一種檢測牛igf-1基因的特異性引物、其熒光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明為一種檢測牛IGF-1基因的特異性引物、其熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用，提供一種牛IGF-1基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒包括PCR反應液、TaqDNA聚合酶混合物、SYBRGreen染料和引物；所述引物序列為：上游引物序列為5’-AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’；下游引物序列為：5’-AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。本發明還提供上述試劑盒的檢測方法和應用以及檢測牛IGF-1基因的特異性引物。本發明實現了方便快捷的檢測牛IGF-1基因mRNA表達水平的目的。本發明在檢測基因mRNA表達水平方面具有靈敏度高、穩定性好、實驗成本低的優點。本發明的方法能夠有效擴增來源于奶牛、黃牛和牦牛三個牛種的IGF-1基因，從而檢測IGF-1基因的mRNA表達量。
【專利說明】—種檢測牛IGF-1基因的特異性引物、其熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種檢測牛IGF-1基因的特異性引物和牛IGF-1基因熒光定量PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain React1n, PCR)是DNA體外操作技術中最常用的技術。PCR技術將模板DNA、特異性引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放在同一個緩沖反應體系中，進行反復高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環，實現靶DNA片段在反應液中呈2n倍擴增(其中η為熱循環次數)。
[0003]熒光定量PCR技術是在變通PCR反應的基礎上，結合實時熒光檢測技術和計算機分析技術。熒光定量PCR在變通PCR反應體系中加入特定的熒光標記物質，通過檢測每個熱循環后PCR反應體系中的熒光值的變化情況來實時監測DNA的擴增情況，并獲得每個樣本的熒光定量變化曲線，進而獲得每個反應管的Ct值(熒光變化達到閾值時的循環數)；同時，在相同的反應體系和反應條件下檢測2-10個倍數稀釋的已知數量的靶標DNA，獲得其Ct值，以起始模板數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標制備標準曲線，據此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定。
[0004]雖然Northern blot技術可檢測基因的mRNA表達水平,但整個實驗過程操作比較復雜。Northern blot實驗中一個主要的問題是存在RNA的降解,所以Northern Blot中所有的實驗用品都需要經過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。另外，NorthernBlot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對人體都有一定的傷害。基因芯片實驗雖然降低了實驗人員的工作量，并可以在一次實驗中同時檢測幾千個基因表達量變化，但是其靈敏度較低。
[0005]而SYBR Green是一種結合于雙鏈DNA小溝中的結合染料。與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。該性質用于擴增產物的檢測非常理想。SYBR Green的最大吸收波長約為497 nm，發射波長最大約為520 nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
[0006]SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈DNA相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于一個PCR產物可以與多分子的染料結合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRBGreen與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響。由解鏈曲線來分析產物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量結果。
[0007]類膜島素一號增長因子(Insulin-Like Growth Factor-1, IGF-1)是調節動物生長發育的一個重要分泌因子。IGF-1在胚胎和出生后的發育過程中都表現出重要的調節作用，它可以通過調節細胞的增殖、分化和凋亡來影響各種組織的動態平衡以及組織功能。因此，在牛的飼養過程中和科學研究中，可以定量檢測組織中IGF-1的表達量，達到監測牛的發育狀況的目的。
【發明內容】
