一種熱激轉錄因子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種熱激轉錄因子、編碼所述熱激轉錄因子的核苷酸序列以及它們在提高植物耐熱性中的應用。所述熱激轉錄因子的過表達可以明顯地提高轉基因植物的耐熱性，而不會給植物帶來生長延遲和矮化的不良影響，因此，它在提高植物耐熱性的應用上具有獨特的優勢。
【專利說明】一種熱激轉錄因子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，具體涉及植物熱激轉錄因子及其應用。
【背景技術】
[0002]通過高溫預處理，植物可以獲得一定的耐熱性。作為一類重要的分子伴侶，熱激蛋白(heat shock proteins,Hsps)的積累在這一過程中發揮著關鍵的作用。熱激蛋白編碼基因的表達在轉錄水平受熱激轉錄因子(heat shock transcription factors, Hsfs)調控，后者通過結合在熱激蛋白基因啟動子區域內特異的熱激原件(heat shock element, HSE)上，進一步激活其表達(Vierling等，1991 ;Sun等,2002)。
[0003]Hsf基因首先從酵母中克隆，之后在果蠅、哺乳動物中也相繼得以克隆(Wul995;Morimotol998 ;Sch6ffl等，1998 ;Nover等，2001)。熱激轉錄因子主要包括以下幾個重要的結構域:DNA 結合域(DNA binding domain, DBD)、寡聚域(oligomerization domain, 0D)、核定位信號(nuclea r localization signal,NLS)和轉錄激活域(activator domain, AD)(Damberger 等，1994 ;Harrison 等，1994 ;Vuister 等，1994 ;Wul995 ;Nover 等，1996 ;Schultheiss 等，1996)。
[0004]與酵母、果蠅、哺乳動物只有I個Hsf不同，植物擁有多個，且根據上述重要的結構元件，將其分為A，B, C三類(請參見圖1)。大量研究表明，只有A類Hsf自身擁有轉錄激活功能，可以獨立地完成基因表達的調控。而大量的B類和C類成員，本身沒有轉錄激活功能。番茄中的HsfBl是一類共激活子，與A類Hsf協同作用(Bharti等，2004)。擬南芥BI是 A 類成員的抑制子(Czarnecka-Verner 等，2000 ；Czarnecka-Verner 等，2004)。
[0005]番茄中，HsfAla是誘導耐熱性的主要調節者(Mishra等，2002)，而HsfA2是I個嚴格受熱激誘導的Hsf，而且它在熱脅迫和恢復循環中具有較高的激活潛力，并且能連續積累，因此，HsfA2被認為是耐熱性細胞中的I個統治性的Hsf，它不但能激活Hsp的轉錄，還可以激活抗壞血酸過氧化物酶Apx基因(Apx2)的表達(Scharf等，1998a, b ;Morimoto2002 ;Busch等，2005)。過表達LpHsfAla的番爺表現出較好的熱耐受性Mishra等,2002);過表達AtHsfA2不僅可以提聞轉基因擬南介耐熱和鹽脅迫的能力，還可以促進根系愈傷的形成(Nishizawa et al，2006)。過量表達0sHsfA2e可以明顯提高轉基因擬南芥植株對熱和過氫化氫的耐受性(Yokotani等，2008)。過量表達HsfA類基因，如AtHsfA2和0sHsfA2e，均可以提高轉基因植物在逆境下的耐受性，然而伴隨著耐熱和耐鹽性的提高，植株表現出了生長延遲、矮化的現象。
[0006]因此，在轉基因植物的抗性研究尤其是抗熱性和耐鹽性研究中非常需要獲得在保證耐熱性的同時能夠防止生長延遲、矮化等現象發生的熱激轉錄因子。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種在保證耐熱性的同時還能夠防止生長延遲、矮化等現象發生的熱激轉錄因子。本發明的目的是通過如下技術方案來實現的。[0008]1、一種熱激轉錄因子，其中，所述熱激轉錄因子與SEQ N0.2具有至少50%，例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0009]2、一種熱激轉錄因子，其中，所述熱激轉錄因子由與SEQ N0.1具有至少50%例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的核苷酸序列編碼。
[0010]3、一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ N0.1具有至少50%，例如60%、70%、80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0011]4、用于克隆如技術方案I或2所述的轉錄因子或技術方案3所述的核苷酸序列的引物，所述引物選自由SEQ N0.3至SEQ N0.11組成的組。
[0012]5、由技術方案4所述的引物克隆得到的產物，優選的是，所述產物從百合植物中克隆得到。
