一種用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置與方法
【專利摘要】本發明公開了一種用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置與方法，其中生物反應器細胞特性篩選方法為根據細胞在不同的細胞狀態條件下代謝率不同，在細胞特性篩選過程中通過加入物理、化學、生物的因素造成細胞的比生長速率不同，使比生長速率快的為所篩選細胞。本發明可實現在篩選過程中、培養過程中的自動化管理，對細胞進行連續特性篩選（例如G418加壓或持續的降血清），且在篩選的同時可獲得大量的目的蛋白或目的細胞，此外反應器篩選過程大大縮短了篩選時間、減少工作量、降低污染率，而且能很好的去掉人為因素，為工業應用提供有保證的細胞株。
【專利說明】一種用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置與方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物工程領域的裝置和方法，具體是一種用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置與方法。
【背景技術】
[0002]目前，絕大部分生物工程用特性細胞株(例如無血清、單克隆穩定細胞株)的細胞篩選均為傳統方式，用孔板或者轉瓶根據其需要篩選的特性(例如單克隆的穩定細胞株，無血清細胞株)進行篩選，也可以達到其基本需要，但其缺點在于容易造成假陽性、程序繁冗、污染率高、耗時長，且工作量大，人為因素較大。另外，傳統方式所提供的細胞體外生長環境不容易控制，通常隨培養進程而變化，且傳統方式難于做到連續等。
[0003]經過對現有文獻的檢索發現，在Chun Chen, Xiang-Dong Fang, Jiang Zhu,Xiang-Fu ffu, et al ((The Gene Expression of Coagulation Factor VIII in MammalianCell Lines)) Thromb Res.1999 Jul 15; 95 (2):105-15.中，FVIII 穩定細胞株的篩選是轉染后用G418進行陽性篩選，稀釋法96孔板不斷加入G418篩選獲得穩定細胞株。但是該過程中，操作繁瑣，容易造成假陽性、程序繁冗、污染率高、耗時長，且工作量大。
【發明內容】
[0004]生物反應器大規模細胞特性的篩選能彌補現有技術中用孔板或者轉瓶進行篩選的缺點，因此本發明針對現有技術的上述不足，提供一種連續的、簡便、反應器規模的細胞篩選的裝置和方法，使得在篩選過程中，可實現培養過程中的自動化管理，對細胞進行連續特性篩選(例如G418加壓或持續的降血清)，且在篩選的同時可獲得大量的目的蛋白或目的細胞，此外反應器篩選過程大大縮短了篩選時間、減少工作量、降低污染率，而且能很好的去掉人為因素，為工業應用提供有保證的細胞株。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的:
本發明涉及的生物反應器細胞特性篩選裝置，包括儲液裝置、細胞培養裝置、細胞培養控制裝置、多個液體無菌推動裝置(如蠕動泵)、細胞截留裝置(如biosep，細胞沉降裝置，中空纖維裝置等)、多個可控速液體流動管道(如硅膠管等)、上清收集裝置、截留細胞收集裝置；其連接方式為，儲液裝置通過一第一可控速液體流動管道與細胞培養裝置相連，一第一液體無菌推動裝置設置在儲液裝置與細胞培養裝置之間；
細胞培養裝置一端通過一第二可控速液體流動管道與細胞截留裝置截留前部分相連，細胞培養裝置另一端通過一第三可控速液體流動管道與細胞截留裝置的截流后部分相連，一第二液體無菌推動裝置設置在細胞培養裝置與截流后的細胞截留裝置之間；
細胞培養裝置與細胞培養控制裝置通過信號轉化輸出線相連；
細胞截留裝置的截留前一端與上清收集裝置相連，一第三液體無菌推動裝置設置在上清收集裝置與細胞截留裝置的截留前一端之間，細胞截留裝置的截留后另一端與截留細胞收集裝置相連，一第四液體無菌推動裝置設置在截留細胞收集裝置與細胞截留裝置的截留后另一端之間。
[0006]所述儲液裝置為有至少三孔的可滅菌培養液儲存裝置，其中一孔可通過一第四可控速液體流動管道使無菌過濾后的培養液進入儲液裝置中，另一孔可通過所述第一可控速液體流動管道將無菌過濾后的培養液推入細胞培養裝置中，又一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
[0007]所述細胞培養裝置為至少有培養液入口、培養液出口、細胞回流入口、氣體(如空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣)入口、細胞取樣口、堿入口、細胞接種口、探頭插入口(如PH、D0、溫度)，可高溫滅菌、密閉無菌進行細胞培養。該裝置可通過細胞培養控制裝置控制細胞培養過程中的各種參數(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)。
