基于pnc的抗轉移中藥單體的篩選模型及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株及其應用，及基于腫瘤侵襲性新靶標PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型及其應用。一種基于腫瘤侵襲性新靶標PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型，所述篩選模型采用帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株，通過中藥單體對該類細胞的PNC抑制率進行篩選。本發明的優點在于：帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞模型無需其他體外標記和特殊試劑及耗材，可直接用于抗轉移中藥單體篩選，篩選步驟簡便，方法快捷，費用低，且易于操作，穩定性好。
【專利說明】基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株及其應用，及基于腫瘤侵襲性新靶標PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型及其應用。
【背景技術】
[0002]隨著全球惡性腫瘤新發率的不斷增長，腫瘤已成為危害人類健康的主要疾病之一，我國惡性腫瘤死亡率亦呈持續增長趨勢。化療是目前腫瘤治療的主要手段之一，其作為一種全身性治療手段對原發灶、轉移灶和亞臨床轉移灶均有治療作用。但是常規化療藥物，例如阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、氟脲嘧啶脫氧核苷酸等，在殺傷腫瘤細胞的同時，也對機體正常細胞造成嚴重傷害，因而具有明顯的毒副作用。因此探索腫瘤治療的新靶點，并開發毒副作用較低的化療新藥，對于提高腫瘤治療的靶向性以及減少腫瘤化療的副反應具有重要意義。
[0003]侵襲性(浸潤-轉移)作為惡性腫瘤的重要標志之一，是導致癌癥患者死亡的主要原因。而抗癌新藥，尤其是抗轉移藥物長期處于市場需求“饑渴狀態”。近來研究發現，PNC (perinucleolar compartment)是一個與腫瘤侵襲性密切相關的細胞核亞結構,其主要由MRP等非編碼RNA和PTB、CUG-BP1等RNA結合蛋白所組成。由于腫瘤細胞核中PNC比例與其侵襲性呈正相關，并且與患者預后密切相關。因此以PNC為探針，建立具有抗腫瘤轉移作用的抗癌新藥的篩選模型具有潛在優勢。
[0004]我國傳統的中 藥，例如靈芝、當歸、黃芪、三七等，因其抗腫瘤效應、放化療增敏作用以及在減輕放化療毒副方面獨具效果而越來越受到人們的重視。但中藥作為一個復雜組分其具體的作用機制尚不明確，目前，隨著對中藥提取物，尤其是中藥單體的抗腫瘤機制研究的不斷深入，中藥單體在腫瘤治療中的前景日益受到關注。但面對龐大的中藥單體庫，如何簡便高效地選擇出具有降低腫瘤侵襲性潛能的中藥單體，又是一個亟待解決的重要問題，對于藥物的選擇性開發至關重要。因此基于新型腫瘤轉移分子標記物PNC的中藥單體高通量篩選模型的建立，對于從傳統中藥中發掘具有抗腫瘤轉移作用的中藥單體，或以此為先導化合物的結構修飾型藥物的開發具有重要意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是通過建立基于新型腫瘤轉移分子標記物PNC的藥物體外篩選模型，為抗腫瘤轉移作用的中藥單體的選擇性開發提供技術平臺。
[0006]首先本發明提供了一種中藥單體的篩選模型及其構建方法。
[0007]一種基于腫瘤侵襲性新靶標PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型，所述篩選模型采用帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株，通過中藥單體對該類細胞的PNC抑制率進行篩選。
[0008]其中，帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株腫瘤細胞具有高轉移特性，并具有GFP標記的PNC。[0009]進一步的，帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株的腫瘤包括實體瘤和血液瘤。
[0010]更進一步的，帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株的腫瘤細胞株為帶GFP標記PNC的MDA-MB-231M(乳腺癌細胞株)，SPC_A_1M(人肺腺癌細胞株)或H印G2M(肝癌細胞株)。
[0011]基于腫瘤侵襲性新靶標PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的構建方法，包括如下步驟:
