長鏈非編碼gas5缺陷的人a375穩轉細胞株及構建方法
【專利摘要】本發明屬于醫學分子生物學領域。本發明所述的長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株是將設計合成的F鏈5’-GATCCTGGCACAAGAAGATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCATTTTTG-3’和R鏈5’-AATTCAAAAATGGCACAAGAATATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCAG-3’經退火形成DNA雙鏈，然后插入慢病毒載體pLVX-shRNA2中，再感染A375細胞，使得這一DNA雙鏈整合到A375細胞的基因組中，靶向敲減A375細胞內源性GAS5表達90％以上的穩轉細胞株。與傳統的反義核酸技術相比，本發明具有特異性強、針對性強、級聯放大等優點。
【專利說明】長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株及構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學分子生物學領域。
【背景技術】 [0002]人類2萬個左右的蛋白編碼基因只占到整個基因組的2%，而90%以上的人類基因組都是發生了轉錄的，這就意味著相當數量的轉錄本是不編碼蛋白質的，這部分轉錄本被稱為“非編碼RNA” (non-codingRNA, ncRNA)。之前它們被認為是轉錄“噪音”，然而越來越多的研究表明ncRNA在細胞生長、分化及代謝等過程中發揮著重要的生物功能。依據ncRNA的長度將其分為兩類，長度在200個核苷酸以下的稱為短鏈非編碼RNA，長度在200個核苷酸以上的則稱之為長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA，IncRNA)。短鏈非編碼RNA包括長度在21-23nt之間的微小RNA (microRNAormiRNA)、小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA, siRNA)、核內小分子 RNA(smallnucleolarRNA, snoRNA)以及與piwi蛋白相互作用的RNA(piwi_interactingRNAs, piRNAs)等。IncRNA的研究相對較少，但是近年來發現IncRNA在表觀遺傳學水平、轉錄水平、轉錄后水平及翻譯水平廣泛參與基因表達的調控。IncRNA除了與系統性紅斑狼瘡、Alzheimer及心腦血管疾病等多種疾病的發生發展相關外，還與多種腫瘤的發生關系密切，其中部分IncRNA與黑色素瘤的發生發展關系密切。
[0003]長鏈非編碼RNA生長阻滯特異性轉錄本5 (GrowthArrestSpecif ictranscript5, GAS5)的基因定位于lq25.1，包含12個外顯子和11個內含子，其基因全長為4087bp，成熟的GAS5轉錄本為651nt。GAS5最早是在1988年研究對生長阻滯敏感的基因時發現，這一轉錄本的表達具有組織特異性，在生長活躍的細胞中表達水平極低，但是在生長阻滯的細胞中表達水平明顯升高。近年發現GAS5調控T淋巴細胞正常情況下的生長阻滯，并且在哺乳動物雷帕霉素革G體蛋白(mammaliantargetofRapamycin, mTOR)拮抗劑產生的T淋巴細胞分化抑制過程中，需依賴GAS5的參與。Mourtada等認為GAS5發揮功能主要通過其內含子編碼的核內小分子RNA (smallnucleolarRNA, snoRNA)。GAS5具有不同的轉錄本，不同的轉錄本在不同的細胞株中功能相差很大，其中的GAS51B、GAS52B、GAS53A、GAS54A在不同的細胞系中過表達以后，會增加細胞對凋亡的敏感性，GAS5-01在乳腺癌中明顯低于其他轉錄本。
[0004]目前尚沒有發現有關長鏈非編碼RNAGAS5與黑色素瘤發生發展關系的文獻報道。
