CRISPR?Cas9特異性敲除豬SLA?3基因的方法及用于特異性靶向SLA?3基因的sgRNA與流程

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及基因敲除技術領域，具體涉及CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的方法及用于特異性靶向SLA-3基因的sgRNA。

背景技術：

器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬的患者通過器官移植而延續生命。隨著人口老齡化及醫療技術的進步，需要進行器官移植手術的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴重制約了器官移植手術的開展。以腎臟移植為例，我國每年需要進行腎移植的患者多達30萬，而可用于移植的捐獻腎臟不超過1萬例，大部分患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其他物種，以提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。

目前，根據生物安全性、生理功能指標、經濟性及稀有物種保護等多方面評價，豬成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到人會產生強烈的免疫排斥反應。因此，通過基因工程對豬進行改造，以產生適合于人體移植的器官，成為異種移植的終極目標。

豬白細胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)I類分子是代表基因分子遺傳特征的重要功能基因。分別稱為SLA-1(PD1)、SLA-2(PD14)和SLA-3(PD7)，也分別稱為SLA-C、SLA-B和SLA-A。經典的SIJA基因主要高表達于免疫系統和消化系統，尤其在免疫系統中，脾、胸腺、支氣管淋巴結等組織富含免疫細胞。人CD4T細胞通過間接的抗原遞呈途徑識別豬的異種抗原，且主要為SLA I類分子所識別。因此，需要消除豬細胞表面的SLA I類分子以減少異種供體器官的免疫原性。而準確高效的敲除豬SLA-3基因，是消除SLA I類分子引起的免疫排斥的關鍵步驟。

目前，常見的基因敲除技術包括同源重組(Homologus Recombination，HR)技術、類轉錄激活效應子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)技術、鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nuclease，ZFN)技術以及最近發展的規律成簇間隔短回文重復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技術。HR技術由于重組效率低下(效率大約只有10^-6)，對突變體的篩選工作非常耗時和低效，已逐漸被取代。TALEN技術和ZFN技術的切割效率一般能達到20％，但都需要構建可以識別特定序列的蛋白質模塊，前期工作繁瑣費時。ZFN技術的模塊設計較為復雜且有較高的脫靶率，其應用有限。

CRISPR是一種源于原核生物的后天免疫系統，該系統執行干擾功能的復合物由蛋白質Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統已發現有三種類型，其中第二類Cas9系統組成簡單，已被積極應用于基因工程領域。Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA——crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)與靶序列互補識別的原理實現的。現在已經將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guide RNA)，能夠識別特定的基因序列，引導Cas9蛋白進行切割。在真核生物中，DNA被切斷后發生非同源重組末端連接，造成移碼突變，最終導致基因功能性敲除。

相比于上述3種技術，CRISPR技術操作簡單、篩選效率高，能夠實現精確的靶向切割。因此，通過CRISPR技術敲除SLA-3基因能夠極大地提高Neu5Gc缺失細胞及基因工程豬的篩選效率。但是該路徑的關鍵技術難題是設計并制備精確靶向的sgRNA，因為基因的靶向精確度高度依賴于sgRNA靶序列，能否成功設計出精確靶向的sgRNA成為敲除目的基因的關鍵技術問題，本發明意在解決該技術問題從而為敲除SLA-3基因提供堅實的基礎。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的方法及用于特異性靶向SLA-3基因的sgRNA。

根據本發明的第一方面，本發明提供在CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因中用于特異性靶向SLA-3基因的sgRNA，該sgRNA具有以下特點：

(1)該sgRNA在SLA-3基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列規則，其中N(20)表示20個連續的堿基，其中每個N表示A或T或C或G，符合規則的靶序列可以位于正義鏈或反義鏈；

(2)該sgRNA在SLA-3基因上的靶序列位于SLA-3基因的N端的5個外顯子編碼區，或序列的主要部分位于SLA-3基因的N端的5個外顯子，其余部分跨越與相鄰內含子的交界，位于相鄰內含子；

