一種復合微生態制劑、添加劑及其預混料的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種復合微生態制劑，具體涉及含枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的復合微生態制劑及其在豬日糧中的應用，屬于微生態制劑【技術領域】。本發明復合微生態制劑包含枯草芽孢桿菌CGMCC?No.8148菌粉和植物乳桿菌CGMCC?No.8150菌粉。本發明的復合微生態制劑可應用于仔豬、母豬、種公豬、育肥豬，能提高飼料利用效率，改善腸道微生態區系，促進豬生長，提高其免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善豬肉品質。
【專利說明】—種復合微生態制劑、添加劑及其預混料
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復合微生態制劑，主要涉及含枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的復合微生態制劑及其在豬日糧中的應用，屬于微生態制劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]目前，對動物疾病的預防和治療藥物基本仍采用抗生素，但由于長期、大量使用抗生素，致病菌耐藥性增強、菌群失調、免疫力下降、疾病復發率高、藥物殘留等種種弊端日益嚴重，同時也嚴重危害動物機體及人類健康。在此形勢下，改變養殖觀念、預防重于治療，并開發應用無毒、無藥殘的新型綠色飼料添加劑是必然趨勢。
[0003]微生態制劑是目前常用和研究較多的一種綠色、安全的飼料添加劑，此類制劑是用動物有益菌經工業化高密度發酵生產得到的，包含有很多的有益微生物及其代謝產物構成的活菌制劑，可以直接飼喂動物。微生態制劑通過維持腸道內微生態平衡而發揮作用，具有防病、增強機體免疫力、促進生長、增加體重等多種功能，且無污染，無殘留，不產生抗藥性，是一種綠色、安全 的飼料添加劑。
[0004]市場上的微生態產品種類繁多，質量參差不齊，主要存在以下幾個問題:(1)活菌含量低，而研究表明，如果一種菌在盲腸內容物中的濃度少于107cfu/g，則該菌產生的酶及其代謝產物不足以影響宿主，難以滿足治療需要；(2)水分含量偏高，這樣使得微生態制劑的保質期大大縮短，也是影響微生態制劑質量不好的重要原因之一 ；(3)不耐抗生素；(4)對胃酸和膽鹽不穩定，致使只有少數菌株進入腸道后仍具有活性，達不到發揮作用所需的活菌數量。由于微生態制劑存在的這些質量問題，從而影響了其在動物飼喂中的應用效果，限制了微生態制劑的廣泛應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種活菌含量高、水分含量低、具有耐胃酸、耐腸液、耐膽鹽、耐高溫等抗逆性能和產酸、產酶及抑制病原菌等益生功能的含枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌益生菌的復合微生態制劑。
[0006]首先,本發明提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subti I is)新菌株，其保藏號為CGMCC N0.8148。
[0007]其次,本發明提供一種植物乳桿菌Hactobacillus pIantarum)新菌株，其保藏號為 CGMCC N0.8150。
[0008]本發明還提供一種復合微生態制劑，該制劑包含枯草芽孢桿菌CGMCC N0.8148菌粉和植物乳桿菌CGMCC N0.8150菌粉。
[0009]其中，制劑中總活菌數為3~6X108_ncfu/g。
[0010]其中，枯草芽孢桿菌CGMCC N0.8148菌粉、植物乳桿菌CGMCC N0.8150菌粉的重量配比為1:0.8~1.2。
[0011]本發明的復合微生態制劑還可進一步包含載體，載體為石粉、葡萄糖、麩皮、玉米芯粉、米糖柏中的任一種或幾種。
[0012]在本發明具體實施方案中，本發明的復合微生態制劑包含枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉，載體為石粉，上述各成分的重量配比為1:0.8^1.2:3`6,即可制成豬通用型復合微生態制劑，總有益菌數達3飛X 109cfu/g ；
復合微生態制劑包含:枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為:1:0.8~1.2:2~3，即制成仔豬專用型復合微生態制劑，總有益菌含量3~6X109cfu/g ；
復合微生態制劑包含:枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和麩皮，上述各成分的重量配比為:1:0.Cl.2:2~3，即制成母豬專用型復合微生態制劑，總有益菌含量:TexiO9Cfu/g ;
