一種甲基營養芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法
【專利摘要】本發明公開一種甲基營養芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法。來源于味精廠排口土壤中分離、選育的谷氨酸依賴型甲基營養芽孢桿菌(Bacillus?methylotrophicus)，已于2013年10月9日，經中國典型培養物保藏中心鑒定為甲基營養芽孢桿菌(Bacillus?methylotrophicus)菌株BT1301；已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?M2013462。以此菌株為發酵菌株，通過斜面菌種活化、菌種液體搖瓶活化和液體深層發酵三級培養，發酵液經無機鹽穩定處理，制成γ-聚谷氨酸生物型肥料增效劑劑，制成的生物復合肥對多種蔬菜病害具有較強的拮抗作用，降低病原菌發病率，對蔬菜生長具有促進作用。
【專利說明】一種甲基營養芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物技術和肥料【技術領域】，具體涉及一種甲基營養芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法。
【背景技術】
[0002]y -PGA的全名是Y-Polyglutamic acid,是一種微生物發酵產生的細胞外陰離子型多聚氨基酸，由D-和L-谷氨酸通過α-氨基酸和Y-羧基酰胺鍵連接而高分子聚合物，Y -PGA通常由5000個左右的谷氨酸單體組成，相對分子質量一般在100KD~1000KD，呈直鏈纖維狀，在Y-聚谷氨酸的分子鏈上具有大量的活性較高的游離羧基。除了其對人體無毒、生物可降解性和其降解產生對環境友好的終產物谷氨酸等優點外，還包括其具有高吸水性及保水性、良好的控制釋放能力、螯合金屬離子、與鐵、鈣、鎂鋅等形成同離子復合體以獲得更佳的營養生物可用性，以及良好的抗植物病原活性，刺激作物及其種子生長以及保護其免受植物病原菌影響，整合植物營養、提供土壤中難溶養分有效性、調整土壤PH等獨特功能，使Y-聚谷氨酸在農業上的應用具有較好前景。
[0003]專利CN102268389，公開了一種甲基營養芽孢桿菌及其發酵生產Y-聚谷氨酸的方法。該甲基營養芽孢桿菌培養時不需要谷氨酸，但產率過低，約17g/L。制得的發酵液經離心去除菌體，上清液加入2~4倍體積的無水乙醇、甲醇或丙酮沉淀聚谷氨酸，4°C靜置過夜，用有機溶劑洗滌，去離子水透析除去鹽，最后冷凍干燥，得到Y-聚谷氨酸。步驟復雜，其中還需使用大量化學溶劑洗滌沉淀，時間和成本都大大增加。專利申請號CN102703356A，公開了一種聚-Y-谷氨酸作為農用芽孢桿菌保護劑的應用，其中Y-聚谷氨酸也需要經過滅菌、純化和真空干燥步驟，才能使用Y -聚谷氨酸，步驟復雜，使用操作繁瑣，增加了處理的時間和成本，不利于工業 生產。
[0004]綜上所述，節約Y -聚谷氨酸工業生產成本，大大提高發酵產率，以及對發酵液進行簡單方便和穩定處理，對Y —聚谷氨酸在農業肥料方面應用具有重要意義。
【發明內容】
[0005]為了克服以上所述之技術問題，本發明提供了一種甲基營養芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法，使得Y —聚谷氨酸的生物發酵效率得以大大提高，以及解決傳統發酵液處理步驟復雜，使用大量化學溶劑洗滌和沉淀的問題，大大節約工業應用的時間和成本，有利于工業化生產以及環境保護。
[0006]本發明的技術方案:為了實現上述目的，本發明一種來源于味精廠排口土壤中分離、選育的谷氨酸依賴型甲基營養芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus),已于2013年10月9日，經中國典型培養物保藏中心鑒定為甲基營養芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株BT1301 ;該菌株已保藏于中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2013462。
[0007]本發明所述依賴谷氨酸發酵生產Y-聚谷氨酸的菌株甲基營養芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus) BT1301,最初來源于味精廠排口土壤樣本,樣本經液體培養基富集培養和稀釋涂布后，進行搖瓶發酵培養，最后對發酵液的Y -聚谷氨酸進行定性定量分析，最終得到生產Y-聚谷氨酸的菌株，并進行菌株的分離與鑒定。圖1是BT1301在蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基上菌落顯微照片，顯微鏡下細長桿狀，0.5~0.75 μ mX 1.5~
2.5 μ m，不規則形狀，有的細胞呈V形排列；圖2是BT1301在蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基上菌落呈白色或灰色、不透明，圓形邊緣整齊。
[0008] 申請人:委托中國典型培養物保藏中心(CCTCC)經過序列測定，該甲基營養芽孢桿菌BT1301的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。菌株BT130116S rRNA基因測序BLAST結果說明:與甲基營養芽孢桿菌具有較高的同源性，相似度為99.86%，鑒定該菌株為甲基營養芽孢桿菌。
