風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法

風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法。本發明從15種優勢菌中選取三種菌株，其中細菌、絲狀真菌和放線菌個一種，將其培養后應用于草坪植物建植體系中。根據對這15種菌株作用分析，最終選定假單胞菌、木霉和鏈霉菌這三種。它們都能產生活性物質或改善礦質營養直接促進植物的生長，還可以產生代謝物質或通過競爭作用來抑制或阻撓根區病原微生物的發展，間接促進植物的生長。
【專利說明】風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境保護【技術領域】，涉及風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法。
【背景技術】
[0002]復合微生物菌劑由兩種或兩種以上且互不拮抗的微生物菌種按合適比例共同培養，充分發揮 群體的聯合作用優勢，取得較佳應用效果的一種微生物制劑，此類菌劑一般具有有種類全、配伍合理、見效快、投資少、操作簡單、不造成二次污染等優點，現已廣泛應用于農業、工業、醫藥和環保等各個領域。
[0003]施肥是農業生產及草坪養護管理中很重要的措施之一。在目前大部分選用的是無機肥。無機肥雖然能夠及時補充土壤養分，但是大量使用卻能對地表水、地下水以及空氣造成污染，對環境構成威脅。施加微生物肥料是在較低的生態影響條件下維持較高產量的更加和諧的一種施肥方式。比如最經典的菌根真菌、根瘤菌、根際促生細菌等。它的優點主要表現在:1.創造良好的根際生態環境。2.提高土壤以及空氣造成污染的供肥能力3.對環境資源的有效利用。4.降低作物對化肥的依賴。5.抑制病蟲害的發生。其原因一是有益細菌的大量繁殖大植物根隙區域形成優勢種群，抑制了病原微生物生長繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，參與植物的防御反應，提高植物的抗病蟲害能力。6.減少農藥污染等具有重要作用。同時，以城鄉有機廢棄物為基質，采用現代化的工業技術，制造成具有多種功能(如固氮、解磷、活鉀等)再生型復合生物肥料，將對資源的循環利用，實現生態經濟、社會效益一體化同樣具有重要意義。
[0004]自20世紀70年代以來，歐美日本等國家或地區都相繼研制成功了一些復合菌劑，很多已經開始進行大規模的生產，并形成了系列化的產品，主要用于處理生活污水，工農業廢水以及其他一些化合物污染的治理。我國國內微生物發展狀況經歷了從50年代到90年代，從理論到實踐，從單一菌種的利用到多個的混合應用，產品也從根瘤菌劑發展到復合微生物菌劑，相繼取得了一些成果。
[0005]目前多數研究已表明，微生物制劑應用于農業生產，能促進植物生長，且無毒、無公害、無污染，能持久均衡地供給農作物氮磷鉀元素的，被廣泛開發用作生物肥料。目前研發的生物菌肥的熱點產品主要包括:有機物料腐熟菌劑(也稱發酵菌劑)、土壤修復菌劑、根瘤菌劑和溶磷菌劑、煙草等經濟作物專用的功能菌劑、生物有機肥、抗旱菌劑等。美國哥斯達黎加大學應用EM技術來種植香蕉，有效減小了香蕉葉斑病的發生和線蟲類的侵襲，大大提高了其營養價值和生產效率。
[0006]另外，復合微生物菌劑在畜禽養殖和水產養殖方面也有很明顯的作用。復合微生物菌劑能防病抗病，提高成活率，提高生產性能，降低飼養成本，增加經濟效，改善產品品質，生產綠色食品。倪永珍等對雞進行400d的EM飼喂結果表明，與對照組比較雞的死亡率平均下降了 35.5%。據石專林報道，在飼糧中添加5%的EM發酵飼料，可使肉仔雞增重提高10.3%，料肉比下降7.8%。劉華周等試驗也表明，蛋雞日糧中EM發酵飼料占20%時，蛋殼厚度增加6.99%，蛋白哈氏單位提高10.31%，蛋黃顏色提高1.5羅氏級。
[0007]城市污泥是城市污水處理廠在各級污水處理凈化后所產生的含水量75%_99%的固體或者流體狀物質。它包括污水中的泥砂、纖維、動植物殘體等固體顆粒及其凝結的絮狀物，各種膠體、有機物及吸附的金屬元素、微生物、病菌、蟲卵、雜草種子等綜合固體物質。城市污泥中出現的微生物主要由細菌、放線菌、真菌以及原生動物和后生動物等，其中細菌是最主要成分，細菌主要有菌膠團細菌和絲狀菌，數量可占污泥中微生物總量的90%~95%左右。
[0008]20世紀80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以傳統分離培養法為主。該方法從活性污泥中發現的主要優勢菌群有:動膠桿菌屬、叢毛單胞菌屬、不動桿菌屬、螺菌屬、產堿桿菌屬、短桿菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬等。但是后來大量研究發現，在活性污泥中經典純培養方法能夠培養的細菌數量只占活性污泥微生物總數的1%~15%。 [0009]20世紀80年代后期，隨著以16 S r RNA為主要基石的細菌分子分類學的發展，PCR技術、電泳技術、克隆庫技術、熒光原位雜交和流式細胞術逐漸成為研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的復雜性和多樣性也以驚人的速度被人們認識，大量傳統檢測方法未能發現卻在活性污泥中起關鍵作用的微生物陸續被發現，如具有除磷作用的類紅環菌、小月菌、類Tetr asphaera的棒狀菌、俊片菌等；具有脫氮作用的反硝化生絲微菌屬、固氮弧菌屬相關菌、類硝化螺菌等；與污泥泡沫有關的諾卡氏菌形放線菌、絲狀菌和等。
