Npr3基因在制備診斷試劑盒中的用途

Npr3基因在制備診斷試劑盒中的用途
【專利摘要】本發明公開了NPR3基因在制備診斷骨肉瘤的試劑盒中的用途。本發明利用NCBI?GEO數據檢索將符合要求的8套骨肉瘤病例和正常人群基因組mRNA表達芯片數據納入研究范圍，通過對上述芯片數據進行Meta分析，篩選出NPR3基因是差異顯著基因，相比正常組織，NPR3基因在骨肉瘤組織中表達下調，并使用熒光實時定量PCR方法驗證了上述結論。據此，本發明還公開了一種診斷骨肉瘤的試劑盒以及利用該試劑盒診斷骨肉瘤的方法。本發明一方面為研究骨肉瘤的分子機理提供新的思路，另一方面為早期診斷骨肉瘤提供了更為靈敏的診斷試劑盒。
【專利說明】NPR3基因在制備診斷試劑盒中的用途 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種骨肉瘤診斷試劑盒及NPR3基因在制備骨肉 瘤診斷試劑盒中的應用。 【背景技術】
[0002] 在轉錄組研究中應用最早及最廣泛的為基因芯片技術，首先從待檢測樣品中提取 RNA，并利用熒光標記的核苷酸將其反轉錄成cDNA，經過標記的核苷酸序列可與基因芯片 特定位點上的探針雜交，經檢測雜交信號而獲取細胞基因表達信息。基因芯片技術已成為 一項非常穩定可信的實驗技術，目前公布的大量轉錄組數據主要是利用基因芯片技術產生 的。
[0003] 骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性腫瘤，其主要致病特征為體內增殖的腫瘤細胞直 接形成未成熟骨或骨樣組織，是一種人類骨骼系統最常見的原發性惡性腫瘤。目前，國內篩 選該疾病的相關基因主要采用的是基因芯片技術構建表達譜的方法。隨著生物技術的發 展，實驗研究產生了大量的基因芯片數據，并通過基因表達芯片篩選出了影響骨肉瘤發生 發展的基因及信號通路，已鑒別出大量差異表達的基因。但是不同的實驗平臺及樣本的差 異導致各個基因芯片的分析結果存在很多不一致性。
[0004] Meta分析可對同一個問題所發表相關研究報告的結果進行收集、統計上的整合， 以期獲得更準確或更多的結果。這個分析能產生很多顯著的差異表達基因，能避免單個研 究帶來的不正確性。Meta分析是在多個芯片實驗研究中識別差異表達基因的強有力工具。 此外，用Meta分析能識別出單個研究不能識別的差異基因，并且能有效地降低單個芯片數 據的假陽性。
[0005] 本發明通過對已發表的骨肉瘤轉錄組表達數據進行Meta分析，篩選出影響骨肉 瘤發生發展的關鍵基因，并使用熒光實時定量PCR(QPCR)檢測驗證臨床樣本中的表達，本 發明通過生物信息學手段發掘這些基因在骨肉瘤中的作用，從而對骨肉瘤的發病機理進行 探究，為其診斷和治療提供一定的研究基礎。
【發明內容】

[0006] 本發明通過對已發表的骨肉瘤轉錄組表達數據進行Meta分析和QPCR驗證，發現 NPR3基因在骨肉瘤組織中的表達與在正常組織中的表達存在差異。與正常組織相比，NPR3 基因在骨肉瘤組織中表達下調，通過檢測NPR3基因轉錄水平的表達情況，可以判斷受試者 是否患有骨肉瘤。
[0007] 本發明的目的在于提供NPR3基因在制備骨肉瘤診斷試劑盒中的用途。所述診斷 試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈式反應體系、用于擴增NPR3基因和管家基因的引物對。 SYBR Green聚合酶鏈式反應體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0008] 上述技術方案中，PCR緩沖液為本領域技術人員公知的現有技術，優選地，PCR緩 沖液包含：25mM KC1，2. 5mM MgCl2,200mM(NH4)2S04。
[0009] 引物對是本領域技術人員可以根據引物設計的常規設計原則設計。優選的實 施方案中，擴增NPR3基因的正向引物序列為5 ' -TATAACTCAACACGGAAC-3 '，反向引物序 列為5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；管家基因優選GAPDH，擴增該基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0010] 在本發明的一個具體的實施方案中，本發明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉錄體 系，該逆轉錄體系包含：T重復寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0011] 優選逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2， 50mM 的 DTT。
[0012] RNA酶抑制劑可選用本領域常用的RNA酶抑制劑，優選為大腸桿菌表達的非競爭 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0013] 在本發明的一個具體的實施方案中，本發明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0014] 本發明的診斷試劑盒保存于-20°c，盡量減少反復凍融。
[0015] 本發明的又一個目的在于提供一種診斷骨肉瘤的試劑盒。所述診斷試劑盒包含 SYBR Green聚合酶鏈式反應體系、用于擴增NPR3基因和管家基因的引物對。所述SYBR Green聚合酶鏈式反應體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0016] 上述技術方案中，PCR緩沖液為本領域技術人員公知的現有技術，優選地，PCR緩 沖液包含：25mM KC1，2. 5mM MgCl2,200mM(NH4)2S04。