(3)該sgRNA在SLA-3基因上的靶序列是唯一的。

作為本發明的優選方案，上述靶序列為序列表中SEQ ID NO：1～115中任一條序列所示的序列。

作為本發明的優選方案，上述靶序列為序列表中SEQ ID NO：4、5或12所示的序列。

根據本發明的第二方面，本發明提供CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的方法，該方法包括如下步驟：

(1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列對應的互補序列的兩端加上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；將合成的正向寡核苷酸序列與反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核苷酸；

(2)將上述雙鏈寡聚核苷酸連入線性化的攜帶Cas9基因的表達載體，得到攜帶含相應靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表達載體，轉化感受態細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆，并對陽性克隆搖菌、提取質粒；

(3)用上述攜帶有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表達載體、包裝質粒和包裝細胞系包裝出同時攜帶靶向SLA-3基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

(4)使用上述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養；然后收集被感染的目的細胞，以其基因組DNA為模板擴增包含上述靶序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確定SLA-3基因的敲除情況。

作為本發明的優選方案，上述表達載體為序列表中SEQ ID NO：116所示序列的載體。

作為本發明的優選方案，上述方法包括如下步驟：

(1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列對應的互補序列的5’-端加上AAAC序列、3’-端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；將合成的正向寡核苷酸序列與反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核苷酸；

(2)將上述雙鏈寡聚核苷酸連入如序列表中SEQ ID NO：116所示序列的表達載體lentiCRISPR v2經BsmB I限制性內切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶sgRNA寡聚核苷酸的重組表達載體lentiCRISPR v2-SLA-3，轉化感受態細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆，并對陽性克隆搖菌、提取質粒；

(3)用上述表達載體lentiCRISPR v2-SLA-3、包裝質粒和包裝細胞系包裝出同時攜帶靶向SLA-3基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

(4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養；然后收集被感染的目的細胞，以其基因組DNA為模板擴增包含上述靶序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確定SLA-3基因的敲除情況。

作為本發明的優選方案，上述包裝質粒為質粒pLP1、質粒pLP2和質粒pLP/VSVG；上述包裝細胞系為HEK293T細胞。

作為本發明的優選方案，上述目的細胞為豬PIEC細胞。

作為本發明的優選方案，上述以其基因組DNA為模板擴增包含上述靶序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確定SLA-3基因的敲除情況，具體為：

(a)以感染病毒的目的細胞的基因組DNA為模板，用SLA-3基因的上下游引物擴增包含上述sgRNA的靶序列的SLA-3基因片段，同時用相同引物擴增未感染病毒的野生型細胞的基因組DNA；

(b)純化上述擴增到的SLA-3基因片段，然后將來自感染病毒的目的細胞的SLA-3基因片段與來自野生型細胞的SLA-3基因片段等量混合，加熱變性、復性，形成雜交DNA分子；

(c)用Cruiser酶切割復性后的雜交DNA分子；

(d)電泳檢測酶切產物，檢測靶序列介導的SLA-3基因敲除效果。

根據本發明的第三方面，本發明提供在CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的方法中用到的重組表達載體lentiCRISPR v2-SLA-3，該重組表達載體的骨架載體的序列如序列表中SEQ ID NO：116所示；所攜帶的靶序列如第一方面的sgRNA的靶序列，優選序列表中SEQ ID NO：4、5或12所示的靶序列。

根據本發明的第四方面，本發明提供如第一方面所述的sgRNA或第三方面所述的重組表達載體lentiCRISPR v2-SLA-3在CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的方法中的用途。

本發明的針對CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因，成功地找到特異性靶向SLA-3基因的sgRNA，將本發明的sgRNA用于CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的方法中，能夠快速、精確、高效、特異性地敲除豬SLA-3基因，有效地解決構建SLA-3基因敲除豬周期長和成本高的技術問題。

