一種兔體外單層肝細胞系模型建立及傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法
【專利摘要】本發明涉及兔體外單層肝細胞系模型建立方法，以及將其傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法，屬于肝細胞體外培養【技術領域】；本發明旨在尋求一種可以替換代價昂貴的應用動物實驗繁殖兔肝球蟲病原收集的方法，通過兔體外單層肝細胞系模型建立及傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法體外建立，能夠穩定的實現兔體外肝細胞快速、便捷、經濟的傳代，以便能夠在后續實驗中實現體外繁殖球蟲病原的目的；本發明通過摸索和研究兔年齡、擊殺方式、消化酶的選擇、培養方式的選擇、消化時間、細胞濃度、血清的選擇、培養瓶的選擇、濕度的控制及貼壁試劑的篩選等，成功的解決了兔單層肝細胞模型培養的建立并可順利的傳代，并摸索了細胞的凍存及保存的方式。
【專利說明】一種兔體外單層肝細胞系模型建立及傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及兔體外單層肝細胞系模型建立方法，以及將其傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法，屬于肝細胞體外培養【技術領域】。
【背景技術】
[0002]兔球蟲是家兔最常見的一種寄生蟲，對養兔業危害極大，幼兔感染率高達90%以上，死亡率高達40-70%，除兔斯氏艾美爾/肝球蟲斯氏艾美爾球蟲獨立寄生于兔肝膽管上皮細胞外，其余13種都寄生于腸。各類球蟲免疫沒有交叉保護性，腸球蟲可以通過糞便收集提純而獲得蟲株，然后進行疫苗的研制，但肝球蟲的蟲株病料不易收集，只能在兔子屠宰后從內臟中收集，這樣使得肝球蟲蟲株提純收集及繁殖受到極大地限制，從而影響疾病的診斷及治療。目前，國內外對斯氏艾美爾球蟲即兔肝球蟲的研究不多，對它造成的危害性也沒有引起足夠的重視，實用性的研究成果基本上處于零的狀態。[0003]如果能夠建立兔體外單層肝細胞系模型，并得到肝細胞株的連續傳代培養及儲存方法，就可以模擬兔斯氏艾美爾/肝球蟲體內生長循環模式，進而達到體外獲得極難取得的病源——具有無限繁殖能力的球蟲蟲株的目的。目前通過殺兔取肝得到球蟲蟲株，獲得的球蟲蟲株數量有限且試驗成本很高,遏制了兔肝球蟲疫苗的研究。因此體外培養兔肝細胞并獲得球蟲蟲株，不僅可以減少對兔子的殺戮，帶來動物福利；還可以降低成本，減少購買兔子的費用，最重要的是為解決兔肝球蟲疫苗蟲株的大量生產奠定了基礎，為廣大兔養殖戶帶來更高的經濟效益。
[0004]但是兔肝原代細胞的培養難度很大，特別是單層細胞的培養。在產品方面，2013年才從網上查到有一家公司在出售兔肝細胞，但經咨詢后為懸浮細胞，沒有貼壁細胞，且據說僅能傳代10代左右。在理論方面，雖然有論文發表，但依據其提供的方法并不能培養成功，同時細胞培養所需的環境及技術要求較高，原代細胞培養成功后，大部分的報道不能超過3代進行傳代。國內文獻參考了《乳兔和成年兔肝細胞體外分離及培養的比較研究》，國外文獻參考了 ((Identification of Carbohydrates on Eimeria stiedai Sporozoitesand Their Role in Invasion of Cultured Cells in vitr0.Department of VeterinaryPhysiology》(Research Center for Molecular Protozoology, Obihiro University ofAgriculture and Veterinary Medicine, Obihiro 080, Japan)。但按其參考文獻的流程程序，均未能培養出單層肝細胞，尤其是在應用胰酶、膠原酶消化的濃度和時間方面的數據，與發明人的試驗數據具有較大出入。同時文獻中提到的乳兔肝細胞僅僅能傳代4代、成年兔為2代，不可能培養出連續性的肝細胞株。
【發明內容】
[0005]本發明旨在尋求一種可以替換代價昂貴的應用動物實驗繁殖兔肝球蟲(斯氏艾美爾球蟲)病原收集的方法，通過兔體外單層肝細胞系模型建立及傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法體外建立，能夠穩定的實現兔體外肝細胞的快速、便捷、經濟的傳代，以便能夠在后續實驗中實現體外繁殖球蟲病原的目的。
[0006]為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為:一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、 兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于消毒液中0.5-2分鐘后取出，浙凈消毒液后，無菌取出兔子的肝臟放入培養皿中；一般兔子的擊殺方式為頸靜脈放血致死和頸動脈放血致死，這兩種方式在實驗過程中均不能得到貼壁肝細胞，經過研究人員的縝密探討和大膽嘗試，最終確定了擊打兔子后腦的不放血擊殺方式，且擊殺兔子后應盡快獲取肝細胞；
