼠肝硬化的實驗
1實驗方法
1.1建模、分組及給藥
將60只大鼠(spf級，雄性，體重200-250g，山東大學實驗動物中心提供，許可證號scxk(魯)20090001)隨機分成6組，每組10只，分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、次甲基青蒿素低劑量組、次甲基青蒿素中劑量組和次甲基青蒿素高劑量組。陽性對照組灌胃給予0.1mg/kg的秋水仙堿，次甲基青蒿素低劑量組、次甲基青蒿素中劑量組和次甲基青蒿素高劑量組灌胃分別給予50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg的次甲基青蒿素(山東省中醫藥研究院山東省中藥新型制劑中心提供)，正常對照組和模型對照組灌胃均給予等體積的10ml/kg的生理鹽水。正常對照組飼喂實驗鼠顆粒飼料，自由飲水，其余各組飼喂自制飼料，飲10％乙醇溶液。造模當日開始給藥。1次/d，連續6周。
末次灌胃后禁食18h(不禁水)，次日摘眼球取血，2500r/min離心10min，分離血清測透明質酸、ⅳ型膠原和ⅲ型前膠原。取肝臟稱重，計算肝指數。
2實驗結果
2.1次甲基青蒿素對大鼠ccl4肝硬化模型肝硬化三項的影響
參見下表3.1，實驗結果表明，模型對照組肝硬化大鼠透明質酸、ⅳ型膠原和ⅲ型前膠原含量顯著增高，與正常對照組比較具有顯著性差異，說明肝硬化大鼠形成過程中血中透明質酸(ha)、ⅳ型膠原(ⅳ-c)和ⅲ型前膠原(pcⅲ)有增高趨勢。次甲基青蒿素各劑量組均可明顯降低透明質酸的含量，說明次甲基青蒿素具有抗肝硬化形成的作用。
表3.1次甲基青蒿素對大鼠ccl4肝硬化模型肝硬化三項的影響
注：與正常對照組比較，**p<0.01；與模型對照組比較，δδp<0.01.
2.1次甲基青蒿素對大鼠ccl4肝硬化模型肝指數和存活時間的影響
參見下表3.2，實驗結果表明，在形成肝硬化模型的過程中，肝細胞損傷使肝系數增加，模型組大鼠死亡較多，存活天數較短，與正常對照組比較具有顯著性差異，次次甲基青蒿素具有減輕肝細胞損傷的作用，同時可不同程度降低大鼠死亡率，延長存活天數，與模型對照組比較具有顯著性差異。
表3.2次甲基青蒿素對大鼠ccl4肝硬化模型肝指數和存活時間的影響
注：與正常對照組比較，**p<0.01；與模型對照組比較，δδp<0.01。
3實驗結論
本實驗以大鼠ccl4肝硬化模型為研究對象，對次甲基青蒿素抗肝硬化的作用進行研究。實驗結果表明，模型對照組ha、pcⅲ、ⅳ-c明顯增高，與正常對照組比較有顯著性差異，采用次甲基青蒿素治療后可明顯降低ha、pcⅲ、ⅳ-c含量，具有抗肝硬化的作用。
本領域技術人員在考慮說明書及實踐這里發明的公開后，將容易想到本發明的其它實施方案。本發明旨在涵蓋本發明的任何變型、用途或者適應性變化，這些變型、用途或者適應性變化遵循本發明的一般性原理并包括本發明未公開的本技術領域中的公知常識或慣用技術手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發明的真正范圍和精神由權利要求指出。應當理解的是，本發明的范圍僅由所附的權利要求來限制。