[0010]城市污泥是污水處理過程中產生的沉淀物質，污水處理廠產生的污泥量約為處理水體積的0.15%~1.00%。它是一種以有機成分為主、組分復雜的混合物，其中包含有潛在利用價值的有機質、氮、磷、鉀以及各種微量元素，其PH值為6~7，總堿度約為200 mg/Ι，很適合微生物的繁殖與生長。因次，其微生物含量相當豐富。并且，污泥作為一個高滲環境，對其中的微生物存在一個自然馴化的過程。但是有關城市污泥有益微生物的分類鑒定方面的研究還很少，對城市污泥微生物的利用更是尚無文獻報道。本技術從污泥原液中取出菌液，在適合不同菌種生長的固體培養基中分別培養分離，從而鑒定污泥有效微生物的組成，以便后期將其應用于草坪建植方面的研究。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于提供一種風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法。本發明15種優勢菌中選取三種菌株，其中細菌、絲狀真菌和放線菌個一種，將其培養后應用于草坪植物建植體系中。根據對這15種菌株作用分析，最終選定假單胞菌、木霉和鏈霉菌這三種。它們都能產生活性物質或改善礦質營養直接促進植物的生長，還可以產生代謝物質或通過競爭作用來抑制或阻撓根區病原微生物的發展，間接促進植物的生長。為實現此述目的，本發明提供如下的技術方案:
一種風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法，其特征在于按如下的步驟進
行:
(1)材料的選擇:城市污泥來自污水處理廠；
(2)菌株的培養:稱取污泥10g，放入盛有90g無菌水的錐形瓶中加入玻璃珠，放在搖床上振搖20 min，采用稀釋分離法制備10 —2、10 —3、10 —4、10 —5、10 —6的污泥懸浮液；根據所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液，搖勻后吸取0.2 mL加入到預先倒好的平板中；其中
1)真菌用馬丁氏瓊脂平板，此培養液1000ml加1%孟加拉紅水溶液3.3 ml，臨用時每100 ml培養基中加1%鏈霉素液0.3 ml;放線菌用高氏一號瓊脂平板，臨用時每100 ml培養基中加入10%苯酚2滴；細菌用牛肉膏蛋白胨平板；用滅菌的涂布器涂抹均勻，每處理重復3次，28°C培養；
2)根據平板內菌落的形態、大小、色澤和生長速度特點，從每個樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化，依據菌落培養性狀和形態特征對菌株進行歸類并統計數量；
3)每種培養基上確定5種優勢菌，進行編號保存，待進一步鑒定；
(3)菌種的鑒定 1)將分離到的優勢細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，28°C培養，觀察18— 24 h菌齡的菌落形態、細菌的形態特征、培養特性，采用革蘭氏染色法、芽孢染色法和莢膜染色法進行染色；挑取單菌體溶于100 μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版，采用通用引物27f/1492r(27F:5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
3’ ；1492R:5’ GGTTACCTTGT TACGACTT 3，)進行 PCR 擴增 16SrRNA 基因，
PCR反應程序如下:
940C 2 min ；94°C I min, 57°C I min, 72°C I min, 25 個循環；72°C 10 min，擴增產物送至上海美吉基因公司測序，測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較；
2)優勢真菌的鑒定:將分離到的優勢真菌接種到馬丁氏培養基上，28°C培養7天后，描述菌落質地、形狀、大小、隆起形狀和顏色等，同時在光學顯微鏡(10 X 40倍)下觀察菌株的分生孢子和分生孢子梗形態，參照有關資料進行形態學鑒定；
3)挑取單菌體溶于100μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版，采用通用引物通用引物ITSl (5’ 一TCCGTAGGTGAACCTGCGG— 3’ )和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC -3，)
進行 PCR 擴增 18SrDNA 基因，PCR 反應程序如下:94°C 2min ；94°C I min,57°C Imin,72°C I min, 25個循環；72°C 10 min。擴增產物送至上海美吉基因公司測序，測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較；
4)優勢放線菌的鑒定
將分離到的優勢放線菌接種到高是一號培養基上，28°C培養7-10天后，采用印片法觀察放線菌形態，將分離到的優勢細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，28°C培養，觀察18-24 h菌齡的菌落形態、細菌的形態特征、培養特性，采用革蘭氏染色法、芽孢染色法和莢膜染色法進行染色；挑取單菌體溶于100 μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版，采用通用引物27f/1492r (27F: 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，;1492R:5’ GGTTACCTTGT TACGACTT 3，)
