冬蟲夏草中國被毛孢蘋果酸脫氫酶a、編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與三羧酸循環用于檸檬酸合成中的蘋果酸脫氫酶A，編碼這個酶的基因及其應用。所述蘋果酸脫氫酶A的氨基酸序列與SEQ?ID?No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其編碼基因核苷酸序列與SEQ?ID?No.2所示序列具有90％以上同源性。本發明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節催化蘋果酸制備相應的草酰乙酸的酶對應編碼基因的表達，賦予宿主蘋果酸脫氫酶A的高表達性，為擴大蘋果酸脫氫酶A的生物應用提供了有效途徑，具有重大應用前景。
【專利說明】冬蟲夏草中國被毛孢蘋果酸脫氫酶A、編碼基因及其應用(—)
【技術領域】
[0001]本發明涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與三羧酸循環用于檸檬酸合成中的蘋果酸脫氫酶A (Malic dehydrogenase),編碼這個酶的基因及其應用。
(二)
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。
[0003]冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004]但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中蘋果酸脫氫酶的研究幾乎為空白，尤其在參與三羧酸循環用于檸檬酸合成中的蘋果酸脫氫酶的研究上。
[0005]蘋果酸脫氫酶(EC: 1.1.1.37)是催化L-蘋果酸脫氫變成草酰乙酸的酶。它以NAD+作為電子受體。廣義上也包括以NAD+或NADP+作為受體而生成丙酮酸和碳酸的蘋果酸酶(EC: 1.1.1.38-40)。與NADP+也有弱反應，也可將其它羥酸脫氫。廣泛存在于線粒體、細菌細胞膜上，為三羧酸循環中的一種酶。由于酶的來源不同，其某些性質也不一樣。蘋果酸在蘋果酸脫氫酶催化下脫氫生成草酰乙酸，脫下的氫由NAD+接受生成NADH+H+。再生的草酰乙酸可再次進入三羧酸循環用于檸檬酸的合成。
[0006]蘋果酸脫氫酶普遍存在于動物，植物，細菌各種生物體中，具有高度的保守性。蘋果酸脫氫酶不僅參與眾多生理活動，包括C4循環，呼吸作用，脂肪酸的氧化，TCA循環等，而且在種子萌發，植物生長，花粉發育，果實發育，植物抗逆等方面發揮重要作用。
[0007]1993年,F Cendrin等人從極端嗜鹽古細菌Haloarcula marismortui中分離和測序了一個編碼的酶蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因。該酶是由303個氨基酸組成，其分子量為32638道爾頓。
[0008]2008年，朱文滴等人以實驗室構建的草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸道cDNA文庫蘋果酸脫氫酶(cMDH)EST序列為基礎，采用末端快速擴增法(RACE)，從健康雌性草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸道細胞RNA中獲得139Ibp的草魚腸道cMDH的cDNA序列(NCBI登錄號:EU569765)。結果顯示:該序列包含62bp的5’非編碼區(5’ -UTR)，330bp的3’非編碼區(3’ -UTR)，典犁加尾信號AATAA位于polyA起點上游16bp。開放閱讀框ORF長999bp，共編碼333個氨基酸，預測蛋白等電點為6.67，大小為36kDa。
[0009]2008年，姚玉欣等人從蘋果果實中分離了 cyMDH的全長cDNA序列，該序列含有一個996bp的開放閱讀框(ORF)。序列同源性分析表明Mal-cyMDH與其他物種cyMDH有較高的同源性。原核表達得到一個37kD左右的融合蛋白，酶活測定表明該酶主要催化合成蘋果酸。
[0010]2011年，李倩等人以大腸桿菌基因組DNA為模板，擴增得到蘋果酸脫氫酶(mdh)編碼基因mdh，構建了重組菌pET-28a-mdh/BL21并成功表達了蘋果酸脫氫酶，大小約36000。選用Ni柱親和層析法純化具有活性的蘋果酸脫氫酶，純化后比酶活達到112.5U/mg，純化倍數達2.62倍，回收率為59%。
[0011]2011年，G Nava等人從豬帶絳蟲胞漿中克隆到了一個蘋果酸脫氫酶的完整編碼序列。這個蘋果酸脫氫酶的cDNA序列從豬帶絳蟲基因組項目數據庫發現，編碼332個氨基酸殘基的蛋白質，分子量大約為36.5kDa。
[0012]2012年，李文爽等人利用電子克隆技術獲得大豆中的蘋果酸脫氫酶基因cDNA序列，并對基因及其編碼蛋白進行生物信息學分析和預測，為進一步克隆該基因、解決植物磷高效基因數量缺乏等問題提供依據。結果表明，大豆中的蘋果酸脫氫酶基因(GmMDHl)cDNA序列長度為1574bp，開放閱讀框1230bp，編碼409個氨基酸殘基。