[0008]所述細胞培養控制裝置為至少可保存和調控各種培養過程中的物理化學參數(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)的控制器，該裝置可控制細胞培養過程的各種參數使得細胞最優化的生長或獲得目的產物。在本發明的一些具體實施例中，所述細胞培養控制裝置還可以控制一部分液體無菌推動裝置的開、關和流速。
[0009]所述可控速液體流動管道為可通過滑動控制閥或夾子控制培養液流速。
[0010]所述液體無菌推動裝置(如蠕動泵)為可無菌地推動管道內的液體流動的裝置，如蠕動泵。所述液體無菌推動裝置的開、關和流速控制可由所述細胞培養控制裝置控制，或者人工控制，或部分液體無菌推動裝置由所述細胞培養控制裝置控制，而另一部分人工控制。
[0011]所述細胞截留裝置(如biosep，細胞沉降裝置，中空纖維裝置等)至少設有細胞混合液入口、細胞上 清液出口、細胞回流出口、截留出口；其中，所述細胞截留裝置的細胞混合液入口通過所述第二可控速液體流動管道與所述細胞培養裝置連接，用于將所述細胞培養裝置中的細胞混合液送入所述細胞截留裝置中；所述細胞截留裝置的細胞上清液出口通過所述第三液體無菌推動裝置與所述上清收集裝置連接，用于將細胞上清液推入到上清收集裝置中；所述細胞截留裝置的細胞回流出口通過所述第三可控速液體流動管道和所述第二液體無菌推動裝置與所述細胞培養裝置相連接，用于將截留下來的細胞通過細胞回流出口推入細胞培養裝置中；所述細胞截留裝置的截留出口通過所述第四液體無菌推動裝置與所述截留細胞收集裝置連接，用于將截留下來的細胞推入截留細胞收集裝置中；其中，截留下來的細胞可通過細胞回流出口回流進入所述細胞培養控制裝置中，或者通過截留出口進入所述截留細胞收集裝置中，具體地，截留下來的細胞需進入上述的哪一個裝置是由所述細胞培養控制裝置或人為根據預先設定來調控相關的液體無菌推動裝置實現的。
[0012]所述上清收集裝置為有至少二孔可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第三液體無菌推動裝置(如蠕動泵)將截留后的細胞上清液送入該上清收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
[0013]所述截留細胞收集裝置為有至少二孔可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第四液體無菌推動裝置(如蠕動泵)將截留后的細胞懸液送入該截留細胞收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
[0014]本發明提供的生物反應器細胞特性篩選的方法，其原理為一種細胞在不同的細胞狀態條件下代謝率(如比生長速率、比葡萄糖消耗率、比細胞得率等)不同，在細胞特性篩選(穩定細胞株、無血清細胞株)過程中通過加入物理、化學、生物的因素(例如G418、低、無血清培養液等，包括上述舉例但不限于此)、造成細胞的比生長速率不同，使得比生長速率快的細胞為所篩選細胞。而在細胞培養裝置中細胞是均勻的分布，細胞培養裝置中的細胞通過細胞截留裝置后，啟動細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，將生長快和慢的細胞以反應器中該條件下的比例均勻的推入截留細胞收集裝置中，由于其比生長速率不同造成細胞培養裝置中生長快、慢的細胞比例發生變化，比生長速率大的(即生長快)的細胞與比生長速率小的(即生長慢)比例變大，而細胞截留裝置是連續的啟動，使得最終細胞培養裝置中的細胞均為比細胞生長速率大的細胞，從而篩選到生長速率大的細胞。
[0015]本發明的裝置工作時，儲液裝置內的培養液在相應液體無菌推動裝置(如蠕動泵)作用下，通過可控速液體流動管道(如硅膠管)進入細胞培養裝置中，而細胞培養控制裝置控制細胞培養的各種參數(例如PH、D0、溫度等包括上述舉例但不限于此)以達到細胞生長的優化條件，細胞在細胞特性篩選培養液或普通細胞培養液中此優化條件下生長。經過一段時間培養后，細胞密度達到一定數量級時，進行細胞特性篩選。當進行細胞特性篩選(如穩定細胞株、無血清細胞株)時，加入物理、化學、生物等因素的細胞特性篩選培養液(例如G418、低、無血清培養液等，包括上述舉例但不限于此)，該細胞特性篩選培養液在相應液體無菌推動裝置(如蠕動泵)作用下，通過可控速液體流動管道(如硅膠管)進入細胞培養裝置中，細胞在此培養液下生長。