[0005]黑色素瘤是發生于皮膚黑色素細胞的惡性腫瘤，惡性程度高，預后極差，發病率在全球范圍內呈現升高趨勢。根據美國癌癥協會2013年發布的數據，在大多數惡性腫瘤發病率和死亡率均下降的情況下，黑色素瘤的發病率依然卻呈現上升趨勢，年增長率在
2.5% -3.9%之間。全球每年黑色素瘤新發病例199627例，死亡例數為46372例。雖然黑色素瘤在我國發病率較低，但近年來成倍增長，2000年發病率統計僅為0.2/10萬，2005-2007年我國發病率約1/10萬，每年新發病例約2萬人。黑色素瘤已經成為嚴重危及我國人民健康的疾病之一。盡管有學者提出，黑色素瘤的發生是遺傳與環境共同作用的結果，如容易形成色素痣及過多暴露于陽光下等，但是發病的分子機制仍未闡明，深入了解黑色素瘤發生發展機制和尋找有效治療方法目前亟待解決的問題。
【發明內容】
[0006]本發明的目的旨在提供一種長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株，作為模型用于研究GAS5與腫瘤的相關性及其可能的機制。
[0007]本發明的另一目的在于提供這種細胞株的構建方法。
[0008]本發明所述的長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株是將設計合成的F鏈5’ -GATCCTGGCACAAGAAGATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCATTTTTG-3’ 和 R鏈
[0009]5，-AATTCAAAAATGGCACAAGAATATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCAG-3，經退火形成DNA雙鏈，然后插入慢病毒載體pLVX-shRNA2中，再感染A375細胞，使得這一 DNA雙鏈整合到A375細胞的基因組中，靶向敲減A375細胞內源性GAS5表達90%以上的穩轉細胞株。[0010]上述的A375細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。該細胞株來源于一位54歲的女性，是D.J.Giard等人建立的一系列細胞株中的一株。該細胞屬上皮細胞，貼壁生長，具有致瘤性，它在抗胸腺細胞球蛋白(免疫抑制劑)、血清處理的NIH瑞士小鼠中形成類似于惡性黑素瘤的快速增長的皮下腫瘤。經細胞遺傳學分析顯示此細胞是含有62條染色體的亞三倍體細胞，其中9條標記染色體，其DNA上的STR位點有:Amelogenin:X ;CSF1P0:11，12 ;D13S317:11，14 ；D16S539:9 ;D5S818:12 ；D7S820:9 ；THOl:8 ；TPOX:8, 10及vWA:16，17。本發明所述的長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株是將上述DNA雙鏈片段插入含ZsGreenl綠色熒光蛋白基因的pLVX_shRNA2表達載體，再轉入A375細胞株，在細胞中表達siRNA，經陽性細胞克隆篩選，qRT-PCR定量檢測顯示siRNA靶向沉默了內源性GAS5的表達量達90%以上，經多次傳代培養，熒光強度穩定且干擾效率未降低。
[0011]本發明所述的長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株的構建方法由以下步驟組成:
[0012]一、shRNA序列設計與合成
[0013]干擾序列由TBI在線程序設計，根據干擾序列設計互補序列，經添加BamHI和EcoRI酶切位點、6個核苷酸的loop結構發卡環和保護性堿基制備成靶向人GAS5的shRNA的F鏈，依據堿基互補配對合成R鏈；
[0014]二、構建shRNA-慢病毒表達載體
[0015]將設計好的shRNAF鏈和R鏈單鏈等體積混合，煮沸，退火后形成雙鏈；BamHI和EcoRI雙酶切慢病毒載體pLVX-shRNA2使之成為線性質粒，shRNA雙鏈與線性質粒在T4DNA連接酶作用下連接形成重組質粒，重組質粒轉化E.coliDH5 α感受態細菌，含氨芐青霉素的LB固體培養基平板涂布，培養過夜，挑選陽性菌落擴增培養，提取質粒測序鑒定，shRNA-慢病毒表達載體構建成功；
