一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝。本發明采用復合誘變技術篩選出透明質酸產率高的菌種，結合發酵技術，透明質酸產品產出率高，可達7-9g/L。發酵得到的透明質酸易于分離純化，生產周期短。生產易于控制，適合工業化大規模生產，收率高，并且大大降低了生產成本。
【專利說明】一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物多糖提取【技術領域】，特別是涉及一種獸疫鏈球菌及用其制備透明 質酸的生產工藝。
【背景技術】
[0002] 國內目前有十幾家透明質酸的生產廠家，且這些企業大多數是用動物組織提取 法。從動物組織中提取Η A常用的原料有雞冠、臍帶和豬皮等，主要工藝過程包括脫水、磨 碎、浸泡、提取、除雜、沉淀和分離。這種方法的特點是工藝流程簡單，適用于原料來源分散 的小規模生產。但由于原料有限，且原料中Η A的含量低，同時Η A又還與硫酸軟骨素等粘 多糖共存于生物組織中，致使其收率低、提純難、成本過高、產品質量差，且難以應用于大規 模生產。隨著Η A需求量的不斷增大，迫切要求生產大量的高質量Η A，動物組織提取法己 不能適應這種要求。國外從上世紀70年代開始研究利用發酵法生產透明質酸，采用發酵法 生產的透明質酸質量穩定、原料易得，成本低。
[0003] 目前微生物發酵法生產透明質酸采用的工藝發酵周期長、產物相對分子量低、產 品透光率差、蛋白質含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明質酸的形態為纖維狀，不易溶解。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種獸疫鏈球菌及用其制備透明 質酸的生產工藝。本發明采用復合誘變技術篩選出透明質酸產率高的菌種，結合發酵技術， 透明質酸產品產出率高，可達7-9g/L。發酵得到的透明質酸易于分離純化，生產周期短。生 產易于控制，適合工業化大規模生產，收率高，并且大大降低了生產成本。
[0005] 本發明的一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝技術方案為，一種獸疫 鏈球菌(SirepiococciAs zooepiofeffiiciAs) AWA008,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心保藏，其保藏編號是：CGMCCNo. 9111，保藏日期是2014年04月29日。
[0006] 目前該獸疫鏈球菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地 址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101，其保藏編號是：CGMCCNo. 9111，菌種 的拉丁文名稱是SirepiococciAs 參據的微生物(株）：AWA008,保藏日期是 2014年04月29日。
[0007] 本發明所述的獸疫鏈球菌菌株特征：呈球形或卵圓形，呈鏈狀排列，有莢膜，無芽 孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。
[0008] 所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，包括以下步驟： (1) 搖瓶種子液培養：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養液的1L錐形瓶中，培養，鏡檢觀 察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴配：將培養液加入到種子罐中，進行蒸汽滅菌后，按無菌要求在種子罐里加 入菌種培養，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中； (3) 發酵； (4)提純。
[0009] 所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，具體為： (1) 搖瓶種子液培養：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養液的1L錐形瓶中，37°C培養 12-16小時，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴配：將培養液加入到種子罐中，進行蒸汽滅菌后，設定溫度36. 3°C、pH6. 86， 按無菌要求在種子罐里加入菌種，維持罐壓〇. 〇5MPa，培養12-16小時，鏡檢觀察菌體生長 良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中； (3) 發酵：將一半發酵培養液加入到發酵罐中，進行蒸汽滅菌后，設定溫度36. 3°C、 pH6. 86,維持罐壓0.05MP，將種子罐的培養基全部壓入到發酵罐中，記錄pH值，在pH下降時 加入另一半發酵培養液，保持各項指標，發酵液pH每分鐘下降幅度小于0. 