[0008]本發明提供了一種類胰島素一號增長因子(Insulin-Like Growth Factor-1,IGF-1)基因的熒光定量PCR檢測試劑盒。通過大量的實驗研究，我們優化出了一套能夠有效檢測不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)IGF-1基因表達量的引物和PCR反應的條件，并組裝成IGF-1基因表達檢測熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，以滿足生命科學、醫學和畜牧獸醫研究者的檢測需要。為此，本發明還提供檢測牛IGF-1基因的特異性引物、檢測方法和試劑盒的應用。
[0009]為了實現上述發明目的，本發明提供的技術方案如下:
一種檢測牛IGF-1基因的特異性引物，其核苷酸序列為:
上游引物序列為 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ；
下游引物序列為:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
[0010]本發明的第二個目的是提供一種牛IGF-1基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括PCR反應液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和引物；所述引物序列為:
上游引物序列為 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ；
下游引物序列為:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
[0011]優選地，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0012]本發明的第三個目的是提供牛IGF-1基因的定量檢測方法，是以待測cDNA為模板，利用權利要求1所述的引物和SYBR Green染料進行實時熒光定量PCR，記錄Ct值，并以IGF-1標準基因作為陽性對照繪制標準曲線，據此標準曲線和Ct值進行定量測定。
[0013]優選地，所述實時熒光定量PCR的反應條件是:95 °C預變性30秒；95 °C 5秒，56°C 20秒,捕捉突光信號,循環40次。
[0014]本發明的第四個目的是提供上述試劑盒在定量檢測牛IGF-1基因中的應用。
[0015]優選地，所述牛為奶牛、黃牛和牦牛。
[0016]與現有最好技術相比，本發明的優點在于:
1.本發明實現了方便快捷的檢測IGF-1基因mRNA表達水平的目的。
[0017]2.本發明在檢測基因mRNA表達水平方面具有靈敏度高、穩定性好、實驗成本低的優點。
[0018]3.由于引物在奶牛、黃牛、牦牛中完全同源，所以本發明的方法能夠有效擴增來源于這些物種的IGF-1基因，從而檢測IGF-1基因的表達量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中:
圖1為IGF-1基因轉錄水平的熒光檢測結果圖，A:擴增曲線。橫坐標為PCR循環次數，縱坐標為相對熒光量值(Relative Fluorescence Units, RFU), B:熔解曲線，橫坐標為溫度，縱坐標為單位溫度下相對熒光值的變化量。
【具體實施方式】
[0020]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
[0021]本發明的IGF-1基因的熒光定量PCR檢測試劑盒由以下組分組成:
2XSYBR GREEN MIX5mL ；
引物混合液500μ?;
超純水5mL ；
陽性對照:標準IGF-1基因模板500 μ L0
[0022]其中，2ΧSYBR GREEN MIX 由以下組分組成:Taq DNA 聚合酶 0.1 U/μ L、dNTPs 底物0.4 mmol/L、Mg2+ 5.0 mmol/LUOO mmol/L KC1、20 mmol/L Tris.HCl PH8.3、0.02 % 明膠和 20 ng/mL SYBR Green 染料。
[0023]引物混合液:上游引物8 μ mol/L、下游引物8 μ mol/L，上游引物序列為5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’，下游引物序列為:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
[0024]標準IGF-1基因模板:濃度為0.8 μ mol/L, IGF-1基因模板序列為5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAATTATTTAAGTGCTGCTTTTGTGATTTCTTGAAGCAGGTGAAGATGCCCATCACATCCTCCTCGCATCT-3，。
[0025]超純水:純度超過18.25 ΜΩ.CM。
[0026]應用本發明的熒光定量PCR檢測試劑盒定量檢測牛IGF-1基因的步驟如下:
(1)取2XSYBRGREEN MIX 1000 μ L、引物混合液100 μ L、超純水800 μ L充分混勻，配制1900 μ L的FQ-PCR反應預混液；
(2)充分混勻以上各種液體，將預混液按19μ L/管分裝成100小管，加至熒光定量專用PCR反應管或者反應板中；
(3)配制以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML 等系列稀釋度的標準IGF-1基因模板5管，每管10 μ L ;