[0016]三、慢病毒包裝與生產
[0017]病毒包裝質粒和重組質粒pLVX_shRNA2-GAS5_shRNA 通過 lipofectamine2000 共轉染293T細胞，6h后取出培養皿，棄去培養基，I XPBS清洗細胞3次，輕柔地加入8ml新鮮的293T培養基，繼續培養；細胞轉染36h后，收集培養基上清液作為慢病毒液，之后每3h收集一次,共收集3-4次；每次收集的病毒上清液用0.45 μ m的針頭濾器過濾，以去除293T細胞；
[0018]四、慢病毒感染A375細胞
[0019]根據預實驗確定細胞所需感染復數以及病毒對細胞狀態和傳代的影響，感染復數定義為感染時病毒和細胞數量的比值，病毒感染細胞前，用胰酶消化處于生長對數期的A375細胞，離心后用無抗生素的培養基重懸細胞，并進行細胞計數；取5X IO5個A375細胞接種于培養皿中，待細胞貼壁后，向培養皿中加入2ml溫浴后的病毒上清液，加入終濃度為2 μ g/ml的聚凝胺Polybrane ;培養3h，棄去培養基，更換2ml病毒上清液繼續培養，重復2次；
[0020]五、A375-GAS5 Λ穩轉細胞株篩選和鑒定
[0021]Α375細胞經病毒上清液感染3次后，向培養皿中加入無抗生素的培養基，培養48h后，棄去培養基，換用含氨芐青霉素Ampicillin的培養基并篩選陽性細胞；隔日觀察細胞，棄去原培養基及死細胞，I XPBS清洗細胞3次，更換抗性培養基唏噓培養細胞，持續篩選7天；待細胞長滿，消化細胞，接種于IOmm培養皿中擴增培養，傳代3次；篩選后置于熒光顯微鏡下觀察，所有細胞均呈現出高亮的綠色熒光；進一步行qRT-PCR檢測GAS5的表達，結果顯示A375-GAS5 Λ細胞株中GAS5的表達量較Α375細胞下降了 93.74%，干擾效率達到預期，長鏈非編碼GAS5缺陷的人Α375穩轉細胞株構建成功。
[0022]目前國內外文獻中尚未見到GAS5缺陷的人黑色素瘤Α375穩轉細胞株及其相關研究的報道。本申請應用shRNA-慢病毒系統沉默Α375細胞內源性GAS5的表達，構建了 GAS5缺陷的Α375穩轉細胞株(A375-GAS5 Δ )，并對其GAS5的表達進行了檢測。本模型可用于探究長鏈非編碼RNAGAS5與腫瘤的相關性及其機理；為深入研究長鏈非編碼RNAGAS5與黑色素瘤發生發展的可能機制奠定材料基礎。
[0023]本申請構建的GAS5缺陷的Α375細胞的方法不同于現有技術。一方面RNAi技術是近幾年快速發展起來的一項基因沉默技術，其機制為:在生物體細胞內，外源性或者內源性的雙鏈RNA(double-strandedRNA, dsRNA)引起同源mRNA特異性的講解,從而抑制目的基因表達的技術。與傳統的反義核酸技術相比，具有特異性強、針對性強、級聯放大等優點。另一方面，通過構建pLVX-shRNA2-GAS5-shRNA重組載體并生成慢病毒顆粒感染A375細胞，將攜帶GAS5-shRNA的DNA模板隨病毒基因組整合到A375細胞基因組。由于pLVX_shRNA2載體具有U6啟動子能啟動GAS5-shRNA的表達，GAS5-shRNA自身形成發卡結構，細胞核內表達的GAS5-shRNA轉運至細胞質后在Dicer酶的作用下被切割成GAS5_siRNA，經由RISC復合物介導特異性地沉默靶基因。所使用的pLVX-shRNA2載體具有氨芐青霉素抗性，可用于單克隆細胞挑選。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是質粒pLVX_shRNA2的物理圖譜。
[0025]圖2是干擾序列的測序結果圖。
[0026]圖3是qRT-PCR檢測干擾效率結果圖。
[0027]圖4是病毒感染細胞顯微圖40X。
[0028]圖5是qRT-PCR檢測穩轉細胞株中GAS5的表達量。【具體實施方式】
[0029]1.選擇干擾載體及設計合成shRNA模板DNA