[0012]I)通過腫瘤細胞株原位接種-分離淋巴結轉移灶-體外培養得到轉移性腫瘤細胞株-再次原位接種，重復以上循環5次，獲得高轉移性的腫瘤細胞株；
[0013]2)構建帶GFP標記的PTB表達質粒(GFP-PTB):通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在Hindi 11和BamHl位點處插入GFP表達質粒pEGFP-Cl，獲得帶GFP標記的PTB融合蛋白表達質粒；
[0014]3)上述GFP-PTB融合蛋白表達質粒轉染步驟I中的高轉移性的腫瘤細胞株，并通過G418篩選獲得穩轉細胞株；
[0015]4)熒光顯微鏡觀察上述穩轉細胞株中的PNC比例，均達到95%以上，即得到可用于抗轉移中藥單體篩選的帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞模型。優選的，步驟I)所述腫瘤細胞株為乳腺癌細胞株MDA-MB-231M，人肺腺癌細胞株SPC-A-1M、肝癌細胞株H印G2M。
[0016]另外，本發明了還提供了基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的應用 [0017]基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的應用，基于中藥單體對帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株的PNC抑制率的分析來篩選藥物。
[0018]基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的應用，包括如下步驟:
[0019]I)采用CCK8法分析備選中藥單體對權利要求2所述細胞的生長抑制情況，計算48h時間點的GI50%和GI99%藥物濃度；
[0020]2)權利要求2所述的細胞爬片過夜后，分別加入GI50%和GI99%濃度的中藥單體作用24小時后，用4%多聚甲醛固定，并水洗封片后于鏡下觀察；
[0021]3)采用熒光顯微鏡檢測中藥單體作用后的PNC比例，每次計數100個細胞，計數3次后取平均值；或采用激光共聚焦顯微鏡成像后，配合Stereo Investigator軟件計數中藥單體作用后的腫瘤細胞PNC比例；
[0022]4)計算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶劑DMSO組的PNC比例-中藥單體組的PNC比例)/助溶劑DMSO組的PNC比例X 100%，再行統計分析；
[0023]5)以中藥單體的PNC抑制率作為篩選依據:在GI50%濃度時達到30%以上PNC抑制率的作為優先選擇，以GI99%濃度達到30%以上PNC抑制率的作為第二選擇。
[0024]下面對本發明做進一步描述。
[0025]抗癌新藥，尤其是抗轉移藥物長期處于市場需求“饑渴狀態”。近年來，中藥單體在腫瘤治療中的前景日益受到關注。但如何簡便高效地從龐大的中藥單體庫篩選出具有降低腫瘤侵襲性潛能的中藥單體，又是一個亟待解決的重要問題。而腫瘤細胞核中PNC比例與其侵襲性呈正相關，因此有望作為新型的腫瘤轉移分子標記物而用于抗轉移新藥的篩選。因此基于PNC的中藥單體高通量篩選模型的建立，對于從傳統中藥中發掘具有抗腫瘤轉移作用的中藥單體具有重要意義。
[0026]另外，PTB作為PNC的主要組成蛋白之一，可明確顯示PNC在細胞核中的定位和大小，穩轉GFP標記PTB的腫瘤細胞可直觀反映細胞中的PNC比例，因此在高轉移性腫瘤細胞中導入GFP-PTB可作為抗轉移中藥單體的有效篩選模型。本發明所提供的基于該類細胞的抗轉移中藥單體的篩選模型，對于藥物的選擇性開發至關重要。
[0027]本發明公開了一種可用于抗轉移中藥單體篩選的腫瘤細胞模型的構建方法基。步驟如下:
[0028]1、通過腫瘤細胞株原位接種-分離淋巴結轉移灶-體外培養得到轉移性腫瘤細胞株-再次原位接種(重復5次)，獲得高轉移性的腫瘤細胞株，如MDA-MB-231M(乳腺癌細胞株)，SPC-A-1M (人肺腺癌細胞株)、H印G2M (肝癌細胞株);
[0029]2、通過PTB抗體的免疫熒光實驗，檢測上述高轉移腫瘤細胞株中的PNC比例，3株細胞的PNC比例均在95%以上；
[0030]3、帶GFP標記的PTB表達質粒(GFP-PTB)的構建:通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在HindIII和BamHl位點處插入GFP表達質粒pEGFP-Cl，即得到帶GFP標記的PTB融合蛋白表達質粒；
[0031]4、上述GFP-PTB融合蛋白表達質粒通過LipofGetainine? 2000分別轉染步
驟I中的3株細胞，并通過G418篩選2-3周獲得穩轉細胞株MDA-MB-23IM-GFP-PTB，SPC-A-1M-GFP-PTB 和 H印G2M-GFP-PTB ； [0032]5、采用熒光顯微鏡驗證上述穩轉細胞株中的PNC比例，與步驟2的PTB免疫熒光檢測結果一致，即得到可用于抗轉移中藥單體篩選的帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞模型。