細胞培養裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)以設定的灌注速率進行推動細胞特性篩選培養液至細胞培養裝置中，上清收集裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)將細胞培養裝置中的細胞混合液推至細胞截留裝置(如biosep，細胞沉降裝置，中空纖維裝置等)中。細胞培養控制裝置通過連續灌注稱的設定重量調控上清收集裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)速度，使得細胞培養裝置的培養液總體積保持不變。細胞回流處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)速度由自行設定，不宜過大或過小(例如在細胞沉降截留裝置中，速度過大則回流細胞損傷過大，過小則截留效果不佳，較多細胞都進入了上清中)。當細胞密度高于設定的灌注細胞密度時，細胞培養控制裝置則啟動細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，將截留的部分細胞推至截留細胞收集裝置中，當細胞密度低于設定的灌注 細胞密度時，則關閉細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，使得細胞密度維持在設定密度位置不變。
[0016]本發明所提供的生物反應器細胞特性篩選的方法的一具體實施步驟如下:
1.安裝、連接該發明的整套裝置且進行高溫滅菌；
2.在無菌操作臺里面向儲液裝置里加入細胞特性篩選培養液或普通培養液，然后向細胞培養裝置里以(0.5-10X106cells/ml)細胞密度接種待篩選的細胞；
3.設定該反應器的灌注、回流速度、截留細胞密度以及細胞培養裝置的灌注重量；
4.待細胞密度達到(2-10X106cells/ml)數量級時，進行細胞特性篩選；加入細胞特性篩選培養液，該細胞特性篩選培養液在相應液體無菌推動裝置作用下，通過可控速液體流動管道進入細胞培養裝置中，細胞在此細胞特性篩選培養液下生長；開啟細胞培養裝置處及細胞回流處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，以分別調節至設定灌注速度及設定回流速度。細胞培養控制裝置通過連續灌注稱的設定重量調控上清收集裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)速度，使得細胞培養裝置的培養液總體積保持不變。當細胞密度高于設定的灌注細胞密度時，細胞培養控制裝置則啟動細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，將截留的部分細胞推至細胞截留細胞收集裝置中，當細胞密度低于設定的灌注細胞密度時，細胞培養控制裝置則關閉細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，使得細胞密度維持在設定密度位置不變；
5.每天取樣進行陽性分析，待細胞培養裝置中絕大部分的細胞為預定的篩選細胞后則停止該連續篩選。
[0017]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:
本發明的裝置與方法克服了傳統方法的諸多不利，提供了一種連續的、簡便、反應器規模的細胞篩選的方法，使得在篩選過程中，可實現培養過程中的自動化管理，對細胞進行連續特性篩選(G418加壓或持續的降血清)，且在篩選的同時可獲得大量的目的蛋白或目的細胞，此外反應器篩選過程大大縮短篩選時間、減少工作量、降低污染率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明裝置的一種實例結構示意圖；
圖2為本發明實施例中FVIII細胞篩選過程中，FVIII表達量曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應該理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的保護范圍。在實際應用中本領域技術人員根據本發明做出的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。 [0020]此處以G418的調節作用為例說明本發明的細胞特性篩選培養液調控細胞比生長速率的原理:例如，在細胞穩定細胞株的篩選過程中，轉染后的細胞中，部分為目的基因轉入進去的細胞，部分為未能將目的基因轉入進去的細胞，而在此時將G418加入該培養液中，無抗性基因的細胞在G418的作用下，逐漸開始死亡或者生長速率慢，而有抗性基因的則能適應G418的存在下生長。隨著時間的推移，細胞會呈現出在一定濃度的G418的條件下細胞比生長速率存在快慢，此時通過在灌注培養過程中的截留作用，可將比生長速率快的保留，生長速率慢的則逐步被截留出。