b、兔子肝臟的預處理:將兔子肝臟在培養皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；剪碎過程中應當將血管、膽管等肥肝組織剔除；
C、消化得到分散兔子肝細胞:將剪碎的兔子肝細胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化8~15分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；此處所述珠瓶為盛有玻璃微珠的三角瓶，玻璃微珠占三角瓶體積的1/4左右；吹打分散的方法不能夠很好的適用于本發明，采用珠瓶，利用震蕩時玻璃微珠之間及其與瓶壁紙件的摩擦和碰撞，能夠很好的對剪碎的肝組織進行分散；
d、收集細胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經4-6層紗布過濾到小燒杯內，重復收集步驟4-5次，得到含有消化好的兔子肝細胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，800_1000r/min離心5-7分鐘；
f、培養:棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細胞培養瓶中，然后加入180-210 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱中培養3-6天，得到兔體外單層肝細胞系模型。所述恒溫培養箱為隔水式。
[0007]上述步驟中b-d、f均需在超凈工作臺上進行。
[0008]本發明所用的兔子購自山西醫科大學實驗動物中心，要求體重500g左右的灰色家兔幼兔，體重可在±30g范圍內浮動。
[0009]本發明采用的細胞培養瓶，瓶蓋有透氣孔，或者瓶蓋旋緊后擰松I圈。
[0010]上述方法中所述的0.025%胰酶可以用1%的I型膠原酶替換；所述消毒液為新潔爾滅消毒液。
[0011]將得到的兔體外肝細胞單層模型傳代為連續性肝細胞株的培養方法，包括如下步驟:
第一步，收集細胞
將細胞培養瓶中的原有細胞生長液傾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，搖晃3_6次倒掉，重復該操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至細胞培養瓶的邊緣有小點狀的透明出現，立刻倒掉細胞培養瓶中的液體，以手拍擊細胞培養瓶，細胞呈流沙樣脫落；若細胞未呈流沙樣脫落，則利用傾倒后細胞培養瓶中剩余的液體繼續放置一段時間，直至出現流沙樣情況；然后加入DMEM液2mL，吹打細胞直至瓶壁透亮，得到細胞懸液；
第二步，細胞的傳代培養將細胞懸液分成兩份接種到2個細胞培養瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱。
[0012]根據細胞的生長情況，也可以按1:2-4將細胞懸液分裝到培養瓶中。
[0013]得到的連續性肝細胞株的儲存方法，包括如下步驟:
用Versene胰蛋白酶溶液常規消化培養得到的細胞單層，然后以500 Xg離心10min收集細胞；按照25mL細胞培養瓶中培養7-9天的細胞消化離心后收集到的細胞添加ImL細胞冷凍保存液于I只安瓶；
將安瓶集中放在盒中，分三步緩慢降溫:(1)4°C放置2h，(2)-20°C放置lh，(3)置于_70°C超低溫冰箱或液氮中保存。
[0014]所述安瓶降溫步驟的第(2)步，_20°C放置的時間嚴禁超過lh。
[0015]冷凍后的兔傳代肝細胞株的復蘇方法，包括如下步驟:
(1)迅速解凍，取出安瓶后拿止血鉗夾好，立即投入37°C水浴中，至全部溶解；不可讓水沒過管蓋；
(2)用70%酒精浸泡消毒后打開安瓶，將細胞懸液轉入離心管中，補加細胞生長液，以500 Xg離心10min后，倒掉液體；
(3)加細胞生長液使細胞濃度為0.2% ;按I只安瓶復蘇I瓶25mL的細胞；
(4)觀察細胞貼壁后，輕輕倒出舊細胞生長液，換新的細胞生長液繼續培養。
[0016]與現有技術相比本發明具有以下有益效果。
[0017]1、兔肝細胞是兔斯氏艾美爾/肝球蟲高選擇性的生長部位，本發明建立了兔體外單層肝細胞系模型及傳代為連續性肝細胞株的培養及儲存方法，從而使得模擬兔斯氏艾美爾/肝球蟲體內生長循環模式，達到球蟲蟲株無限制的繁殖，體外獲得極難取得的病源能夠實現，解決了兔肝球蟲疫苗蟲株難以大量生產的遏制瓶頸。
[0018]2、本發明 不僅可以成功的培養出兔體外單層肝細胞模型，同時又將其連續不斷的培養繁殖下去，成功的建立了肝細胞株；同時將方法進行簡化，使細胞培養由原來繁瑣的步驟改變為快速、便捷的培養方式。從而建立起兔體外單層肝原代細胞體外培養方式，同時又保持了兔肝細胞良好的結構和功能，為后續的科研奠定了良好的基礎。
[0019]3、本發明得到的兔肝原代細胞為貼壁細胞。通過研究得出的連續性兔肝貼壁細胞株能夠很好的保持兔肝細胞的生理生化性狀，在篩選細胞時，形成特有的細胞株，并且有別于現有的兔肝懸浮細胞，可以供研究和觀察兔肝球蟲的生命周期及繁殖。
[0020]4、本發明建立的兔體外單層肝細胞系模型，能夠順利的傳代至11代，且得到的11代細胞仍具有良好的活性，能夠繼續傳代。同時并摸索了傳代細胞的凍存和保存方式，從而形成連續性兔肝細胞株，為兔肝球蟲疫苗的研究奠定了良好的基礎。