(4)在每個裝有19μ L FQ-PCR反應預混液的反應管中分別加入I μ L待測cDNA、超純水(陰性對照)或標準IGF-1基因模板，震蕩混勻，瞬時離心后上機到熒光定量PCR儀(B1-RadCFX96TM)中，95°C預變性30秒；95°C 5秒，56°C 20秒，捕捉熒光信號，循環40次；由于擴增的片段較短，退火和延伸合并為一步，即56°C，20秒；升高至95 °C，升溫過程中捕捉熒光信號，根據該熒光信號制作溶解曲線。PCR擴增曲線參見圖1，圖1表明IGF-1基因熒光信號值符合標準的“S”型曲線，熔解曲線表明該熒光定量具有高度的檢測專一性。因此，本發明可以準確的測定IGF-1的表達水平，并具有高度的特異性，效果很理想，與設計的預期完全一致。
[0027]其中，待測cDNA是通過以下步驟制備得到的:
a、RNA提取過程:采集牛種(黃牛、奶牛或牦牛)的組織，將10mg組織在液氮中磨碎，力口入ImL TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理；將勻漿樣品在室溫(15_30°C )放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離；加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘；4°C 1000Xg離心15分鐘(樣品分為三層:底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層);把水相轉移到新管中；加入0.5mL異丙醇沉淀水相中的RNA，室溫放置10分鐘；4°C 1000Xg離心10分鐘，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀；移去上清，使用ImL 75%乙醇洗滌RNA沉淀；4°C7000 X g離心5分鐘，棄上清；室溫放置干燥RNA沉淀；加入25-200 μ I無RNase的水用槍頭吸打幾次，58°C放置10分鐘使RNA溶解，此時得到牛種的RNA溶液。
[0028]b、反轉錄過程，也就是獲得cDNA的過程:在PCR管中加入50 μ mol/L oligo dT溶液 1.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 混合液 I μ L,牦牛總 RNA 2.5 μ L, RNase free dH20 5 μ L,混勻，65°C放置5min，迅速轉移至冰上冷卻；在上述PCR管中繼續加入5 XPrime ScriptTM緩沖液 4 μ L，40 U/μ I RNA 酶抑制劑 0.5 μ L，200 U/μ L Prime Script? 反轉錄酶 I μ L，RNase free dH20 4.5 μ L，混勻，30°C 10min,42°C 60min,70°C 15min 條件下反應，此時獲得牛種的cDNA。
[0029](5)PCR反應結束后，讀取各個反應的Ct值用以定量分析:以起始模板數的對數為橫坐標，以陽性對照的Ct值為縱坐標制備標準曲線，據此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始模板數進行定量測定。同時用3%瓊脂糖凝膠進行PCR產物電泳，溴乙錠染色，凝膠成像系統下觀察，灰度掃描分析記錄各PCR反應的結果。以確定擴增產物的大小，從而進一步確定擴增的是否是目的基因。
[0030]由于引物在奶牛、黃牛、牦牛中完全同源，所以本發明的方法能夠有效擴增來源于這些物種的IGF-1基因，從而檢測IGF-1基因的表達量。
[0031]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種檢測牛IGF-1基因的特異性引物，其核苷酸序列為: 上游引物序列為 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ； 下游引物序列為:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
2.—種牛IGF-1基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括PCR反應液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和引物；所述引物序列為: 上游引物序列為 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ； 下游引物序列為:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
4.一種牛IGF-1基因的定量檢測方法，是以待測cDNA為模板，利用權利要求1所述的引物和SYBR Green染料進行實時熒光定量PCR，記錄Ct值，并以IGF-1標準基因作為陽性對照繪制標準曲線，據此標準曲線和Ct值進行定量測定。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于:所述實時熒光定量PCR的反應條件是:95°C預變性30秒；95°C 5秒，56 °C 20秒，捕捉熒光信號，循環40次。
6.權利要求2或3所述的試劑盒在定量檢測牛IGF-1基因中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于:所述牛為奶牛、黃牛和牦牛。
【文檔編號】C12N15/11GK104313124SQ201410253252
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】裴杰, 郭憲, 包鵬甲, 梁春年, 褚敏, 朱新書, 丁學智, 馮瑞林, 閻萍 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所