硫磺礦硫化葉菌中（+）γ-內酰胺酶的編碼基因及應用的制作方法
【專利摘要】硫磺礦硫化葉菌中（+）γ-內酰胺酶的編碼基因及應用，屬于酶工程領域，還提供了該（+）γ-內酰胺酶在拆分消旋體γ-內酰胺中的應用。本發明所述的（+）γ-內酰胺酶是下述（a）蛋白：（a）由序列表中的SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質，其具有拆分消旋體γ-內酰胺活性的由SEQ?ID?NO:1衍生的蛋白質。在拆分消旋體γ-內酰胺從而獲得光學純（-）γ-內酰胺的應用中，該酶在高溫下還具有很高的生物活性，獲得的（-）γ-內酰胺的光學純度達99%以上，轉化率達到49%。
【專利說明】硫磺礦硫化葉菌中(+) Y -內酰胺酶的編碼基因及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于酶工程領域，涉及來源于硫磺礦硫化葉菌中第二種新的(+ ) Y -內酰胺酶的編碼基因，及該(+) Y-內酰胺酶在拆分消旋體Y-內酰胺中的應用。
【背景技術】
[0002]20世紀90年代國際上興起了一項為人類造福的高新技術產業一手性藥物，這是醫藥界的一次重大變革。(-)2-氮雜雙環-[2，2，I]-庚烷-5-烯-3-酮(簡稱(-)Y -內酰胺)是合成抗艾滋病藥物阿巴卡韋和抗流感藥物帕拉米韋重要手性中間體。近幾年，科學家利用酶的專一性，用微生物酶法高效性拆分消旋體Y -內酰胺，從而得到(_) Y -內酰胺。具有對環境友好，節約成本等優點。
[0003]目前報道的能拆分消旋體Y -內酰胺的微生物有硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus P2)、氧化經微桿菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)> 嗜酸叢毛菌(Comomonas acidovorans)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、突光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、青枯假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、嗜熱泉生古細菌(Aeropyrum pernix)。由于野生菌生長緩慢，蛋白表達量低、不穩定等諸多缺陷，構建相應的基因工程菌并用于工業化生產備受青睞。但是只有硫磺礦硫化葉菌、嗜酸叢毛菌、大豆慢生根瘤菌及嗜熱泉生古細菌找到了相應的編碼基因并完成基因工程菌構建，純化出了相應的(+ ) Y -內酰胺酶。
[0004]本發明的創新之處在于從硫磺礦硫化葉菌中找到一種(+ ) Y內酰胺酶，此種(+ )Y-內酰胺酶的編碼氨基酸與硫磺礦硫化葉菌中已發現的(+ ) Y-內酰胺酶完全不同。這是首次從同一種菌中發現不同類型卻具有相同功能的(+ ) Y -內酰胺酶。
[0005]本發明的目的是提供一種新的、高效的能拆分消旋體Y -內酰胺的(+ ) Y -內酰胺酶。
[0006]本發明所提供的(+ ) Y-內酰胺酶，來源于硫磺礦硫化葉菌，是如下(a)的蛋白:
[0007](a)由序列表中序列SEQ ID No:1所示的氨基酸序列構成的蛋白質；
[0008]其中，序列表中的SEQ ID No:1是由318個氨基酸構成。
[0009]上述(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。它是具有以下核苷酸序列之一:
[0010]Ca)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0011](b)編碼序列表中SEQ ID NO:1蛋白氨基酸序列對應的多核苷酸。
[0012]其中，序列表中的SEQ ID N0:2由957個堿基組成，其編碼序列為自5，端的ATG起始密碼子到3，端的TAA終止密碼子的完整開放閱讀框。
[0013]一種重組載體，其特征在于:其上述的編碼基因包括的核苷酸序列，原核表達載體為 PET30 或者 pET28。
[0014]—種表達宿主,其特征在于:含有上述的重組載體，一般表達宿主為大腸桿菌。
[0015]所述的硫磺礦硫化葉菌中(+ ) Y -內酰胺酶的應用，為在拆分消旋體Y -內酰胺從而得到(-)Y-內酰胺的應用。
[0016]所述應用為:將消旋體Y -內酰胺底物加入0.5M，pH7.4的磷酸緩沖液中，使消旋體Y -內酰胺底物濃度在0.005M-0.1M之間；然后向其中加入( + )Υ_內酰胺酶，在90°C轉化5_24h,制得(-)Y-內酸胺。