[0021]5、本發明通過體外培養兔肝原代細胞株，替代了實驗兔的選用，極大地節約了研發成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為采用0.025胰酶消化IOmin的兔肝。
[0023]圖2為胰酶消化的兔肝細胞生長5天的貼壁情況。
[0024]圖3為培養23天的單核和雙核的兔肝細胞。【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0026]實施例1
一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中2分鐘后取出，浙凈消毒液后，無菌取出兔子的肝臟放入培養皿中；
b、兔子肝臟的預處理:將兔子肝臟在培養皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；
C、消化得到分散兔子肝細胞:將剪碎的兔子肝細胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化8分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經4層紗布過濾到小燒杯內，重復收集步驟4次，得到含有消化好的兔子肝細胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，800r/min離心6分鐘；
f、培養:棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細胞培養瓶中，然后加入180 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱中培養3天，得到兔體外單層肝細胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺上進行。
[0027]實施例2
一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中0.5分鐘后取出，浙凈消毒液后，無菌取出兔子的肝臟放入培養皿中；
b、兔子肝臟的預處理:將兔子肝臟在培養皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；
C、消化得到分散兔子肝細胞:將剪碎的兔子肝細胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化10分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經5層紗布過濾到小燒杯內，重復收集步驟4次，得到含有消化好的兔子肝細胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，900r/min離心6分鐘；
f、培養:棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細胞培養瓶中，然后加入190 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱中培養5天，得到兔體外單層肝細胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺上進行。
[0028]實施例3
一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中I分鐘后取出，浙凈消毒液后，無菌取出兔子的肝臟放入培養皿中；
b、兔子肝臟的預處理:將兔子肝臟在培養皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；C、消化得到分散兔子肝細胞:將剪碎的兔子肝細胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化12分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經4層紗布過濾到小燒杯內，重復收集步驟5次，得到含有消化好的兔子肝細胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中,800r/min離心7分鐘；
f、培養:棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細胞培養瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱中培養4天，得到兔體外單層肝細胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺上進行。
[0029]實施例4
一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中1.5分鐘后取出，浙凈消毒液后，無菌取出兔子的肝臟放入培養皿中；
b、兔子肝臟的預處理:將兔子肝臟在培養皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；