附圖說明

圖1為本發明實施例中使用的載體質粒lentiCRISPR v2的質粒圖譜；

圖2為本發明實施例中使用的包裝質粒pLP1的質粒圖譜；

圖3為本發明實施例中使用的包裝質粒pLP2的質粒圖譜；

圖4為本發明實施例中使用的包裝質粒pLP/VSVG的質粒圖譜；

圖5為本發明實施例中酶切驗證靶序列的基因敲除效果的電泳檢測結果圖，其中M表示DNA Marker，4、5和12分別表示表1中第4號、第5號和第12號靶序列對SLA-3基因的靶向切割效果，WT表示未經過病毒感染和Cas9切割的野生型細胞的PCR產物Cruiser酶切檢測結果，箭頭處表示經Cruiser酶切割得到的小片段。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案做進一步說明。這些附圖和具體實施例不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

以下實施例中涉及的試驗材料和試劑：lentiCRISPR v2質粒購自Addgene公司，包裝質粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG購自Invitrogen公司，包裝細胞系HEK293T細胞購自美國模式培養物集存庫(ATCC)，PIEC細胞購自中國科學院細胞庫，DMEM培養基、Opti-MEM培養基和胎牛血清FBS購自Gibco公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中描述的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。

本發明的概括性的技術方案包括以下五個部分：

一、Sus scrofa(豬)SLA-3基因sgRNA靶序列的選擇和設計

1.SLA-3基因的sgRNA靶序列選擇：

在SLA-3基因外顯子區尋找合適的20bp寡核苷酸序列作為靶序列。

2.SLA-3基因的sgRNA靶序列設計：

將上述靶序列及互補序列分別添加接頭，形成正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列。

二、構建SLA-3基因的CRISPR載體

1.合成上述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，復性形成具有粘性末端的雙鏈DNA片段(即雙鏈靶序列寡聚核苷酸)。

2.構建CRISPR-sgRNA表達載體：

將上述雙鏈DNA片段構建至目標載體(如lentiCRISPR v2，其質粒圖譜如圖1所示)，形成如lentiCRISPR v2-SLA-3的慢病毒CRISPR載體。

三、獲得表達SLA-3sgRNA的假型慢病毒

利用包裝質粒、包裝細胞系與慢病毒CRISPR載體生產表達SLA-3sgRNA的CRISPR假型慢病毒。

四、感染目的細胞并檢測SLA-3基因敲除效果

1.慢病毒感染目的細胞：

將如lentiCRISPR v2-SLA-3的假型慢病毒加入目的細胞培養基進行感染并進一步培養。

2.檢測SLA-3基因敲除效果：

收集目的細胞，以基因組DNA為模板擴增包含靶序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確定SLA-3基因的敲除情況。

五、SLA-3基因敲除單克隆的挑選和鑒定

1.對于有確定敲除效果的目的細胞群，通過稀釋和單克隆培養，分離出若干單細胞來源的細胞株。

2.鑒定單克隆的SLA-3敲除情況。

以下通過實施例詳細說明本發明的技術方案及其有益效果。

實施例一、Sus scrofa(豬)SLA-3基因sgRNA靶序列的選擇和設計

靶序列決定了sgRNA的靶向特異性和誘導Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特異的靶序列選擇和設計是構建sgRNA表達載體的前提。

1.SLA-3基因的sgRNA靶序列選擇

針對SLA-3基因，在靶序列選擇上應該遵循下列原則：

(1)在SLA-3基因外顯子編碼區尋找符合5’-N(20)NGG-3’規則的靶序列，其中N(20)表示20個連續的堿基，其中每個N表示A或T或C或G，符合規則的靶序列可以位于正義鏈或反義鏈；

(2)選擇靠近N端的5個外顯子編碼區序列，這樣的編碼區序列的切割會造成SLA-3基因的功能敲除，殘留截短的序列不會形成有功能的蛋白；

(3)如果存在多種剪切體，則在共有外顯子編碼區進行選擇，針對SLA-3基因選擇靠近N端的5個外顯子編碼區序列即可滿足該條件；

(4)利用在線序列分析工具(http://crispr.mit.edu/)分析以上靶序列在豬基因組中的同源情況，舍棄存在顯著同源序列的靶序列，根據評分進一步挑選，所挑選的靶序列在SLA-3基因上是唯一的。