[0021]請參見圖1所示，本發明的一個實施例提供的用生物反應器進行細胞特定篩選的裝置，包括儲液裝置1、細胞培養裝置4、細胞截留裝置(如biosep，細胞沉降裝置，中空纖維裝置等)5、上清收集裝置7、截留細胞收集裝置8、多個可控速液體流動管道(如硅膠管等)、多個液體無菌推動裝置(如蠕動泵)、細胞培養控制裝置11，其中，細胞截留裝置5至少有細胞混合液入口、細胞上清液出口、細胞回流出口、截留出口 ；其連接方式為，儲液裝置I通過一第一可控速液體流動管道2與細胞培養裝置4相連，一第一液體無菌推動裝置3設置在儲液裝置I與細胞培養裝置4之間；
細胞培養裝置4 一端通過一第二可控速液體流動管道12與細胞截留裝置5的細胞混合液入口相連，細胞培養裝置4另一端通過一第三可控速液體流動管道13與細胞截留裝置5的細胞回流出口相連，一第二液體無菌推動裝置10設置在細胞培養裝置4與細胞截留裝置的細胞回流出口之間；
細胞培養裝置4與細胞培養控制裝置11通過信號轉化輸出線相連；
細胞截留裝置5的上清液出口與上清收集裝置7相連，一第三液體無菌推動裝置6設置在上清收集裝置7與細胞截留裝置5的上清液出口之間，細胞截留裝置5的截留出口與截留細胞收集裝置8相連，一第四液體無菌推動裝置9設置在截留細胞收集裝置8與細胞截留裝置5的截留出口之間。
[0022]儲液裝置I為至少有三孔的可滅菌培養液儲存裝置，其中一孔可通過一可控速液體流動管道(如硅膠管等)將無菌過濾后的培養液送入該儲液裝置I中，另一孔可通過第一可控速液體流動管道2將無菌過濾后的培養液推入細胞培養裝置4中，又一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
[0023]細胞培養裝置4為至少有培養液入口、培養液出口、細胞回流入口、氣體(如空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣)入口、細胞取樣口、堿入口、細胞接種口、探頭插入口(如PH、D0、溫度)的裝置，可高溫滅菌、密閉無菌進行細胞培養。該裝置可通過細胞培養控制裝置11來控制細胞培養過程中的各種參數(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)。
[0024]細胞培養控制裝置11為至少可保存和調控細胞培養過程中的各種物理化學參數(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)的控制器，該裝置可控制細胞培養過程的各種參數使得細胞最優化的生長或獲得 目的產物。具體地，細胞培養控制裝置11可以為安裝有探頭組數據信號接口和在線監控系統軟件的計算機。細胞培養控制裝置11還可以控制部分液體無菌推動裝置的開、關和流速。
[0025]可控速液體流動管道為可通過滑動控制閥或夾子控制培養液流速的裝置，如硅膠管。
[0026]液體無菌推動裝置為可無菌地推動管道內的液體流動的裝置，如蠕動泵。
[0027]細胞截留裝置(如biosep，細胞沉降裝置，中空纖維裝置等)5可將細胞混合液中的細胞進行截留，得到的細胞上清液通過第三液體無菌推動裝置6 (如蠕動泵)將上清液推入到上清收集裝置7中，而截留下來的細胞通過細胞回流出口被第二液體無菌推動裝置(如蠕動泵)10推入細胞培養裝置4中，或者通過細胞培養控制裝置11控制啟動截留出口處的第四液體無菌推動裝置(如蠕動泵)9將截留下來的細胞推入截留細胞收集裝置8中。
[0028]上清收集裝置7為至少有二孔的可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過第三液體無菌推動裝置(如蠕動泵)6將截留后的細胞上清液送入該上清收集裝置7中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
[0029]截留細胞收集裝置8為有至少二孔的可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過第四液體無菌推動裝置(如蠕動泵)9將截留后的細胞懸液進入送入該截留細胞收集裝置8中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
[0030]
實施例
[0031]本實施例所用生物反應器等儀器和CHO細胞等試劑均為市售。
[0032]本實施例通過以下方法進行細胞特性篩選:
I)在生物反應器上安裝PH電極、溶氧電極、溶二氧化碳電極、液位電極和溫度電極，并將該些電極連接至安裝有探頭組數據信號接口和自制在線監控系統軟件的計算機(即細胞培養控制裝置11)上，設定溫度37° C，pH值7.1，溶氧濃度值45%，溶二氧化碳濃度5%，由加熱套控制溫度，電子可調節氣體流量閥控制C02，N2, O2和空氣四路進氣，用鼓泡供給的方法控制溶氧濃度和溶二氧化碳濃度，連接有lmol/L NaOH和lmol/L HCL的控速蠕動泵控制PH，根據液位電極的信號控制添加培養液到處理裝置的蠕動泵的速度，將培養液處理至設定值，以50轉的速度實現培養液的指標均勻，此處所用培養液為適用CHO細胞的普通細胞培養液；