[0030]選取PLVX-shRNA2作為干擾載體，GAS5 (NR_002578.2)的3條干擾序列及無關對照序列由 TBI 在線數據庫設計(http://RNA.tb1.univie.ac.at/cg1-bin/RNAxs),經添加酶切位點、發卡環和保護性堿基制備成靶向人GAS5的siRNA的F鏈，依據堿基互補配對原則合成R鏈。
[0031 ] 2.shRNA模板DNA插入載體
[0032]將設計好的GAS5shRNA的F鏈與R鏈分別等體積混合后，沸水浴中煮沸5min，然后72°C保持15min，自然冷卻至室溫，約60min，備用。載體雙酶切，在無菌的0.2mLEP反應管，取pLVX-shRNA2載體15 μ L，用BamHI與EcoRI雙酶切，酶切體系按照說明書配制，混勻后，37°C反應4h以上，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切產物，最終得到洗脫出的DNA。將制備好的GAS5shRNAl， 2，3片段各4 μ L與載體I μ L，及T4DNALigase等配備反應體系16°C連接2h，如圖1所示。
[0033]3.重組干擾載體轉化DH5ci感受態細菌并鑒定
[0034]連接產物的轉化，冰浴中將5 μ L連接產物分別加入至50 μ LDH5 α感受態細胞中，輕輕旋轉混勻，冰浴30min，42°C水浴熱休克90min，快速將管轉移至冰浴中，冰浴2min后加入200 μ LLB培養基，混勻，37°C、200rpm振蕩培養lh，于超凈工作臺中，將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素(Amp) (100yg/mL)的LB平板上，室溫下放置，倒置平板，轉移入37°C生化培養箱過夜培養。次日觀察LB培養基濁度，超凈臺內取600 μ I菌液，加入280 μ I甘油混勻，-20°C保存，其余菌液采用帶有純化柱的高純質粒小量提取試劑盒，按照說明書操作。提取后的重組干擾載體送華大基因進行測序，測序結構顯示重組載體構建成功，如圖2所示。
[0035]4.慢病毒包裝與生產
[0036]293T細胞經復蘇，傳代，當細胞密度達70%-80%時即可用于轉染。轉染前2個小時，將細胞培養基更換為無雙抗完全培養基，準備DNA沉淀液。將40μ LLipOfectamine2000和1.46ml完全培養基加入到1.5mlEP管中(標記為A管)；在另一 1.5mlEP管(標記為B管)中加入DNA沉淀液,重組質粒及包裝質粒共1.5ml,慢病毒包裝質粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)按照1:1:1比例混合。將B管中的DNA沉淀液緩緩地逐滴加入到A管中，輕輕混勻。在室溫靜置一段時間后，將沉淀混合物逐滴均勻加入到IOcm細胞培養皿中，輕輕晃動，放入37°C、5% C02培養箱中培養。轉染次日早上，棄去舊培養基，每皿加入IOml新鮮完全培養基(含I %雙抗)。收集病毒，分別收集轉染24h和48h的含病毒培養上清液，1000rpm離心5min,上清用0.45 μ m針頭濾器過濾，以去除293T細胞；4°C、50000g高速離心2h，棄上清液，病毒沉淀用ImlPBS充分溶解，再用0.22 μ m針頭濾器過濾，除去可能的細菌(細菌直徑一般0.5 μ m),取出一部分病毒-80 °C保存留作后用。
[0037]5.慢病毒感染A375細胞
[0038]根據預實驗確定感染復數:準備2個無菌的1.5mLEp管，在每個管中加入45 μ L的常規培養基，吸取5 μ L的I X 108TU/mL的病毒(預先從-80°c取出在冰上融化)加入到第一個管中，輕柔混勻，勿使產生泡沫。同樣從第一管中吸取5μ L的病毒到第二個管中，混勻，第一個管中的病毒滴度為I X 107TU/mL,而第二個管中的滴度為I X 106TU/mL ;將10 μ L三個不同梯度的病毒加到各組的相應孔中。加入的病毒量分別為I X IO6TU, I X IO5TU, I X IO4TU,細胞的數目為IXIO4個，三個孔的MOI分別為100、10、I ;在水平方向輕輕拍打培養板，使培養基和病毒等試劑充分混勻，然后把細胞板放回培養箱孵育；培養8~12h以后觀察細胞狀態，棄去細胞上清液，更換為新鮮培養基。感染2~3天后，觀察熒光表達情況，通過觀察細胞感染效果，確認目的細胞的感染最佳MOI為100。取密度為IXlO6Ail的A375細胞5ml，加入滴度為IX 108TU/mL的病毒5ml，充分混勻后放回CO2培養箱孵育；12小時后更換新鮮培養基；72小時后觀察熒光表達情況，發現絕大多數細胞呈現綠色熒光。