復合微生態制劑包含:枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和玉米芯粉，上述各成分的重量配比為1:0.8^1.2:2^3,即制成種公豬專用型復合微生態制劑，益生菌總菌含量可達
3~6X109cfu/g。
[0013]復合微生態制劑包含:枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和米糠柏，上述各成分的重量配比為1:0.8^1.2:2^3,即制成育肥豬專用型復合微生態制劑，益生菌總菌含量可達:T6X109cfu/g。
[0014]本發明還提供含有所述微生態制劑的飼料添加劑。
[0015]其中，所述的添加劑還可含有本領域常規使用的飼料添加劑類型，如現有已經添加到飼料中的中草藥添加劑、多糖，如香菇多糖、靈芝多糖等。
[0016]本發明還提供了包含該復合微生態制劑的預混料，其中，預混料中復合微生態制劑添加的質量體積比為0.5-10%0。
[0017]本發明的另一目的在于提供該復合微生態制劑在豬日糧中應用。
[0018]其中，所述的枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌具有良好的耐胃酸、耐腸液、耐膽鹽(芽孢桿菌耐高溫)等抗逆性能和產酸、產酶、抑制病原菌等益生功能，為 申請人:從健康動物腸道中分離、選育得到，并于2013年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號分別為:CGMCC N0.8148、CGMCC N0.8150。
[0019]本發明所選育的枯草芽孢桿菌CGMCC N0.8148在人工模擬胃液(ρΗ2.0-4.0)中處理3h，存活率在65.8%以上；在人工模擬腸液中處理3h，存活率在74.7% ;在豬膽鹽溶液(濃度0.3~3g/kg)處理24h，存活率為51.2%以上；85~100°C處理3min，存活率為11.2%以上；對鏈霉素、多粘菌素B、林可霉素3種抗生素有耐藥性；可以產生一定量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶，且效果均優于申請號201110116641.X中所用的枯草芽孢桿菌 CGMCC N0.4628。
[0020]本發明所選育的植物乳桿菌CGMCC N0.8150在人工模擬胃液(ρΗ2.0-4.0)中處理3h，存活率在31.3%以上；在人工模擬腸液中處理3h，存活率在33.0% ;在豬膽鹽溶液(濃度
0.3^3g/kg)處理24h，存活率為3.7%以上；對頭孢吡肟、慶大霉素、大觀霉素、鏈霉素、多粘菌素B、環丙沙星、萬古霉素7種抗生素有耐藥性；對大腸桿菌K88、K99均有很好的抑制作用，抑菌圈直徑分別 為18.60mm、15.43mm。
[0021]本發明中所選育的枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉在制備中采用液體深層高密度發酵技術和噴霧干燥或者冷凍干燥一系列的后處理加工工藝技術制成菌粉，制劑中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃液、耐腸液、耐膽鹽、耐高溫等抗逆性能和產酸、產酶及抑制病原菌等益生功能。
[0022]本發明的復合微生態制劑可應用于仔豬、母豬、種公豬、育肥豬，能提高飼料利用效率，改善腸道微生態區系，促進豬生長，提高其免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善豬肉品質。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0024]實施例1優良菌種的的分離、篩選、選育及鑒定
1)增菌培養:將健康豬的新鮮腸道內容物樣品接種于LB液體培養基中，在37°C恒溫培養增殖48h ；
2)枯草芽孢桿菌的分離純化:對步驟I)增菌培養物80°C水浴20min，然后取處理液倍比稀釋、涂布于LB培養基中37°C培養24h，從中挑取各個具有特征形態的菌落，再劃線培養和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于4 C冰箱中，待用；
菌落形態:菌落圓整，表面光滑，呈乳白色，大小廣3mm;細胞圓形或卵圓形，直徑
0.5~1.0um，大多數成 短鏈或對，革蘭氏染色陽性。
[0025]經鑒定，分離出的菌株為枯草芽孢桿菌，并于2013年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0.8148。
[0026]3)植物乳桿菌的分離純化:對步驟I)增菌培養基倍比稀釋、涂布于MRS培養基中37°C培養36~48h，從中挑取各個具有特征形態的菌落再劃線培養和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；