[0017] 引物對是本領域技術人員可以根據引物設計的常規設計原則設計；優選的實 施方案中，擴增NPR3基因的正向引物序列為5 ' -TATAACTCAACACGGAAC-3 '，反向引物序 列為5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；管家基因優選GAPDH，擴增該基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0018] 在本發明的一個具體的實施方案中，本發明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉錄體 系，該逆轉錄體系包含：T重復寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0019] 優選逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2， 50mM 的 DTT。
[0020] RNA酶抑制劑可選用本領域常用的RNA酶抑制劑，優選為大腸桿菌表達的非競爭 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0021] 在本發明的一個具體的實施方案中，本發明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0022] 本發明還提供了診斷骨肉瘤的方法，所述方法包括：
[0023] (1)利用RNA提取試劑提取樣本總RNA ;
[0024] (2)將步驟（1)獲得的RNA逆轉錄成cDNA ;
[0025] (3)在熒光實時定量PCR儀上將NPR3基因和管家基因進行擴增檢測；
[0026] (4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ Λ CT法進行相對定量；
[0027] (5)NPR3基因表達下調，表明研究對象為骨肉瘤患者。
[0028] 步驟（1)的具體實施方法為：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預冷 的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：
[0029] ①加入Trizol，室溫保存5min ;
[0030] ②加氯仿0. 2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ;
[0031] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70%)到另一新離心管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管，加入等體積的_20°C預冷異丙醇，充分顛倒 混勻，置于冰上lOmin ;
[0032] ④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ;
[0033] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0034] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C。
[0035] 步驟（2)的具體實施方法為：用逆轉錄緩沖液對1 μ g總RNA進行逆轉錄合成 cDNA。采用25 μ 1反應體系，每個樣品取1 μ g總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入 以下組分：DEPC 水，5X 逆轉錄緩沖液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV RT，模板 RNA。42°C孵育 lh，72°C 10min，短暫離心。
[0036] 步驟（3)的具體實施方法為：采用25 μ 1反應體系，每個樣本設置3個 平行管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。配制以下反應體系： SYBR Green聚合酶鏈式反應體系12. 5μ1，正向引物（5μΜ/μ1)1μ1，反向引物 (5 μ Μ/ μ 1) 1 μ 1，模板CDNA2. 0 μ 1，無酶水8. 5 μ 1 ;擴增NPR3基因的正向引物序列 為 5' -TATAACTCAACACGGAAC-3'，反向引物序列為 5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；擴 增GAPDH基因的正向引物序列為5 ' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3 '，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'，各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95°C 10min，（95°C 15s，60°C 60s) *45個循環。以SYBR Green作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR 儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ ACT法進行相對定量。
[0037] 本發明的優點和有益效果在于：（1)本發明首次公開了 NPR3基因與骨肉瘤相關， NPR3基因有望成為診斷骨肉瘤的分子標志物，并為研究骨肉瘤的分子機理提供新的思路。 (2)利用檢測基因表達的方式診斷骨肉瘤的存在與否的方法更加靈敏，有利于疾病早期的 診斷。 【專利附圖】