[0039]注:Μ0Ι:是“Multiplicityoflnfection”的縮寫，中文為感染復數或者復感染指數，含義為感染時病毒和細胞數量的比值。 [0040]6.熒光定量PCR檢測瞬時轉染后3個重組載體的干擾效率
[0041]細胞內總RNA提取:瞬轉后細胞培養于6孔板中，當細胞匯合度達到約80%時，棄去培養基，加入預冷的IXPBS溶液Iml清洗細胞I次，加入RNAisoPluslml/well，槍頭吹打，使細胞充分裂解；室溫放置5min后轉移至1.5mlEP管(DEPC處理)中，加入氯仿0.2ml,用力振搖15s。室溫靜置5min后，離心(4°C，12000rpm, 15min)。離心后液體分為三層(無色上清液，中層白色蛋白層和底層紅色有機層)。小心吸取上清液并轉移至另一支EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，-2(TC下靜置30min,離心(4?，12000rpm, IOmin)。棄去上清液，加入lml75%乙醇，溫和振蕩懸浮沉淀，離心(4°C，12000rpm, 5min)，盡量棄去乙醇，管內沉淀在超凈臺中鼓風靜置干燥3-5min。后每管加入20-50 μ I水(DEPC處理)溶解。
[0042]逆轉錄合成cDNA:取總 RNA2ng_2 μ g，用 ReverseTranscriptaseM-MLV 逆轉錄酶，按說明合成cDNA。具體步驟:先在總RNA中加入2μ I隨機引物(濃度為25 μ Μ)，加水(DEPC處理)補足至12 μ 1，混勻，70°C溫育IOmin后，冰浴急冷2min。依次加入RNA酶抑制劑 0.5 μ I,5XM-MLVBuffer4μ 1，RTaseM-MLV(200U/μ 1)0.5 μ 1，dNTPMixture (各IOmM) I μ 1，加水(DEPC處理)補足至20μ 1，30°C反應lOmin，再42°C保溫lh，最后70°C保溫15min滅活反轉錄酶后冰上冷卻。
[0043]熒光定量PCR:按說明書配置反應體系，上機進行PCR擴增和檢測。反應總體系為20 μ 1，具體是2 X MixSYBRGreenI熒光反應液10μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各0.25μ 1，樣品模板I μ I，用滅菌水補足20 μ I體系。反應條件95°C 2min預變性，循環內95°C 30s變性，60°C退火35s，PCR反應設置40個循環，并在每個循環延伸末收集熒光信號，繪制擴增曲線。40個循環后設置(95°C 15s，60°C 30s, 95°C 15s)反應步驟，并且對60°C到95°C升溫過程進行全程突光信號收集，繪制融解曲線。用Bio-RadCFXManagerversionl.6軟件進行數據分析，如圖3所示。
[0044]7.重組干擾載體干擾效率篩選及缺陷GAS5的A375-GAS5 Λ穩轉細胞株構建
[0045]根據熒光定量PCR檢測結果篩選出干擾效率最高的重組載體對應的病毒顆粒進行后續試驗。將該病毒顆粒反復多次感染Α375細胞，具體操作為:A375-WT細胞經病毒上清液感染3次后，向培養皿中加入無抗生素的DMEM(10% FBS)培養基，37°C，5% C02條件下培養48h后，棄去培養基，更換帶有Ampicillin (0.5 μ g/ml)的培養基培養以篩選陽性克隆。待細胞長滿時，消化細胞，接種于IOmm培養皿中擴增培養，隔日觀察細胞，棄去原培養基及死細胞，IXPBS清洗細胞3次，更換DMEM(10% FBS, 0.5 μ g/mlAmpicillin)培養基繼續培養細胞，傳代3次后于熒光顯微鏡下觀察，視野下全部細胞均帶有綠色熒光，提示慢病毒載體成功感染A375細胞,如圖4所示。[0046]8.GAS5缺陷的A375-GAS5 Λ穩轉細胞株篩選及鑒定