[0033]本發明還公開了一種基于上述細胞模型的抗轉移中藥單體的篩選方法。步驟如下:
[0034]1、采用 CCK8 法分析備選中藥單體對 MDA-MB-23IM-GFP-PTB 或 SPC-A-1M-GFP-PTB或H印G2M-GFP-PTB細胞模型的生長抑制情況，計算48h時間點對細胞生長抑制達50 %(GI50% )和(GI99% )的藥物濃度；
[0035]2、上述帶GFP標記PNC的高轉移腫瘤細胞爬片過夜后，分別加入GI50%和GI99%濃度的中藥單體作用24小時；
[0036]3、細胞爬片用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘后，PBS洗2次，超純水洗I次，每次3分鐘。然后每張細胞爬片加10 μ I防熒光淬滅封片劑進行封片；
[0037]4、采用熒光顯微鏡檢測中藥單體作用后的腫瘤細胞中PNC比例，每次計數100個細胞，計數3次后取平均值；或采用激光共聚焦顯微鏡成像后，配合Stereo Investigator軟件計數中藥單體作用后的腫瘤細胞中PNC比例；
[0038]5、計算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶劑DMSO組的PNC比例-中藥單體組的PNC比例)/助溶劑DMSO組的PNC比例X 100%，再行統計分析；
[0039]6、以中藥單體在GI50%濃度時對上述細胞模型的PNC抑制率達到30%以上的作為優先選擇，以GI99%濃度達到30%以上PNC抑制率的作為第二選擇。
[0040]本發明的優點在于:
[0041]1、中藥較之常規化療藥物具有低毒副作用的優勢，因此基于PNC的中藥單體高通量篩選模型的建立，對于具有抗腫瘤轉移作用的中藥單體的選擇性開發至關；
[0042]2、帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞模型無需其他體外標記和特殊試劑及耗材，可直接用于抗轉移中藥單體篩選，篩選步驟簡便，方法快捷，費用低，且易于操作，穩定性好；
[0043]3、基于PNC指針的抗轉移藥物的篩選模型，配合計算機編程分析，可實現抗轉移中藥單體的高通量篩選；
[0044]4、帶GFP標記的高轉移性腫瘤細胞模型亦能用于動物實驗的活體成像分析，為抗轉移中藥單體的體內驗證提供良好的腫瘤細胞模型。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045]圖1為MDA-MB-23IM-GFP-PTB (高轉移乳腺癌細胞株)中的PNC亞細胞定位圖；細胞核仁周邊的亮點，即為PNC結構。
[0046]圖2為SPC-A-1M-GFP-PTB (高轉移人肺腺癌細胞株)的PNC亞細胞定位圖；
[0047]細胞核仁周邊的亮點，即為PNC結構。
[0048]圖3為H印G2M-GFP-PTB (高轉移肝癌細胞株)中的PNC亞細胞定位圖；
[0049]細胞核仁周邊的亮點，即為PNC結構。
[0050]圖4為中藥單體槲皮素、異甘草素、姜黃素處理H印G2M-GFP-PTB細胞后的PNC比例柱狀圖:其中，PNC比例在中藥單體處理后顯著降低，且呈劑量依賴性。
具體實施例
[0051]下面結合具體實施例進一步闡述本發明，應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。
[0052]本發明實施例中所需要的材料、試劑均可市場購得。
[0053]實施例1
[0054]一、HepG2細胞購至ATCC，于肝臟原位接種-分離淋巴結轉移灶-體外培養得到轉移性肝癌細胞-再次肝臟原位接種(重復5次)，獲得高侵襲性的肝癌細胞株H印G2M ；
[0055]二、采用PTB抗體(購至Invitrogen，1:1000稀釋)進行免疫熒光檢測，HepG2M細胞中的PNC比例為97.5% ;
[0056]三、構建帶GFP標記的PTB表達質粒(GFP-PTB):通過高保真DNA聚合酶PCR擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在Hindi 11和BamHl位點處插入GFP表達質粒pEGFP-Cl (購至上海和元生物技術有限公司)，即得到帶GFP標記的PTB融合蛋白表達質粒；
[0057]四、上述GFP-PTB融合蛋白表達質粒通過Li pofectami ne? 2000 (購至Invitrogen)轉染H印G2M細胞，并通過G418篩選約3周獲得穩轉細胞株H印G2M-GFP-PTB。該細胞中的PNC比例與H印G2M細胞中的基本一致，為97.8%。即得到可用于抗轉移中藥單體篩選的帶GFP標記PNC的高轉移性肝癌細胞模型；五、H印G2M-GFP-PTB細胞(按5000個/孔)接種96孔板，貼壁過夜后，加入梯度濃度的中藥單體(槲皮素、異甘草素、姜黃素、柚皮素、山奈酚等，均購至成都瑞芬思生物科技有限公司，以DMSO助溶)，繼續培養48小時后，采用CCK8法分析中藥單體對H印G2M-GFP-PTB細胞的生長抑制情況，并采用GraphPadPrism5軟件計算細胞生長抑制達50% (GI50% )和99% (GI99% )時的藥物濃度，見下表:
[0058]
【權利要求】
1.一種基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型，其特征在于:所述篩選模型采用帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株，通過中藥單體對該類細胞的PNC抑制率進行篩選。
2.如權利要求1所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型，其特征在于:帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株腫瘤細胞具有高轉移特性，并具有GFP標記的PNC。
3.如權利要求1所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型，其特征在于:帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株的腫瘤為實體瘤。
4.如權利要求3所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型，其特征在于:帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株的腫瘤細胞株為帶GFP標記PNC的MDA-MB-231M(乳腺癌細胞株)，SPC-A-1M (人肺腺癌細胞株)或H印G2M(肝癌細胞株)。
5.權利要求1所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的構建方法，包括如下步驟: 1)通過腫瘤細胞株原位接種-分離淋巴結轉移灶-體外培養得到轉移性腫瘤細胞株-再次原位接種，重復以上循環5次，獲得高轉移性的腫瘤細胞株； 2)構建帶GFP標記的PTB表達質粒(GFP-PTB):通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在HindIII和BamHl位點處插入GFP表達質粒pEGFP-Cl，獲得帶GFP標記的PTB融合蛋白表達質粒； 3)上述GFP-PTB融合蛋白表達質粒轉染步驟I中的高轉移性的腫瘤細胞株，并通過G418篩選獲得穩轉細胞株； 4)熒光顯微鏡觀察上述穩轉細胞株中的PNC比例，均達到95%以上，即得到可用于抗轉移中藥單體篩選的帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞模型。
6.如權利要求5所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的構建方法，其特征在于:步驟I)所述腫瘤細胞株為乳腺癌細胞株MDA-MB-231M，人肺腺癌細胞株SPC-A-1M、肝癌細胞株H印G2M。
7.權利要求1所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的應用，其特征在于:基于中藥單體對帶GFP標記PNC的高轉移性腫瘤細胞株的PNC抑制率的分析來篩選藥物。
8.權利要求1所述的基于PNC的抗轉移中藥單體的篩選模型的應用，其特征在于:包括如下步驟: 1)采用CCK8法分析備選中藥單體對權利要求2所述細胞的生長抑制情況，計算48h時間點的GI50%和GI99%藥物濃度； 2)權利要求2所述的細胞爬片過夜后，分別加入GI50%和GI99%濃度的中藥單體作用24小時后，用4%多聚甲醛固定，并水洗封片后于鏡下觀察； 3)采用熒光顯微鏡檢測中藥單體作用后的PNC比例，每次計數100個細胞，計數3次后取平均值；或采用激光共聚焦顯微鏡成像后，配合Stereo Investigator軟件計數中藥單體作用后的腫瘤細胞PNC比例； 4)計算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶劑DMSO組的PNC比例-中藥單體組的PNC比例)/助溶劑DMSO組的PNC比例X 100%，再行統計分析； 5)以中藥單體的PNC抑制率作為篩選依據:在GI50%濃度時達到30%以上PNC抑制率的作為優先選擇，以GI99%濃度達到30%以上PNC抑制率的作為第二選擇。
【文檔編號】C12N5/10GK104004716SQ201410198205
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】陳智, 劉艷寧, 樓國華, 王靜, 吳珊珊 申請人:浙江大學