基于以上原則，選擇出表1所示的靶序列集合。

表1 靶序列集合

2.SLA-3基因的sgRNA靶序列設計：

(1)以lentiCRISPR v2質粒作為表達載體，根據lentiCRISPR v2質粒的特點，在上述N(20)靶序列的5’-端添加CACCG序列，形成正向寡核苷酸序列：

5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

(2)在上述N(20)靶序列的反向互補序列的兩端添加序列，形成反向寡核苷酸序列：

5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3’；

正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列可以互補形成具有粘性末端的雙鏈DNA片段：

5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。

實施例二、構建SLA-3基因的sgRNA表達載體

1.合成DNA插入片段

(1)合成上述設計的正向和反向寡核苷酸序列

寡核苷酸序列可以由商業化的公司(如Invitrogen公司)根據提供的序列具體合成。本實施例及以下實施例研究了表1中所列的第4號、第5號和第12號序列所示的靶序列對SLA-3基因的敲除效果。

第4號靶序列對應的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：

5’-CACCGGGCCCTGACTGGTACCCGGG-3’(SEQ ID NO：117)；

5’-AAACCCCGGGTACCAGTCAGGGCCC-3’(SEQ ID NO：118)。

第5號靶序列對應的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：

5’-CACCGGCCCTGACTGGTACCCGGGA-3’(SEQ ID NO：119)；

5’-AAACTCCCGGGTACCAGTCAGGGCC-3’(SEQ ID NO：120)。

第12號靶序列對應的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：

5’-CACCG CCTGGCCCTGACTGGTACCC-3’(SEQ ID NO：121)；

5’-AAACGGGTACCAGTCAGGGCCAGGC-3’(SEQ ID NO：122)。

將對應的正向和反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈DNA片段。

反應體系(20μL)如下所示：

正向寡核苷酸(10μM)：1μL

反向寡核苷酸(10μM)：1μL

10×PCR buffer：2μL

ddH₂O：16μL

將上述反應體系放入PCR儀，并按以下程序進行反應。

反應程序：

95℃,5min；

80℃,5min；

70℃,5min；

60℃,5min；

50℃,5min；

自然降至室溫。

2.構建sgRNA表達載體

(1)利用BsmB I限制性內切酶酶切目標載體lentiCRISPR v2質粒(其序列如序列表中SEQ ID NO：116所示)。

按照以下反應體系進行配制：

LentiCRISPR v2質粒：1μg

10×酶切buffer：2μL

BsmB I限制性內切酶：2μL

補充ddH₂O至總體積20μL

將酶切反應體系置于37℃反應4h。

(2)電泳分離并純化載體片段

酶切結束后，將酶切混合物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，選擇載體片段(約12kb)進行切割，并通過DNA凝膠回收柱進行回收。

(3)將合成的雙鏈DNA片段與載體主片段進行連接并轉化大腸桿菌

將復性得到的雙鏈DNA片段與回收得到的載體片段進行連接反應，按照以下反應體系進行配制：

LentiCRISPR v2載體片段：100ng

雙鏈DNA片段：200ng

T4連接酶：1μL

T4連接反應buffer：1μL

補充ddH₂O至總體積10μL

將連接混合物置于25℃反應2h。

反應結束后將連接混合物轉化大腸桿菌DH5α菌株：向連接混合物中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態細胞，冰上孵育30min；將混合物放入42℃水浴，熱激90s后放入冰上冷卻；向混合物加入100μL LB培養基，37℃搖床培養20min；將混合物涂Amp LB平板，37℃培養14h。

(4)鑒定正確的轉化克隆

從Amp LB平板上挑選若干菌落進行擴大培養，提取質粒進行酶切鑒定。挑選可能正確的克隆進行測序，驗證插入序列是否正確。對于正確的lentiCRISPR v2-SLA-3載體克隆進行保種。

實施例三、獲得表達SLA-3sgRNA的假型慢病毒

1.材料準備

擴增并抽提包裝質粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG(購自Invitrogen，其圖譜分別如圖2、圖3和圖4所示)；擴增并抽提載體質粒lentiCRISPR v2-SLA-3；培養包裝細胞系HEK293T細胞(購自ATCC)；DMEM培養基、Opti-MEM培養基和胎牛血清FBS(購自Gibco)；Lipofectamine2000(購自Invitrogen)；HEK293T細胞培養于含5％CO₂的37℃培養環境中，培養基為含10％FBS的DMEM培養基。