2)細胞的初級培養
將CHO細胞以0.5 X IO6個細胞/ml的密度向生物反應器中接種，連續培養48小時，使細胞處于對數生長期；
3)細胞轉染
本實例選用直接轉染法，向一轉染復合物混合裝置(在本實例中為圓柱形裝置，有一個進液口和一個出液口，用多孔橡膠塞密封，橡膠塞孔上插入可控速、可定時攪拌裝置)中加入帶有抗G418的neomycin的pGMAX-FVIII重組質粒和細胞轉染液，120rpm攪拌5min,然后加入轉染介導試劑PEI MAX, 120rpm攪拌5min，攪拌結束后靜置孵育lOmin。其中質粒pGMAX-FVIII量為2 μ g/106個細胞，DNA:PEI=1: 2.5。通過蠕動泵將轉染復合物推入到細胞培養裝置中，細胞進行轉染。轉染后48小時開啟灌注，該灌注培養液為帶G418的細胞特性篩選培養液(即在上述普通細胞培養液中加入G418)，設定細胞培養各理化指標值分別為溫度37° C，PH值7.0，溶氧濃度值40%，葡萄糖濃度1.5g/L，G418濃度控制在600ug/ml，通過細胞培養控制裝置11控制來自動調節細胞培養裝置4的進液口和出液口的蠕動泵轉速，以維持設定的細胞生長環境，同時細胞培養控制裝置11根據生物反應器液位電極和溫度，PH，溶氧，溶二氧化碳電極的信號自動調節控制儲液裝置I中培養液添加的蠕動泵的轉速，以保證培養液的供應；
4)細胞篩選
在灌注培養的過程中，待細胞活率穩定后，每天在截留處截留掉20-40%的細胞，取樣測定FVIII的表達量，持續30天，最終細胞的表達量基本穩定維持在4IU/ml左右，請參見圖2 ；
5)細胞收獲
待細胞的比生長速率、及FVIII的表達量基本穩定后，即可進行收獲該細胞，該細胞即為所篩選細胞。圖2還示出了本實施例中FVIII細胞篩選過程中，FVIII表達量曲線，圖2中可看到FVIII的表達量在20天以后基本穩定維持在4IU/ml左右。
[0033]在本發明及上述實施例的教導下，本領域技術人員很容易預見到，本發明所列舉或例舉的各原料或其等同替換物、各加工方法或其等同替換物都能實現本發明，以及各原料和加工方法的參數上下限取值、區間值都能實現本發明，在此不一一列舉實施例。
【權利要求】
1.一種用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，包括儲液裝置、細胞培養裝置、細胞截留裝置、上清收集裝置、截留細胞收集裝置、多個可控速液體流動管道、多個液體無菌推動裝置、細胞培養控制裝置；其中， 儲液裝置通過一第一可控速液體流動管道與細胞培養裝置相連，一第一液體無菌推動裝置設置在儲液裝置與細胞培養裝置之間； 細胞培養裝置一端通過一第二可控速液體流動管道與細胞截留裝置截留前部分相連，細胞培養裝置另一端通過一第三可控速液體流動管道與細胞截留裝置的截流后部分相連，一第二液體無菌推動裝置設置在細胞培養裝置與細胞截留裝置的截流后部分之間； 細胞培養裝置與細胞培養控制裝置通過信號轉化輸出線相連； 細胞截留裝置的截留前一端與上清收集裝置相連，一第三液體無菌推動裝置設置在上清收集裝置與細胞截留裝置的截留前一端之間，細胞截留裝置的截留后一端與截留細胞收集裝置相連，一第四液體無菌推動裝置設置在截留細胞收集裝置與細胞截留裝置的截留后一端之間。
2.根據權利要求1 所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述儲液裝置為有至少三孔的可滅菌培養液儲存裝置，其中一孔可通過一第四可控速液體流動管道使無菌過濾后的培養液進入儲液裝置中，另一孔通過所述第一可控速液體流動管道將無菌過濾后的培養液推入細胞培養裝置中，又一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
3.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述細胞培養裝置為至少有培養液入口、培養液出口、細胞回流入口、若干氣體入口、細胞取樣口、堿入口、細胞接種口、若干探頭插入口，可高溫滅菌、密閉無菌進行細胞培養的裝置，該裝置能通過所述細胞培養控制裝置控制細胞培養過程中的各種參數。
4.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述細胞培養控制裝置為至少可保存和設置各種培養過程中的物理化學參數的控制器，該裝置可控制細胞培養過程的各種參數使得細胞最優化的生長或獲得目的產物。
5.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述可控速液體流動管道為可通過滑動控制閥或夾子控制培養液流速的管道。