C、消化得到分散兔子肝細胞:將剪碎的兔子肝細胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化15分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經6層紗布過濾到小燒杯內，重復收集步驟5次，得到含有消化好的兔子肝細胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，1000r/min離心5分鐘；
f、培養:棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細胞培養瓶中，然后加入210 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱中培養6天，得到兔體外單層肝細胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺上進行。
[0030]實施例5
以實施例3得到的原代兔體外單層肝細胞系模型為例，一種兔體外單層肝細胞系模型傳代為連續性肝細胞株的培養方法，包括如下步驟:
第一步，收集細胞
將細胞培養瓶中的原有細胞生長液傾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，搖晃3_6次倒掉，重復該操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至細胞培養瓶的邊緣有小點狀的透明出現，立刻倒掉細胞培養瓶中的液體，以手拍擊細胞培養瓶，細胞呈流沙樣脫落，然后加入細胞生長液2mL，吹打細胞直至瓶壁透亮；上述步驟以手拍擊細胞培養瓶時，若細胞未呈流沙樣脫落，則利用傾倒后細胞培養瓶中剩余的液體繼續放置一段時間，直至出現流沙樣情況；
第二步，細胞的傳代培養
將吹打分散后的細胞分成兩份，每份裝入一個細胞培養瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱。
[0031]一、所用Versene溶液(0.02%)米用如下原料配制:
NaCl 8.0g, KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4 1.15g (或 Na2HPO4* 12H20 2.90g)、乙二胺四醋酸二鈉(EDTA) 0.2g、雙蒸水lOOOmL。
[0032]配好后于121 °C高壓滅菌15min，4°C保存備用。
[0033]二、所用Versene胰蛋白酶溶液采用如下原料配制:
無鈣、鎂PBS胰蛋白酶溶液(0.25%) 0.2mL、上述Versene溶液(0.02%) 2mL。
[0034]三、無鈣、鎂磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制:
NaCl 8.0g, KCl 0. 2g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2g、雙蒸水 1000mL ;
依次稱取各試劑并依次溶解在雙蒸水中，將得到的溶液于121°C下15min高壓滅菌，冷卻后裝入滅菌瓶，取樣檢驗無菌后置于普通冰箱貯存。
[0035]四、無鈣、鎂PBS胰蛋白酶溶液(0.25%)的配制:
原料:上述無鈣、鎂PBS lOOOmL、胰蛋白酶(1:250) 2.5g ；
將胰蛋白酶加入上述無鈣、鎂PBS中攪拌至溶解，用賽氏濾器過濾除菌，裝入滅菌瓶中，取樣檢驗無菌后于_20°C貯存。
[0036]實施例6
一種兔體外肝細胞單層模型傳代為連續性肝細胞株的儲存方法，包括如下步驟:
用Versene胰蛋白酶溶液常規消化培養得到的細胞單層，然后以500 Xg離心10min收集細胞；按照25mL細胞培養瓶中培養7-9天的細胞消化離心后收集到的細胞添加ImL細胞冷凍保存液于I只安瓶；
將安瓶集中放在盒中，分三步緩慢降溫:(1)4°C放置2h，(2)-20°C放置lh，(3)置于_70°C超低溫冰箱或液氮中保存。
[0037]所述安瓶降溫步驟的第(2)步，_20°C放置的時間不得超過lh。
[0038]細胞冷凍后的復蘇方法為:
(1)迅速解凍，取出安瓶后拿止血鉗夾好，立即投入37°C水浴中，至全部溶解；不可讓水沒過管蓋；
(2)用70%酒精浸泡消毒后打開安瓶，將細胞懸液轉入離心管中，補加細胞生長液，以500 Xg離心10min后，倒掉液體；
(3)加細胞生長液使細胞濃度為0.2% ;按I只安瓶復蘇I瓶25mL的細胞；
(4)觀察細胞貼壁后，輕輕倒出舊細胞生長液，換新的細胞生長液繼續培養。
[0039]本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從那一點來看，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不能限制發明，權利要求書指出了本發明的范圍，而上述的說明并未指出本發明的范圍，因此，在與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何變化，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。