2.轉染和病毒包裝

第一天：將包裝細胞系HEK293T傳代至10cm dish，約30％融合度；

第二天：在HEK293T達到80％融合度時按照下列配方進行轉染：

配制混合物1，包含：

lentiCRISPR v2-SLA-3：6μg

pLP1：6μg

pLP2：6μg

pLP/VSVG：3μg

Opti-MEM：500μL。

配制混合物2，包含：

Lipofectamine 2000：30μL

Opti-MEM：500μL。

靜置5min后，將混合物1和混合物2混勻成轉染混合物，靜置20min。

將HEK293T培養基換為無血清DMEM培養基，加入轉染混合物，37℃培養8h后換為20％FBS的DMEM培養基，繼續培養。

3.病毒收集與保存

第三天：轉染48h后收集含病毒的HEK293T培養基上清，用0.45μm濾頭過濾后，分裝，放置-80℃保存。

實施例四、感染目的細胞并檢測靶序列的敲除效果

1.材料準備

培養目的細胞系豬髖動脈血管內皮細胞PIEC(購自中國科學院細胞庫)；DMEM培養基和胎牛血清FBS(購自Gibco)；不同靶序列(序列4、序列5和序列12)的lentiCRISPR v2-SLA-3假型慢病毒；PIEC細胞培養于含5％CO₂的37℃培養環境中，培養基為含10％FBS的DMEM培養基。

2.慢病毒感染目的細胞

第一天：將目的細胞傳代至6孔板，約20％融合密度。每一種病毒需要一個6孔，同時需要效率對照一個6孔。

第二天：待目的細胞約40％融合密度時加入1mL lentiCRISPR v2-SLA-3假型慢病毒上清及1mL DMEM培養基。效率對照不需要添加慢病毒。

第三天：感染24h后去除含病毒培養基，換成正常培養基，加入嘌呤霉素至終濃度2μg/mL，沒有感染病毒的效率對照樣品也同時加入嘌呤霉素作為對照，培養48h。

3.細胞感染效率檢測和培養

第五天：未感染的效率對照細胞在嘌呤霉素的作用下應該全部凋亡(>95％)。根據感染慢病毒細胞的凋亡情況判斷細胞的感染效率，通常可以達到90％以上的感染效率(凋亡率<10％)。必要時可以將病毒上清進行濃縮或梯度稀釋后進行感染以達到合適的感染效率。

經過嘌呤霉素篩選后，未感染的細胞發生凋亡。將目的細胞重新傳代并換為普通培養基培養48h。

4.檢測SLA-3基因敲除效果

(1)設計上下游引物以擴增SLA-3基因片段，其中上下游引物序列如下所示：

CTCGGGGTCTCAGGCTCCAGGGCGG(SEQ ID NO：123)

GGGCAGGAAACAAGGGAGGG(SEQ ID NO：124)。

目的擴增片段包含sgRNA靶序列，大小為487bp。靶序列至片段兩端的位置不少于100bp。

(2)收集部分目的細胞，使用promega基因組DNA試劑盒抽提基因組DNA。同時抽提野生型目的細胞的基因組DNA。

(3)以基因組DNA為模板擴增包含靶序列的SLA-3基因片段(包括感染的突變樣品和野生型樣品)。

擴增反應體系(20μL)如下：

上游引物(10μM)：1μL

下游引物(10μM)：1μL

2×PCR Mix：10μL

基因組DNA：100ng

以上述反應體系進行配制，放入PCR儀，并按下列程序進行反應。

反應程序：

95℃,3min

95℃,30s

58℃,20s

72℃,20s

72℃,3min；

其中第二步至第四步重復35個循環。

(4)電泳檢測PCR產物并回收純化

(5)將純化后的DNA片段分別加熱變性、復性，形成雜交DNA分子(包括突變樣品和野生型樣品)。

反應體系如下所示：

基因組PCR片段：200ng

5×反應buffer：2μL

反應體系共9μL

以上述反應體系進行配制，放入PCR儀，并按下列程序進行反應。

反應程序：

95℃,5min；

80℃,5min；

70℃,5min；

60℃,5min；

50℃,5min；

自然降至室溫。

(6)用Cruiser酶切割復性后的雜交DNA(包括突變樣品和野生型樣品)