菌落形態:菌落為軟而濕潤，乳酪色、有光澤、平坦或稍凸起、邊緣整齊；細胞為球形或卵形，直徑5~10 μ m,繁殖方式芽殖。
[0027]經鑒定，分離出的菌株為植物乳桿菌，并于2013年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0.8150。
[0028]實施例2 2株優良菌種的抗逆性和生物學性能測定
2株菌種:枯草芽孢桿菌CGMCC N0.8148和植物乳桿菌CGMCC N0.8150的生物學性能和抗逆性能測定:
1)枯草芽孢桿菌CGMCCN0.8148和地衣芽孢桿菌CGMCC N0.2383培養物的制備:將冰箱保藏的斜面菌種接種到LB種子培養基中活化，35°C、IOOrpm培養16h，即得；
2)植物乳桿菌CGMCCN0.8150培養物的制備:將冰箱保藏的斜面菌種接種到MRS種子培養基中活化，30°C、150rpm培養16h，即得；
3)耐酸性測定:將上述制備的培養物按10%接種量分別接種于pH值2.0,3.0,4.0的人工模擬胃液中，重新調pH值為2.0,3.0,4.0，Oh計數作對照，3h取樣用0.85%生理鹽水按10倍系列稀釋，進行平板活菌計數，計算存活率。
[0029]本發明選育的2株菌種:枯草芽孢桿菌CGMCC N0.8148和植物乳桿菌CGMCCN0.8150在胃酸中存活率結果見表1。
[0030]人工模擬胃液的制備:量取9.5%~10.5%濃鹽酸16.4毫升，加蒸餾水至1000毫升，做基礎人工胃液，用鹽酸或氫氧化鈉調pH值2.0、3.0、4.0，121°C下蒸汽滅菌15分鐘，按1%添加量添加胃蛋白酶，通過0.22 μ m無菌濾膜，制成人工胃液，取5mL (4.5mL)分裝于試管中。
[0031]表1 2株菌種在人工模擬胃液中的存活率
【權利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌{Bacillus subti I is)新菌株，其保藏號為CGMCC N0.8148。
2.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)新菌株，其保藏號為CGMCC N0.8150。
3.一種復合微生態制劑，該制劑包含枯草芽孢桿菌CGMCC N0.8148菌粉和植物乳桿菌CGMCC N0.8150 菌粉。
4.如權利要求3所述的復合微生態制劑，其特征在于，制劑中總活菌數為3~6 XIO8ncfu/g。
5.如權利要求3或4所述的復合微生態制劑，其特征在于，枯草芽孢桿菌CGMCCN0.8148菌粉、植物乳桿菌CGMCC N0.8150菌粉的重量配比為1:0.8~1.2。
6.如權利要求3或4所述的復合微生態制劑，其特征在于，還進一步包含載體，載體為石粉、葡萄糖、麩皮、玉米芯粉、米糠柏中的任一種或幾種。
7.如權利要求6所述的復合微生態制劑，其特征在于，包含枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉，載體為石粉，上述各成分的重量配比為1:0.8^1.2:4-6,總有益菌數為3 ~6X109cfu/g。
8.如權利要求6所述的復合微生態制劑，其特征在于，包含枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為:1:0.8^1.2:2^3,總有益菌含量為3 ~6X109cfu/g。
9.如權利要求6所述的復合微生態制劑，其特征在于，包含枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和麩皮，上述各成分的重量配比為:1:0.8~1.2:2~3，總有益菌含量為3 ~6X109cfu/g。
10.如權利要求6所述的復合微生態制劑，其特征在于，包含枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和玉米芯粉，上述各成分的重量配比為1:0.8~1.2:2~3，益生菌總菌含量為3 ~6X109cfu/g。
11.如權利要求6所述的復合微生態制劑，其特征在于，包含枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉和米糠柏，上述各成分的重量配比為1:0.8^1.2:2^3,益生菌總菌含量為3 ~6X109cfu/g。
12.含有權利要求3-11任一項所述的復合微生態制劑的飼料添加劑。
13.含有權利要求3-11任一項所述的復合微生態制劑的預混料，其特征在于，預混料中復合微生態制劑添加的質量體積比為0.5-10%。。
【文檔編號】C12R1/125GK103966124SQ201410167179
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】陸黎明, 張立彬, 黃梅丹, 戴佳佳, 溫燦權, 謝燕婷, 贠桂玲, 韓科廳 申請人:漳州大北農農牧科技有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司