6.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述液體無菌推動裝置為可無菌地推動管道內的液體流動的裝置。
7.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述細胞截留裝置至少設有細胞混合液入口、細胞上清液出口、細胞回流出口、截留出口；其中，所述細胞截留裝置的細胞混合液入口通過所述第二可控速液體流動管道與所述細胞培養裝置連接，用于將所述細胞培養裝置中的細胞混合液送入所述細胞截留裝置中；所述細胞截留裝置的細胞上清液出口通過所述第三液體無菌推動裝置與所述上清收集裝置連接，用于將細胞上清液推入到上清收集裝置中；所述細胞截留裝置的細胞回流出口通過所述第三可控速液體流動管道和所述第二液體無菌推動裝置與所述細胞培養裝置相連接，用于將截留下來的細胞通過細胞回流出口推入細胞培養裝置中；所述細胞截留裝置的截留出口通過所述第四液體無菌推動裝置與所述截留細胞收集裝置連接，用于將截留下來的細胞推入截留細胞收集裝置中；其中，截留下來的細胞可通過細胞回流出口回流進入所述細胞培養控制裝置中，或者通過截留出口進入所述截留細胞收集裝置中。
8.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述上清收集裝置為至少有二孔的可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第三液體無菌推動裝置將截留后的細胞上清液送入該上清收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
9.根據權利要求1所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述截留細胞收集裝置為有至少二孔可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第四液體無菌推動裝置將截留后的細胞懸液送入該截留細胞收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環境相通。
10.一種用生物反應器進行細胞特性篩選的方法，其特征在于，根據細胞在不同的細胞狀態條件下代謝率不同，在細胞特性篩選過程中通過加入細胞特性篩選培養液造成細胞的比生長速率不同，使比生長速率快的為所篩選細胞；在細胞培養裝置中細胞均勻分布，細胞培養裝置中的細胞通過細胞截留裝置后，通過液體無菌推動裝置將生長快和生長慢的細胞均勻的推入截留細胞收集裝置中，進而由于細胞比生長速率不同造成細胞培養裝置中生長快和生長慢的細胞的比例發生變化，比生長速率大的細胞與比生長速率小的細胞的比例變大，細胞截留裝置連續啟動，使得最終細胞培養裝置中的細胞均為比細胞生長速率大的細胞，從而篩選到 生長速率大的細胞。
11.根據權利要求9所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的方法，其特征在于，所述細胞特性篩選培養液為通過物理、化學、生物的因素對細胞生長速率進行調控。
12.根據權利要求10所述的用生物反應器進行細胞特性篩選的方法，其特征在于，包括如下步驟: 第一步，安裝、連接整套裝置并進行高溫滅菌； 第二步，在無菌操作臺里面向儲液裝置里加入細胞特性篩選培養液或普通細胞培養液，然后向細胞培養裝置里接種待篩選的細胞； 第三步，設定生物反應器的灌注、回流速度、截留細胞密度以及細胞培養裝置的灌注重量; 第四步，待細胞密度達到(2-10X106 cells/ml)時，進行細胞特性篩選；加入細胞特性篩選培養液，該細胞特性篩選培養液在相應液體無菌推動裝置作用下，通過可控速液體流動管道進入細胞培養裝置中，細胞在此細胞特性篩選培養液下生長；開啟細胞培養裝置處及細胞回流處設置的液體無菌推動裝置，以分別調節至設定灌注速度及設定回流速度；細胞培養控制裝置通過連續灌注稱的設定重量調控上清收集裝置處的液體無菌推動裝置的速度，使得細胞培養裝置的培養液總體積保持不變；當細胞密度高于設定的灌注細胞密度時，細胞培養控制裝置則啟動細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置，以將截留的部分細胞推至截留細胞收集裝置中，當細胞密度低于設定的灌注細胞密度時，細胞培養控制裝置則關閉細胞截留裝置處的液體無菌推動裝置，使得細胞密度維持在設定密度位置不變； 第五步，每天取樣進行陽性分析，待細胞培養裝置中絕大部分的細胞為預定的篩選細胞后則停止連續篩選。
【文檔編號】C12M1/36GK103981093SQ201410167289
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】齊念民, 鄭琛, 傅強, 莊超 申請人:上海泰因生物技術有限公司