01時結束發酵， 檢測發酵液粘度，將發酵液壓入沉淀罐中； (4) 提純，包括以下工藝： ① 前沉淀：向沉淀罐里在攪拌情況下緩緩地加入95%的酒精，至產生雪花狀沉淀，控制 在47-50度(折至20°C時的酒精度)，收集沉淀物； ② 溶解：用氯化鈉溶液將沉淀物溶解，調節pH至9. 3-9. 5,加入EDTA、活性炭、珍珠巖， 攪拌均勻； ③ 過濾：將溶解后的料液壓入1#大板框過濾一遍后，過濾液調PH9. 3-9. 5。再加入白 硅藻土和珍珠巖后，攪拌均勻后，壓入2#大板框過濾第二遍。二遍過濾液中加入硅藻土，攪 拌均勻后，料液通過不銹鋼板打循環澄清后，過濾第三遍，澄清度在99. 5%以上，然后過濾 液通過聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐； ④ 后沉淀：料液調pH至7. 0-7. 3,攪拌下緩緩地加入95%酒精至沉淀產生，控制酒精度 數47-50度即可。靜止20-40分鐘后將上清液打入廢酒精罐； ⑤ 脫水離心：用75%-80%的pH值在7. 0-7. 3之間的酒精脫水6-7次，然后再用90%的 酒精脫水2-3次，脫水后酒精度數到90%以上，靜止1小時左右，打走上清液，取樣測pH值， 并控制在7. 0-7. 3之間。攪拌15-20分鐘后離心； ⑥ 干燥：將離心好的物料放入干燥罐，設定溫度30°C，抽真空干燥3小時后，每小時升 溫5°C，設溫60°C時停止，檢測水分，水分小于7%后出罐。
[0010] 步驟（1)、（2)、（3)中的培養液包括按重量百分比的葡萄糖3-5%、酵母粉1. 5-2%、 七水硫酸鎂1-2%、四水硫酸錳0. 01-0. 1%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、磷酸氫二鈉0. 5-0. 8%、碳 酸鈣0. 1-1%、氯化鋅0. 05-0. 1%，余量為水。
[0011] 步驟②氯化鈉溶液濃度為1-5%。
[0012] 步驟②中，加入EDTA、活性炭、珍珠巖質量比為，1: 10-15: 20-30。
[0013] 優選的，加入EDTA、活性炭、珍珠巖質量比為，1:11: 25。
[0014] 步驟③中，白硅藻土和珍珠巖的質量比為1:1-10。
[0015] 優選的，白硅藻土和珍珠巖的質量比為1:1. 5。
[0016] 步驟③中過濾液通過0. 22微米聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐。
[0017] 本發明的有益效果為： 1.本發明采用復合誘變技術篩選出透明質酸產率高的菌種，結合發酵技術，透明質酸 產品產出率高，可達7-9g/L。發酵得到的透明質酸易于分離純化，生產周期短。
[0018] 2.本發明生產工藝簡單，原輔料常見易得，生產易于控制，雜質含量更低，適合工 業化大規模生產，收率高，并且大大降低了生產成本。
[0019]
【具體實施方式】： 為了更好地理解本發明，下面用具體實例來詳細說明本發明的技術方案，但是本發明 并不局限于此。
[0020] 實施例1 本發明的一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝技術方案為，一種獸疫鏈球 菌(SirepiococciAs AWA008,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心保藏，其保藏編號是：CGMCCNo. 9111，保藏日期是2014年04月29日。
[0021] 目前該獸疫鏈球菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地 址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101，其保藏編號是：CGMCCNo. 9111，菌種 的拉丁文名稱是SirepiococciAs 參據的微生物(株）：AWA008,保藏日期是 2014年04月29日。
[0022] 本發明所述的獸疫鏈球菌菌株特征：呈球形或卵圓形，呈鏈狀排列，有莢膜，無芽 孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。
[0023] 所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，包括以下步驟： (1) 搖瓶種子液培養：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養液的1L錐形瓶中，37°C培養 12-16小時，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴配：將培養液加入到種子罐中，進行蒸汽滅菌后，設定溫度36. 3°C、pH6. 86， 按無菌要求在種子罐里加入菌種，維持罐壓〇. 〇5MPa，培養12-16小時，鏡檢觀察菌體生長 良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中； (3) 發酵：將一半發酵培養液加入到發酵罐中，進行蒸汽滅菌后，設定溫度36. 