[0013]6、一種載體,所述載體包含如技術方案3所述的核苷酸序列。
[0014]7、如技術方案6所述的載體,其中,所述載體為質粒載體或者表達載體。
[0015]8、一種 宿主細胞，所述宿主細胞包含如技術方案3所述的核苷酸序列。
[0016]9、一種克隆如技術方案I或2所述的熱激轉錄因子或技術方案3所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用如技術方案4所述的引物進行克隆。
[0017]10、如技術方案I或2所述的熱激轉錄因子或者如技術方案3所述的核苷酸序列在提高植物耐熱性的同時防止植株矮化或生產延遲中的應用。
[0018]本發明所提供的熱激轉錄因子的過量表達明顯提高擬南芥耐熱性狀，沒有提高其耐鹽性。更重要的是，過量表達不會造成轉基因植株生長的延遲和矮化，這將使百合熱激轉錄因子(Hsf)編碼基因LlHsfA2在改善植物耐熱性狀的應用上具有獨特的優勢。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1顯示了熱激轉錄因子結構與分類。從N端到C端分別是DBD:DNA結合域；0D:寡聚域；NLS:核定位信號；AD:轉錄激活域和NES:核輸出信號。
[0020]圖2顯示了 LlHsfA2氨基酸多序列比對、DNA結合域三維結構和分子進化分析。其中，A:LlHsfA2 (百合)，AtHsfA2 (擬南芥)，LpHsfA2 (蕃茄)和0sHsfA2 (水稻)的多序列比對，DBD: DNA結合域；OD:寡聚域；NLS:核定位信號；NES:核輸出信號。陰影背景下劃實線序列:AD-1 (轉錄激活域-1);陰影背景下劃虛線序列:AD-2(轉錄激活域
的DNA結合域三維結構圖，α代表α螺旋；β代表β折疊；Τ代表轉角。C:LlHsfA2和已知的HsfA2的DNA結合域序列的進化樹分析。黑點標注為LlHsfA2。
[0021]圖3顯示了 LlHsfA2的表達模式。其中，A:LlHsfA2在熱(37°C )，ImM過氧化氫(H2O2)和IOOmM氯化鈉(NaCl)處理下的表達情況；B:37°C下，LlHsfA2在根(R)，莖(B)和Rf (L)中的表達情況。C(Control);對照；H:37°C熱激處理I小時；C:37°C下，LlHsfA2在百合‘白天堂’和‘元帥’中的表達情況。
[0022]圖4顯不了綠色滅光蛋白亞細胞定位(A:綠色滅光蛋白對照；B:綠色滅光蛋白融合 LlHsfA2)。
[0023]圖5顯示了轉LlHsfA2擬南芥生長情況。A:幼苗期野生型和3個獨立的轉基因株系(2-5、4-7和7-6) ；B:生育期野生型和3個獨立的轉基因株系。[0024]圖6顯示了轉LlHsf A2擬南芥分子和生理水平檢測。野生型和3個獨立的轉基因株系(2-5、4-7 和 7-6)。其中，A:百合 LlHsfA2，和擬南芥 AtHsplOl，AtHsp25 及 AtApx2 的表達情況；B:擬南芥Apx酶活性；C:擬南芥AsA含量。
[0025]圖7顯示了轉LlHsfA2的3個株系(2_5、4_7和7_6)和野生型擬南芥耐熱性測定。其中，A:未高溫處理的野生型和轉基因擬南芥幼苗；B:經45°C高溫處理Ih的野生型和轉基因擬南芥幼苗。
【具體實施方式】
[0026]本發明在第一方面提供了一種熱激轉錄因子，其中，所述熱激轉錄因子與SEQN0.2 具有至少 50 %，例如 60 %、70%、80 %、90 %、91 %、92 %、95 %、97%、98 %、99% 或100%的同一性。在一些實施方式中，所述熱激轉錄因子可以由與SEQ N0.1具有至少50%例如 60%,70%,80%,90%, 91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性的核苷酸
序列編碼。
[0027]本發明在第二方面提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ N0.1具有至少50%，例如 60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性。
[0028]本發明在第三方面提供了用于克隆上述熱激轉錄因子或上述核苷酸序列的引物，所述引物選自由SEQ N0.3至SEQ N0.11組成的組。所述引物對可以用于克隆如上所述的熱激轉錄因子或者其核苷酸序列，或者可以用于對所述熱激轉錄因子進行檢測。
[0029]本發明在第四方面提供如上所述的引物對克隆得到的產物。在一些實施方式中，所述產物從百合植物中克隆得到。所述產物可以是所述引物對直接克隆得到的產物，例如單鏈或者雙鏈的DNA，或者可以是間接產物，例如由所述直接產物翻譯得到的氨基酸序列。
[0030]本發明在第五方面提供了一種載體，所述載體如上所述的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述載體可以為質粒載體。在另外一些實施方式中，所述載體可以為表達載體。