[0017]進一步，純化(+ ) Y-內酰胺酶蛋白采用熱處理去除雜蛋白從而得到純的(+ )Y-內酰胺酶的。
[0018]進一步，純化的(+ ) Y -內酰胺酶在拆分Y -內酰胺的時加入Ni2+或Zn2+。
[0019]本發明所述的(+ ) Y-內酰胺酶是按照下述方法構建的:硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus P2)基因組DNA為中科院微生物所王建軍研究員惠贈。以硫磺礦硫化葉菌基因組為模版，設計目的基因的引物，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR情況，然后回收957bp的條帶。回收產物用T4連接酶連接到T載體上并轉入DH5 α中，涂布到涂有x-gal和IPTG的氨芐霉素平板上(藍白斑篩選)，37°C培養過夜。之后以白斑為模版，進行菌落PCR，將克隆出條帶的菌送去測序，測序結果正確的菌轉接到LB培養基中，37°C培養過夜，提取該菌質粒，并用Hind III，Nde I酶于37°C酶切該質粒以及PET30載體。1%的瓊脂糖電泳檢測酶切情況并分別回收酶切成功的目的基因及PET30載體。回收后的產物在T4連接酶作用下進行連接，再次轉化到DH5a中，并涂布到含卡那霉素的平板上，進行菌落PCR。將克隆出條帶的對應菌再次送去測序，測序結果正確后提取質粒，將質粒轉入BL-21 (DE3)表達感受態中，用終濃度為2.5g/L的乳糖誘導表達出目的蛋白。
[0020]本發明所述的(+ ) Y-內酰胺酶還可以通過化學合成其編碼基因，通過常規基因操作手段將此化學合成的基因構建到表達載體，并導入大腸桿菌宿主細胞中得到轉化子，培養該轉化子，表達得到(+ ) Y-內酰胺酶。
[0021]用于構建含有上述(+ ) Y-內酰胺酶編碼基因的重組表達載體可以為基因工程菌領域中的表達載體，其載體包括PET系列載體，pUC系列載體等。選擇的宿主細胞是與上述載體對應的宿主，一般優先選擇大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS、E.coli JM109、E.coli HBlOUE.coli DH5 a等)。表達后的蛋白以已知的純化方法進行純化。
[0022]本發明所述(+ ) Y -內酰胺酶可以用來拆分消旋體Y -內酰胺，并得到99%以上的光學純(-)Y-內酰胺。由于該蛋白耐熱性好，在100°C下還能保持很高的活性，因此本實驗為了提高酶的反應效率，用高溫煮蛋白來除去雜蛋白，并通過超濾管millipore對純化后的蛋白進行濃縮。
[0023]對于本發明所述的(+ ) Y-內酰胺酶的酶學性質，主要從最適溫度，最適pH，溫度穩定性，金屬離子對酶活的影響等幾個方面進行考察。
[0024]本發明的意義主要在于:在同一種菌中發現了另一種(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因，并且此基因表達的(+ ) Y-內酰胺酶耐熱性很高，對消旋體Y-內酰胺的拆分活性ee值達到99%以上。
[0025]下面將結合附圖對本發明的具體實施方法做進一步說明。
【專利附圖】
【附圖說明】 [0026]圖1以硫磺礦硫化葉菌基因組為模版擴增目的片段的核酸電泳圖，[0027]泳道I，PCR產物；泳道M，DNA標準分子量
[0028]圖2重組菌表達前后對比及純化后蛋白SDS-PAGE圖，
[0029]泳道1，重組菌誘導前；泳道2，重組菌誘導表達后，泳道3，重組菌的純化；泳道M，蛋白分子量標準；
[0030]圖3重組菌拆分消旋體Y -內酰胺HPLC圖譜。
[0031]A沒有經過酶拆分的消旋體Y -內酰胺的HPLC分析圖；B經過(+ ) Y -內酰胺酶拆分后獲得(_) Y -內酰胺HPLC圖譜；其中，I一乙酸乙酯，2 —( + ) Y -內酰胺，3 —Y -內酰胺。
[0032]圖4 ( + ) Y-內酰胺酶學性質的表征
[0033]a: ( + ) Y -內酸胺酶最適溫度；
[0034]b: ( + ) Y -內酸胺酶最適pH ；
[0035]c:( + ) Y-內酰胺酶的熱穩定性；
[0036]d:金屬離子對(+ ) Y -內酰胺酶活性影響。
【具體實施方式】
[0037]以下實施例中的實驗方法如無特別說明均為常規方法。
[0038]實施例1本發明的(+ ) Y-內酰胺酶基因的獲得
[0039](I)設計(+ ) Y-內酰胺酶基因的引物
[0040]根據上述基因序列設計引物，引物序列如下(由上海生工合成):
[0041]( + ) Y -內酰胺酶基因上游引物:
[0042]5，-GGG AAT TCC ATA TGC AAT ATA CTA TTC ACG-3，