[0047]熒光定量PCR鑒定A375-GAS5 Λ穩轉細胞株:熒光定量PCR檢測A375-GAS5 Λ穩轉細胞內GAS5 Δ mRNA表達水平。總RNA提取、逆轉錄合成cDNA和熒光定量PCR過程同前，如圖5所示。
【權利要求】
1.一種長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株，其特征在于是將設計合成的F鏈
5’ -GATCCTGGCACAAGAAGATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCATTTTTG-3’ 和 R鏈 5，-AATTCAAAAATGGCACAAGAATATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCAG-3 ’ 經退火形成DNA雙鏈，然后插入慢病毒載體pLVX-shRNA2中，再感染A375細胞，使得這一 DNA雙鏈整合到A375細胞的基因組中，靶向敲減A375細胞內源性GAS5表達90%以上的穩轉細胞株。
2.如權利要求1所述的長鏈非編碼GAS5缺陷的人A375穩轉細胞株的構建方法，其特征在于由以下步驟組成: 一、shRNA序列設計與合成 干擾序列由TBI在線程序設計，根據干擾序列設計互補序列，經添加BamHI和EcoRI酶切位點、6個核苷酸的loop結構發卡環和保護性堿基制備成靶向人GAS5的shRNA的F鏈，依據堿基互補配對合成R鏈； 二、構建shRNA-慢病毒表達載體 將設計好的shRNAF鏈和R鏈單鏈等體積混合，煮沸，退火后形成雙鏈；BamHI和EcoRI雙酶切慢病毒載體pLVX_shRNA2使之成為線性質粒，shRNA雙鏈與線性質粒在T4DNA連接酶作用下連接形成重組質粒，重組質粒轉化E.coliDH5a感受態細菌，含氨芐青霉素的LB固體培養基平板涂布，培養過夜，挑選陽性菌落擴增培養，提取質粒測序鑒定，shRNA-慢病毒表達載體構建成功； 三、慢病毒包裝與生產 病毒包裝質粒和重組質粒pLVX-shRNA2-GAS5-shRNA通過lipofectamine2000共轉染293T細胞，6h后取出培養皿，棄去培養基，IXPBS清洗細胞3次，輕柔地加入8ml新鮮的293T培養基，繼續培養；細胞轉染36h后，收集培養基上清液作為慢病毒液，之后每3h收集一次,共收集3-4次；每次收集的病毒上清液用0.45 μ m的針頭濾器過濾，以去除293T細胞； 四、慢病毒感染A375細胞 根據預實驗確定細胞所需感染復數以及病毒對細胞狀態和傳代的影響，感染復數定義為感染時病毒和細胞數量的比值，病毒感染細胞前，用胰酶消化處于生長對數期的A375細胞，離心后用無抗生素的培養基重懸細胞，并進行細胞計數；取5X IO5個A375細胞接種于培養皿中，待細胞貼壁后，向培養皿中加入2ml溫浴后的病毒上清液，加入終濃度為2 μ g/ml的聚凝胺Polybrane ;培養3h，棄去培養基，更換2ml病毒上清液繼續培養，重復2次； 五、A375-GAS5Λ穩轉細胞株篩選和鑒定 Α375細胞經病毒上清液感染3次后，向培養皿中加入無抗生素的培養基，培養48h后，棄去培養基，換用含氨芐青霉素Ampicillin的培養基并篩選陽性細胞；隔日觀察細胞，棄去原培養基及死細胞，I X PBS清洗細胞3次，更換抗性培養基唏噓培養細胞，持續篩選7天；待細胞長滿，消化細胞，接種于IOmm培養皿中擴增培養,傳代3次；篩選后置于突光顯微鏡下觀察，所有細胞均呈現出高亮的綠色熒光；進一步行qRT-PCR檢測GAS5的表達，結果顯示A375-GAS5 Λ細胞株中GAS5的表達量較Α375細胞下降了 93.74%，干擾效率達到預期，長鏈非編碼GAS5缺陷的人Α375穩轉細胞株構建成功。
【文檔編號】C12N5/09GK103937745SQ201410174911
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】朱月春, 陳龍, 況應敏, 蔡天池, 王艷玲, 李玉倩 申請人:昆明醫科大學