[0031]本發明在第六方面提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含如上所述的核苷酸序列，所述宿主可以例如為大腸桿菌等。
[0032]本發明在第七方面提供了一種克隆如上所述的熱激轉錄因子的方法，所述方法采用如上所述的引物進行克隆。
[0033]本發明在第八方面提供了如上所述的熱激轉錄因子或者如上所述的核苷酸序列在改變植物耐熱性上的應用。所述應用根據應用目的，例如可以通過將上述熱激轉錄因子轉入目標植物以使該熱激轉錄因子過表達，或者根據需要使目標植物內的所述轉錄因子基因沉默。在一些優選的實施方式中，所述改變植物耐熱性是提高植物耐熱性。
[0034]下文將通過實施例對本發明進行進一步的說明。應當理解的是，這些實施例僅僅出于說明目的，不應被理解為是對本發明請求保護的范圍的限制。
[0035]實施例
[0036]實驗材料將從鐵炮百合‘白天堂’(Liliumlongiflorum Thunb.var.scabrumMasamune, ‘White heaven’)小鱗莖上分化的小苗在MS培養基上生長30天，將其置于37°C處理I小時，取其葉片，用于RNA的提取。
[0037]基因克隆
[0038]米用Invitrogen Trizol reagent (貨號:15596-026)進行總 RNA 提取，具體操作如下:
[0039]具體步驟
[0040]I)取新鮮葉片0.1g(克)放入1.5ml (毫升)離心管中，加入少量液氮。
[0041]2)待液氮即將揮發完時，用研杵快速將材料研成粉末，加入1mlTrizol，充分混勻。
[0042]3)室溫放置3min (分鐘)，加入200 μ I氯仿，劇烈震蕩30s (秒)，室溫放置5min。
[0043]4) 4°C，12，OOOg離心15min，將上清小心移入I個新的離心管中。
[0044]5)加入400 μ I異丙醇，室溫放置IOmin, 12, 000離心10min0
[0045]6)棄上清，加入lml75%乙醇漂洗一次，放入超凈臺中吹干lOmin。
[0046]7)每個樣品加入20 μ I DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的ddH20(雙蒸水)，65°C助溶lOmin，之后可用于下步實驗或保存于-20°C備用。
[0047]用Invitrogen Super Script II (貨號:18064-014)對 I μ g RNA 進行逆轉錄反應，操作如下:
[0048]I)在200 μ I離心管中加入I μ 120 μ M引物，I μ IlOmM dNTP Mix (寶生物工程公司)，8 μ I 總 RNA。
[0049]2) 65°C保溫5min，迅速轉移止冰上2min。
[0050]3)依次加入下列成份，輕柔混勻。
[0051]
【權利要求】
1.一種熱激轉錄因子，其中，所述熱激轉錄因子與SEQ N0.2具有至少50%，例如60%、70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
2.一種熱激轉錄因子，其中，所述熱激轉錄因子由與SEQ N0.1具有至少50%例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的核苷酸序列編碼。
3.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ N0.1具有至少50%，例如60 %、70 %、80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
4.用于克隆如權利要求1或2所述的轉錄因子或權利要求3所述的核苷酸序列的引物，所述引物選自由SEQ N0.3至SEQ N0.11組成的組。
5.由權利要求4所述的引物克隆得到的產物，優選的是，所述產物從百合植物中克隆得到。
6.一種載體,所述載體包含如權利要求3所述的核苷酸序列。
7.如權利要求6所述的載體，其中，所述載體為質粒載體或者表達載體。
8.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含如權利要求3所述的核苷酸序列。
9.一種克隆如權利要求1或2所述的熱激轉錄因子或權利要求3所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用如權利要求4所述的引物進行克隆。
10.如權利要求1或2所述的熱激轉錄因子或者如權利要求3所述的核苷酸序列在提高植物耐熱性的同時防 止植株矮化或生產延遲中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103923198SQ201410168600
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】辛海波, 張華 , 張華麗, 連青龍, 鐘雄輝, 王濤, 宋利娜, 趙正楠, 董愛香, 義鳴放, 叢日晨 申請人:北京市園林科學研究院