[0013]2013年，YY Chang等人從Thermus thermophilus的基因組中擴增到了一個蘋果酸脫氫酶基因，并且克隆島pET21b載體上進行了表達。該蛋白在大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中以可溶形式存在。
[0014]但是，目前NCBI數據庫中目前還檢索不到中國被毛孢中蘋果酸脫氫酶的基因相關信息。
(三)
【發明內容】
[0015]本發明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢在參與三羧酸循環用于檸檬酸合成中的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了 “百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢在參與三羧酸循環用于檸檬酸合成中的一種蘋果酸脫氫酶A、以及編碼基因及其應用。
[0016]本發明采用的技術方案是:
[0017]一種參與中國被毛孢在三羧酸循環用于檸檬酸合成中的蘋果酸脫氫酶A (Malicdehydrogenase),與SEQ ID N0.1所示氨基酸序列具有90%以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0018]優選的，所述蘋果酸脫氫酶A氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(記為mdhA蛋白);該酶可催化蘋果酸制備相應的草酰乙酸。
[0019]本發明述蘋果酸脫氫酶A來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢。
[0020]由蘋果酸經過蘋果酸脫氫酶A的催化獲得對應草酰乙酸的路徑如下所示:
[0021]
【權利要求】
1.一種冬蟲夏草中國被毛孢蘋果酸脫氫酶A，其特征在于所述脫氫酶A的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.如權利要求1所述的蘋果酸脫氫酶A在生物催化蘋果酸制備草酰乙酸中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為:以含蘋果酸脫氫酶A基因的重組工程菌經誘導培養獲得的濕菌體用pH8.0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎后，離心，取上清液為催化劑，以0.1M蘋果酸水溶液為底物，以3.75mM的NADH水溶液為輔酶，于pH值為7.0的磷酸緩沖液中，37°C下反應，反應結束后，將反應液離心，取上清液即獲得含草酰乙酸的混合液。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述底物的體積用量以蘋果酸質量計，所述蘋果酸的初始濃度為0.05M，所述催化劑的體積用量以破碎前濕菌體的質量計為4.2g/L，所述反應體系中NADH的用量為3.75 μ mol/L。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備:將含蘋果酸脫氫酶A基因的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min培養過夜，取培養物，以體積濃度2%接種量轉接于含有終濃度50 μ g/ml Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min培養至菌體濃度0D600為0.6~0.8，向培養物中加入終濃度0.05mmol/L的IPTG誘導培養8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超聲破碎，離心，取上清液即為催化劑。
6.一種編碼權利要求1所述蘋果酸脫氫酶A的基因。
7.如權利要求6所述 的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如權利要求6或7所述的編碼基因在構建能夠生物催化蘋果酸制備草酰乙酸的基因工程菌中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的應用為:構建含有所述蘋果酸脫氫酶A基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離純化獲得含有蘋果酸脫氫酶A基因的菌體細胞。
【文檔編號】C12N15/70GK104130985SQ201410308610
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】柳志強, 鄭裕國, 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 袁水金, 王鴻艷 申請人:浙江工業大學, 杭州中美華東制藥有限公司