3°C、 pH6. 86,維持罐壓0.05MP，將種子罐的培養基全部壓入到發酵罐中，記錄pH值，在pH下降時 加入另一半發酵培養液，保持各項指標，發酵液pH每分鐘下降幅度小于0. 01時結束發酵， 檢測發酵液粘度，將發酵液壓入沉淀罐中； (4) 前沉淀：向沉淀罐里在攪拌情況下緩緩地加入95%的酒精，至產生雪花狀沉淀，控 制在47-50度(折至20°C時的酒精度)，收集沉淀物； (5) 溶解：用氯化鈉溶液將沉淀物溶解，調節pH至9. 3-9. 5,加入EDTA、活性炭、珍珠巖， 攪拌均勻； (6) 過濾：將溶解后的料液壓入1#大板框過濾一遍后，過濾液調pH9. 3-9. 5。再加入白 硅藻土和珍珠巖后，攪拌均勻后，壓入2#大板框過濾第二遍。二遍過濾液中加入硅藻土，攪 拌均勻后，料液通過不銹鋼板打循環澄清后，過濾第三遍，澄清度在99. 5%以上，然后過濾 液通過聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐； (7) 后沉淀：料液調pH至7. 0-7. 3,攪拌下緩緩地加入95%酒精至沉淀產生，控制酒精 度數47-50度即可。靜止20-40分鐘后將上清液打入廢酒精罐； (8) 脫水離心：用75%-80%的pH值在7. 0-7. 3之間的酒精脫水6-7次，然后再用90% 的酒精脫水2-3次，脫水后酒精度數到90%以上，靜止1小時左右，打走上清液，取樣測pH 值，并控制在7. 0-7. 3之間。攪拌15-20分鐘后離心； (9) 干燥：將離心好的物料放入干燥罐，設定溫度30°C，抽真空干燥3小時后，每小時升
【權利要求】
1. 一種獸疫鏈球菌(SirepiococciAs zooepiofeffiiciAs) AWA008,其在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是：CGMCCNo. 9111，保藏日期是2014年04 月29日。
2. 用權利要求1所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 搖瓶種子液培養：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養液的1L錐形瓶中，培養，鏡檢觀 察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴配：將培養液加入到種子罐中，進行蒸汽滅菌后，按無菌要求在種子罐里加 入菌種培養，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中； (3) 發酵； (4) 提純。
3. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟 (1 )、（ 2)、（ 3)中的培養液包括按重量百分比的葡萄糖3-5%、酵母粉1. 5-2%、七水硫酸鎂 1-2%、四水硫酸錳0. 01-0. 1%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、磷酸氫二鈉0. 5-0. 8%、碳酸鈣0. 1-1%、 氯化鋅0. 05-0. 1%，余量為水。
4. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟（1) 中，培養條件為：37°C培養12-16小時。
5. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟（2) 中，種子罐培養條件為溫度36. 3°C、pH6. 86,培養時間為12-16小時。
6. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟（2) 中，種子罐罐壓0. 〇5MPa。
7. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟（3) 中，發酵罐培養條件為溫度36. 3°C、pH6. 86。
8. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟（3) 中，發酵罐罐壓0. 05MP。
9. 根據權利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，其特征在于，步驟（3) 中發酵罐培養過程具體為將一半發酵培養液加入到發酵罐中，進行蒸汽滅菌后，將種子罐 的培養基全部壓入到發酵罐中，記錄pH值，在pH下降時加入另一半發酵培養液，保持各項 指標，發酵液pH每分鐘下降幅度小于0. 01時結束發酵，檢測發酵液粘度，將發酵液壓入沉 淀罐中。
【文檔編號】C12R1/46GK104059865SQ201410257052
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月11日 優先權日:2014年6月11日
【發明者】韓秀云, 李松田 申請人:濱州安華生物工程有限公司