進行 PCR 擴增 16SrRNA 基因，PCR 反應程序如下:94°C 2 min ；94°C I min,57°C Imin, 72°C I min, 25個循環；72°C 10 min，擴增產物送至上海美吉基因公司測序，測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較。其中步驟⑵所述的真菌取10 —2、10 —3、10 —4，放線菌取10 — 3、10 —
4、10一5，細菌取 10 —4、10一5、10一6。
[0012]本發明所述的優勢菌定義為:在最高稀釋度上，菌落數占總菌落數的比例為10%以上的菌稱之為優勢菌。每個樣品中最多的菌落數達不到10%的，取菌落數最多的前兩種作為該樣品的優勢菌。
[0013]本發明更加詳細的制備方法如下:
I研制材料與方法
1.1材料
城市污泥來自天津紀莊子污水處理廠。
[0014]1.2菌株的培養
稱取污泥10 g,放入盛有90 g無菌水的錐形瓶中加入玻璃珠,放在搖床上振搖20 min。采用稀釋分離法制備10 — 2、10 —3、10 —4、10 —5、10 — 6的污泥懸浮液。根據所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液(真菌取10 —2、10 — 3、10 —4，放線菌取10 —3、10 —4、10 — 5，細菌取10一4、10 — 5、10 — 6)，搖勻后吸取0.2 mL加入到預先倒好的平板中。真菌用馬丁氏瓊脂平板，此培養液1000 ml加1%孟加拉紅水溶液3.3 ml。臨用時每100 ml培養基中加1%鏈霉素液0.3 ml;放線菌用高氏一號瓊脂平板，臨用時每100 ml培養基中加入10%苯酚2滴；細菌用牛肉膏蛋白胨平板。用滅菌的涂布器涂抹均勻。每處理重復3次，28°C培養。
[0015]根據平板內菌落的形態、大小、色澤和生長速度等特點，從每個樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化。依據菌落培養性狀和形態特征對菌株進行歸類并統計數量。每種培養基上確定5種優勢菌 ，進行編號保存，待進一步鑒定。優勢菌定義為:在最高稀釋度上，菌落數占總菌落數的比例為10%以上的菌稱之為優勢菌。每個樣品中最多的菌落數達不到10%的，取菌落數最多的前兩種作為該樣品的優勢菌。
[0016]1.3菌種的鑒定
1.3.1優勢細菌的鑒定
將分離到的優勢細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，28°C培養，觀察18 — 24 h菌齡的菌落形態、細菌的形態特征、培養特性，采用革蘭氏染色法、芽孢染色法和莢膜染色法進行染色。
[0017]挑取單菌體溶于100 μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版。采用通用引物27f/1492r(27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，; 1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3，)進行 PCR 擴增 16SrRNA 基因。PCR 反應程序如下:94°C 2 min ；94°C I min，57°C I min, 72°C I min, 25 個循環；72°C 10 min。擴增產物送至上海美吉基因公司測序。測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較。
[0018]1.3.2優勢真菌的鑒定
將分離到的優勢真菌接種到馬丁氏培養基上，28°C培養7天后，描述菌落質地、形狀、大小、隆起形狀和顏色等，同時在光學顯微鏡(10 X 40倍)下觀察菌株的分生孢子和分生孢子梗形態。參照有關資料進行形態學鑒定。
[0019]挑取單菌體溶于100 UL高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版。采用通用引物通用引物ITS1(5’ 一TCCGTAGGTGAACCTGCGG— 3’ )和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC _3，)進行 PCR 擴增18SrDNA 基因。PCR 反應程序如下:94°C 2min ；94°C I min，57°C I min，72°C I min, 25個循環；72°C 10 min。擴增產物送至上海美吉基因公司測序。測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較。
[0020]1.3.3優勢放線菌的鑒定
將分離到的優勢放線菌接種到高是一號培養基上，28°C培養7-10天后，采用印片法觀察放線菌形態。分子鑒定同1.3.1優勢細菌的分子鑒定。
[0021]2研制結果分析
2.1牛肉膏蛋白胨培養基上微生物的形態及菌落計數
2.1.1污泥微生物在牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數統計
表1培養基上細菌菌落數情況
【權利要求】