【權利要求】
1.一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，其特征在于包括如下步驟: a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于消毒液中0.5-2分鐘后取出，浙凈消毒液后，無菌取出兔子的肝臟放入培養皿中； b、兔子肝臟的預處理:將兔子肝臟在培養皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊； C、消化得到分散的兔子肝細胞:將剪碎的兔子肝細胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化8~15分鐘；所述消化液為0.025%胰酶； d、收集細胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經4-6層紗布過濾到小燒杯內，重復收集步驟4-5次，得到含有消化好的兔子肝細胞的懸液； e、離心:將所述懸液分裝入1OmL的離心管中，800_1000r/min離心5-7分鐘； f、培養:棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細胞培養瓶中，然后加入180-210 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱中培養3-6天，得到兔體外單層肝細胞系模型； 所述步驟b-d、f均在超凈工作臺上進行。
2.根據權利要求1所述的一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，其特征在于:作為肝臟來源的兔子為體重470-530g的幼兔。
3.根據權利要求1所述的一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，其特征在于:所述步驟e離心后得到的壓積的肝細胞進行步驟f的培養操作時，按照每ImL細胞傳6個細胞培養瓶。
4.根據權利要求1所述的一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，其特征在于:所述0.025%胰酶替換為1%的I型膠原酶，消化時間則為13-16min。
5.根據權利要求1所述的一種兔體外單層肝細胞系模型建立方法，其特征在于:所述消毒液為新潔爾滅消毒液。
6.一種權利要求1得到的兔體外肝細胞單層模型傳代為連續性肝細胞株的培養方法，其特征在于包括如下步驟: 第一步，收集細胞 將細胞培養瓶中的原有細胞生長液傾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，搖晃3_6次倒掉，重復該操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至細胞培養瓶的邊緣有小點狀的透明出現，立刻倒掉細胞培養瓶中的液體，以手拍擊細胞培養瓶，細胞呈流沙樣脫落，然后加入DMEM液2mL，吹打細胞直至瓶壁透亮，得到細胞懸液； 第二步，細胞的傳代培養 將細胞懸液分成兩份接種到2個細胞培養瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細胞培養瓶置于37°C、5%C02恒溫培養箱。
7.根據權利要求6所述的兔體外肝細胞單層模型傳代為連續性肝細胞株的培養方法，其特征在于:以手拍擊細胞培養瓶時，若細胞未呈流沙樣脫落，則利用傾倒后細胞培養瓶中剩余的液體繼續放置一段時間，直至出現流沙樣情況，再進行后續操作。
8.根據權利要求6或7所述的兔體外肝細胞單層模型傳代為連續性肝細胞株的儲存方法，其特征在于包括如下步驟: 用Versene胰蛋白酶溶液 常規消化培養得到的細胞單層，然后以500 Xg離心10min收集細胞；按照25mL細胞培養瓶中培養7-9天的細胞消化離心后收集到的細胞添加1ml細胞冷凍保存液于1只安瓶； 將安瓶集中放在盒中，分三步緩慢降溫:(1) 4°C放置2h，(2)-20°C放置lh，(3)置于_70°C超低溫冰箱或液氮中保存。
9.根據權利要求8所述的兔體外肝細胞單層模型傳代為連續性肝細胞株的儲存方法，其特征在于:所述安瓶降溫步驟的第(2)步，_20°C放置的時間不得超過lh。
10.根據權利要求8所述的細胞冷凍后的復蘇方法，其特征在于包括如下步驟: (1)迅速解凍，取出安瓶后拿止血鉗夾好，立即投入37°C水浴中，至全部溶解；不可讓水沒過管蓋； (2)用70%酒精浸泡消毒后打開安瓶，將細胞懸液轉入離心管中，補加細胞生長液，以.500 Xg離心10min后，倒掉液體； (3)加細胞生長液使細胞濃度為0.2% ;按1只安瓶復蘇I瓶25mL的細胞； (4)觀察細胞貼壁后，輕輕倒出舊細胞生長液，換新的細胞生長液繼續培養。
【文檔編號】C12N5/071GK103923875SQ201410159927
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】鞏紅霞, 鞏強, 張祖維, 田文霞, 傅英文, 賈廣樂, 雷宇平, 王芬, 宋歡, 安偉 申請人:鞏紅霞