【附圖說明】：
[0038] 圖1表示熒光實時定量PCR測定在正常組織和骨肉瘤組織中NPR3基因 mRNA的相 對表達量。
[〇〇39] 具體的實施方式：
[〇〇4〇] 下面結合具體的實施例進一步說明本發明，本發明的實施例僅用于解釋本發明， 并不意味著限制本發明的保護范圍。
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[〇〇43] 實施例1篩選與骨肉瘤相關的基因
[0044] 1. 1NCBI GEO (Gene Expression Omnibus)數據檢索
[0045] GEO (Gene Expression Omnibus)數據庫是由NCBI (美國國立生物技術信息中心） 開發維護，GE0數據庫作為最大的基因表達數據的數據庫，該數據庫以芯片數據為主，此外 亦包含一些非芯片類型的數據如SAGE (基因表達系列分析）數據、SARST (核糖體序列標簽 連續分析）數據、MS (質譜）數據、蛋白質組數據和新一代高通量測序數據（MPSS，大規模平 行測序技術）等。
[0046] a.檢索關鍵詞：
[0047] {" osteosarcoma/7 [MeSH Terms]0R osteosarcoma [All Fields])AND/7 Homo sapi ens" [porgn]
[0048] b.研究中的樣本篩選策略：
[0049] 限制研究類型為"expression profiling by array"符合以下標準的數據集將納 入我們的研究中：①所選數據集必須是全基因組的表達mRNA芯片數據；②這些數據來自于 骨肉瘤病例組和對照組的活檢組織或培養的細胞（無藥物刺激或被轉染）；③本研究均考 慮經標準化或者原始數據集；④所選數據集必須包括超過3個樣本以上。最后，有8套芯片 數據集納入我們的研究中（表1所示）。
[0050] 表1 8套骨肉瘤全基因組數據集的基本情況
[0051]
【權利要求】
1. NPR3基因在制備骨肉瘤診斷試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒包含 SYBR Green聚合酶鏈式反應體系、用于擴增NPR3基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈式反應體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述擴增NPR3基因的引物 對的序列如下：正向引物序列為5' -TATAACTCAACACGGAAC-3'，反向引物序列為 5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；所述管家基因是GAPDH，擴增GAPDH基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
3. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：25mM KCL、2. 5mM MgCL2、200mM(NH4)2S04。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV 逆轉錄體系，所述逆轉錄體系包含：T重復寡核苷酸Oligo dT、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄 酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
5. 根據權利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
6. -種骨肉瘤的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈 式反應體系、用于擴增NPR3基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈式反應體 系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
7. 根據權利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述擴增NPR3基因的引 物對的序列如下：正向引物序列為5 ' -TATAACTCAACACGGAAC-3 '，反向引物序列為 5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；所述管家基因是GAPDH，擴增GAPDH基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
8. 根據權利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：25mM KCL、 2. 5mM MgCL2,200mM(NH4)2S04〇
9. 根據權利要求6-8中任一項所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還 包含M-MLV逆轉錄體系，所述逆轉錄體系包含：T重復寡核苷酸Oligo dT、逆轉錄反應液、 M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
10. 根據權利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087667SQ201410321627
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2014年7月8日
【發明者】楊祚璋, 謝琳, 許達, 李東奇, 楊義豪, 張婭 申請人:楊祚璋