1.一種風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法，其特征在于按如下的步驟進行: (1)材料的選擇:城市污泥來自污水處理廠； (2)菌株的培養:稱取污泥10g，放入盛有90g無菌水的錐形瓶中加入玻璃珠，放在搖床上振搖20 min，采用稀釋分離法制備10 —2、10 —3、10 —4、10 —5、10 —6的污泥懸浮液；根據所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液，搖勻后吸取0.2 mL加入到預先倒好的平板中；其中 ①真菌用馬丁氏瓊脂平板，此培養液1000ml加1%孟加拉紅水溶液3.3 ml，臨用時每100 ml培養基中加1%鏈霉素液0.3 ml;放線菌用高氏一號瓊脂平板，臨用時每100 ml培養基中加入10%苯酚2滴；細菌用牛肉膏蛋白胨平板；用滅菌的涂布器涂抹均勻，每處理重復3次，28°C培養； ②根據平板內菌落的形態、大小、色澤和生長速度特點，從每個樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化，依據菌落培養性狀和形態特征對菌株進行歸類并統計數量； ③每種培養基上確定5種優勢菌，進行編號保存，待進一步鑒定； (3)菌種的鑒定 ①將分離到的優勢細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，28°C培養，觀察18— 24 h菌齡的菌落形態、細菌的形態特征、培養特性，采用革蘭氏染色法、芽孢染色法和莢膜染色法進行染色；挑取單菌體溶于100 μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版，
采用通用引物 27f/1492r27F:5> AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，(SEQ ID NO:1); 1492R:5’ GCTTAOCTTGTTAOGACTT 3，(SEQ ID NO:2);進行 PCR 擴增 16SrRNA 基因， PCR反應程序如下:94℃ 2 min ；94°C I min，57°C I min,72°C I min, 25個循環；72°C 10 min，擴增產物送至上海美吉基因公司測序，測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較； ②優勢真菌的鑒定:將分離到的優勢真菌接種到馬丁氏培養基上，28°C培養7天后，描述菌落質地、形狀、大小、隆起形狀和顏色等，同時在光學顯微鏡(10 X 40倍)下觀察菌株的分生孢子和分生孢子梗形態，參照有關資料進行形態學鑒定； ③挑取單菌體溶于100μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版，采用通用引物 通用引物 ITSl (5，一TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’)(SEQ ID NO:3)
和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC -3，)(SEQ ID NO:4) 進行PCR擴增18SrDNA基因，PCR反應程序如下:94℃ 2min ；94°C I min,57°C I min,72°C I min, 25 個循環；72°C 10 min ;擴增產物送至上海美吉基因公司測序，測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較； ④優勢放線菌的鑒定 將分離到的優勢放線菌接種到高是一號培養基上，28°C培養7-10天后，采用印片法觀察放線菌形態，將分離到的優勢細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，28°C培養，觀察18-24 h菌齡的菌落形態、細菌的形態特征、培養特性，采用革蘭氏染色法、芽孢染色法和莢膜染色法進行染色；挑取單菌體溶于100 μ L高純水中，在沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應的模版版，
采用通用引物 27f/1492r27F:5> AGAGITTGATOCTGGCTCAG 3，(SEQ ID NO:5); 1492R:5’ GCTTAOCTTGTTAOGACTT 3，(SEQ ID NO:6)進行 PCR 擴增 16SrRNA 基因，PCR 反應程序如下:94°C 2 min ；94°C Imin，57°C I min，72°C I min, 25個循環；72°C 10 min，擴增產物送至上海美吉基因公司測序，測序結果在NCBI網站上用BIAST軟件與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16SrDNA和18srDNA序列進行同源性比較。
2.權利要求1所述風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法，其中步驟(2)所述的真菌取 10 一 2、10 —3、10 —4，放線菌取 10 —3、10 —4、10 —5，細菌取 10 —4、10 —5、10 —6。
3.權利要求1所述風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法，其中步驟(2)菌株培養所述的優勢菌定義為:在最高稀釋度上，菌落數占總菌落數的比例為10%以上的菌稱之為優勢菌。
4.權利要求3所述風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法，其中每個樣品中最多的菌落數達不到10%的，取菌落數最多的前兩種作為該樣品的優勢菌。
5.權利要求1所述風干污泥有益微生物組分的分離、提取及鑒定方法，其中所述的優勢菌指的是施氏假單胞菌、里氏木霉各和鏈霉菌。
【文檔編號】C12R1/77GK103937731SQ201410191171
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】多立安, 趙樹蘭, 王志旭 申請人:天津師范大學