向經過變性、復性的反應混合物加入1μL Cruiser酶，45℃孵育20min。

(7)電泳檢測酶切產物，檢測靶序列介導的SLA-3基因敲除效果。

將經過酶切的DNA片段用2％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，100V，25min。確定目的片段的切割情況，判斷靶序列的基因敲除效果。

對突變DNA的切割識別基于以下原理：經過感染的細胞會表達sgRNA和Cas9。基因組DNA如果被sgRNA介導的Cas9蛋白靶向切割，經過修復后會在切割位點附近引入突變(野生型變為突變型)。由于野生型和突變型序列在該位置不匹配，以此為模板擴增出的野生型DNA與突變型DNA經過變復性形成的雜交分子會就產生局部的環形(loop)結構。而后者可以被Cruiser酶識別并切斷，導致雜交DNA分子被切割成小片段。

結果如圖5所示，未經過病毒感染的野生型細胞的PCR產物未檢測到小片段；而序列4、序列5和序列12能夠有效靶向SLA-3基因產生切割，因此檢測到小片段的存在，表明序列4、序列5和序列12能夠作為CRISPR-Cas9特異性敲除豬SLA-3基因的靶序列。

實施例五、SLA-3基因敲除單克隆的挑選和鑒定

1.單克隆的挑選(基于序列4、序列5和序列12的靶序列)

(1)將部分感染的目的細胞群進行傳代，取100個單細胞轉移至10cm dish培養。

(2)培養約10天后，有相當數量的單克隆生長到肉眼可見的水平。

(3)用移液器頭刮取獨立的克隆，將細胞轉移至24孔板中培養，每個孔對應一個克隆。

(4)再經過約一周的培養后，有部分克隆長至足夠的數量，準備做進一步的鑒定。

2.鑒定單克隆的SLA-3敲除情況

(1)收集待檢的單克隆及野生型細胞，分別抽提基因組DNA。

(2)按照前述方法，分別擴增單克隆及野生型細胞的SLA-3基因片段，所擴增的基因片段包含sgRNA靶序列。

(3)將等量的單克隆PCR片段與野生型PCR片段混合，加熱變性、復性，形成雜交DNA分子。

(4)用Cruiser酶切割退火后的雜交DNA，45℃孵育20min。

(5)電泳檢測酶切產物，根據是否有切割片段確定單克隆是否發生有效突變。

結果顯示，基于序列4所示的靶序列的lentiCRISPR v2-SLA-3假型慢病毒感染目的細胞，從100個單細胞中隨機挑選的20個單克隆經Cruiser酶酶切電泳檢測，其中有17個單克隆能檢測到切割小片段，表明基因敲除發生，基因敲除效率能夠達到85％以上，說明序列4所示的靶序列具有很高的靶向敲除SLA-3基因的作用。基于序列5所示的靶序列的lentiCRISPR v2-SLA-3假型慢病毒感染目的細胞，從100個單細胞中隨機挑選的20個單克隆經Cruiser酶酶切電泳檢測，其中有19個單克隆能檢測到切割小片段，表明基因敲除發生，基因敲除效率能夠達到95％以上，說明序列5所示的靶序列具有很高的靶向敲除SLA-3基因的作用。基于序列12所示的靶序列的lentiCRISPR v2-SLA-3假型慢病毒感染目的細胞，從100個單細胞中隨機挑選的20個單克隆經Cruiser酶酶切電泳檢測，其中有18個單克隆能檢測到切割小片段，表明基因敲除發生，基因敲除效率能夠達到90％以上，說明序列12所示的靶序列具有很高的靶向敲除SLA-3基因的作用。

以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。