[0009]甲基營養芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301具有以下性質:
[0010]1.形態特征
[0011]在蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基上營養細胞為0.5~0.75 μ mX 1.5~2.5 μ m大小的桿菌，當培養基中添加谷氨酸時，見圖3，BT1301形成無色半透明隆起菌落，像半粒玻璃珠在平板上；菌落表面光滑邊緣整齊、濕潤粘稠。
[0012]2.生理生化特征見表1和表2
[0013]表1生理生化特性一碳源利用
[0014]
【權利要求】
1.甲基營養芽抱桿菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株 BT1301,于 2013 年 10 月 9日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2013462。
2.用權利要求1所述甲基營養芽孢桿菌BT1301發酵生產Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，用甲基營養芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301CCTCC M2013462做出發菌株，進行斜面菌種活化、菌種液體搖瓶活化和液體深層發酵三級培養: 斜面菌種活化:將培養好的保藏斜面種(Bacillus methylotrophicus BT1301 CCTCCM2013462)劃線于新配制的LB斜面上，LB斜面組成如下:蛋白胨8~12g、酵母膏3~8g、氯化鈉9~llg、瓊脂15~22g、水11^，？!1值6.5~8.0，1211:滅菌20min，培養條件為:培養溫度33°C~37°C，培養I~4d ; 菌種液體搖瓶活化:將上述斜面菌種接種于液體LB活化培養液中，液體LB活化培養液組成如下:蛋白胨8~12g、酵母膏3~8g、氯化鈉9~llg、水lL，pH值6.5~8.0，500~1000mL三角瓶裝液1/3，121°C滅菌20min ;培養條件為:搖床轉速180~250r/min，培養溫度33°C~ 37°C，培養12~36h ； 液體深層發酵:液體深層發酵培養液組成如下:淀粉糖化液(淀粉水解糖的質量濃度10~200g/L) 100~400mL/L、氯化鈣0.3~0.8g/L、蛋白胨3~8g/L、谷氨酸鈉30~60g/L、氯化鈉9~15g、硫酸鎂I~1.5g/L、磷酸二氫鉀2~6g/L、硫酸錳0.005~0.08g/L ;液體深層發酵罐為0.5~50立方米自動控制高密度發酵罐，裝液量60%~85%，121°C滅菌20~30min ;培養條件為:接種量0.5~5%、攪拌轉速250~1000r/min、培養溫度33°C~37°C，培養I~4d ;得到深層發酵發酵液； 所述生物型肥料增效劑是由深層發酵發酵液與二價離子無機鹽組成。
3.根據權利要求2所述的一種甲基營養芽孢桿菌發酵生產Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述淀粉水解糖為利用木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉的一種或一種以上。
4.根據權利要求2所述的一種甲基營養芽孢桿菌發酵生產Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述二價離子無機鹽是鎂、鐵或鋅的無機鹽中的一種以上。
5.根據權利要求4所述的甲基營養芽孢桿菌發酵生產Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述鎂的無機鹽包括硫酸鎂、氯化鎂、草酸鎂的一種或一種以上；所述鋅的無機鹽包括硫酸鋅、氯化鋅、硝酸鋅、磷酸鋅的一種或一種以上；鐵的無機鹽包括硫酸亞鐵、氯化亞鐵、硝酸亞鐵的一種或一種以上。
6.根據權利要求2所述的一種甲基營養芽孢桿菌發酵生產Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述生物型肥料增效劑由液體深層發酵發酵液:鎂鹽按質量百分比85~95:5~15組成；或由液體深層發酵發酵液:鋅鹽按質量百分比85~95:5~15組成；或由液體深層發酵發酵液:鋅鹽:鎂鹽:二價鐵鹽按質量百分比85~95:2~15:1~15:2~15組成。
7.利用權利要求2-6之一所述的方法制得的生物型肥料增效劑粉劑，其特征在于，將權利要求2-6之一所述生物型肥料增效劑與硅藻土按1:1~2質量比混合、干燥制成粉劑。
8.利用權利要求7所述的生物型肥料增效劑粉劑制得的生物型肥料增效劑復合肥，其特征在于，將將權利要求7所述生物型肥料增效劑粉劑、尿素、磷肥、鉀肥和粘土按質量比1~5:20~87:5~60:5~60:2~20混合得到復合肥。
【文檔編號】C12N1/20GK103992966SQ201410148228
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】邵海鋒 申請人:深圳市芭田生態工程股份有限公司