[0043]下劃線表示Nde I酶切位點；
[0044]( + ) Y -內酰胺酶基因下游引物:
[0045]5，-ATA TAA GCT TTT ATA ATA CCT CCA CGT TTA C-3，
[0046]下劃線表示Hind III酶切位點；
[0047](2) PCR擴增及基因克隆
[0048]以硫磺礦硫化葉菌基因組為模版進行PCR擴增，PCR反應體系為(50 μ I):1 μ I基因組，4 μ I dNTP Mixture，I單位(U)的rTaq酶，I μ I上游引物，1μ I下游引物，用水補齊。PCR條件:第一步熱變性95°C，5分鐘，第二步熱變性95°C，I分鐘，第三步退火溫度68°C，I分鐘(每循環一次降I°c)，第四步延伸72°C，I分鐘，第五步熱變性95°C，I分鐘，第六步退火55°C，I分鐘，第七步延伸72°C，I分鐘，弟八步延伸72°C，10分鐘，第二步到第四步之間設置15個循環，第五步到第七步之間設置20個循環。PCR反應結束后電泳檢測(附圖1)。
[0049]PCR產物經核酸電泳結束后用膠回收試劑盒(QIAGEN)回收目的片段，操作方法嚴格按照膠回收試劑盒說明書上的操作。回收后的PCR產物、以及pET30載體分別都用Nde I和Hind III酶在37°C下酶切過夜，再在T4連接酶作用下連接，從而構建好重組質粒。
[0050]實施例2本發明重組菌中目的蛋白(+ ) Y -內酰胺酶的表達和純化
[0051]用熱激發將構建好的重組質粒轉化到大腸桿菌(E.coil BL21(DE3)pLysS)中，獲得轉化子。將轉化好的菌接到5ml LB液體培養基(含卡那霉素)中，37°C下過夜培養，再按照1%的接種量轉接到50ml LB液體培養(含卡那霉素)中，37°C培養到菌的OD值達到0.6-1.0時，加入終濃度為2.5g/L的乳糖于16°C下誘導過夜。離心收集菌體,再加入去離子水清洗2-3次，最后將菌體重懸到一定量的磷酸緩沖液中進行超聲破碎(360W，超聲3秒，間隔5秒，總共40分鐘)。將破碎溶液離心，收集上清液，將上清液至于100°C下煮I小時。之后將煮后溶液在1000Orpm下離心15min,取上清液。接下來用0.22um濾膜過濾上清液，以除去大顆粒雜質。過濾后的溶液置于超濾管millipore中，于4°C下濃縮蛋白液。SDS-PAGE蛋白電泳檢測誘導前(泳道I)誘導后(泳道2)及純化后(泳道3)蛋白(附圖2)。重組菌中(+ ) Y -內酰胺酶蛋白表觀分子量為35kDa。
[0052]實施例3 (+) Y -內酰胺酶在消旋體Y -內酰胺拆分中的應用
[0053]( I)轉化率、ee值測定和Y -內酰胺手性分析方法
[0054]
【權利要求】
1.硫磺礦硫化葉菌中(+) Y -內酰胺酶，表達的蛋白質如下: Ca)由序列表中的SEQ ID NO:1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質。
2.一種包含權利要求1所述的(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因，其特征在于:這種(+ )Y-內酰胺酶的編碼基因具有下列核苷酸序列之一: Ca)序列表中SEQ ID No:2所示的核苷酸序列； (b)編碼序列表中SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列對應的多核苷酸序列。
3.—種重組載體，其特征在于:其含有權利要求2所示的編碼基因包括的核苷酸序列，原核表達載體為PET30或者pET28。
4.一種表達宿主,其特征在于:含有權利要求3所不的重組載體,一般表達宿主為大腸桿菌。
5.根據權利要求1所述的硫磺礦硫化葉菌中(+) Y-內酰胺酶的應用，為在拆分消旋體Y -內酰胺從而得到(_) Y -內酰胺的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述應用為:將消旋體Y-內酰胺底物加入0.5M，pH7.4的磷酸緩沖液中，使消旋體Y -內酰胺底物濃度在0.005M-0.1M之間；然后向其中加入(+ ) Y-內酰胺酶，在90°C轉化5-24h，制得(-)Y-內酰胺。
7.根據權利要求5或6所述的應用，純化(+) Y-內酰胺酶蛋白采用熱處理去除雜蛋白從而得到純的(+ ) Y-內酰胺酶的。
8.根據權利要求7所述的應用，純化的(+) Y-內酰胺酶在拆分Y-內酰胺的時加入Ni2+ 或 Zn2+。
【文檔編號】C12N15/70GK103992992SQ201410140274
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】鄭國鈞, 黃蓉 申請人:北京化工大學