植物冷誘導強表達啟動子Poscold4及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種植物冷誘導強表達啟動子Poscold4及其應用。本發明還提供了含有該啟動子的表達盒、植物表達載體、宿主菌和轉化子。具體而言，本發明將上述啟動子應用在植物基因工程中。本發明提供的啟動子能夠特異地驅動外源基因在低溫/冷脅迫條件下在植物中表達，因此在基因工程中用該啟動子替代組成型啟動子驅動抗寒基因，既可以有效的提高低溫下轉基因植物的耐寒性，又將避免常溫下抗寒基因的無效表達，從而達到對抗寒基因的最佳利用。
【專利說明】植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術和植物基因工程【技術領域】。具體而言，本發明涉及一種植物冷誘導強表達啟動子及其應用，該啟動子能夠在水稻轉基因調控體系中驅動目標基因在植株中表達。
【背景技術】
[0002]低溫寒冷是植物遇到的一種常見的環境脅迫因子，過低溫度或持續低于生長最適溫度會對植物/作物生產造成重要影響。苗期低溫，可能抑制萌發，降低出苗率；破壞光合反應中心，降低光合作用；大量產生活性氧，破壞和失活蛋白質、脂類等生物大分子，直接損傷細胞；最終抑制植物生長，甚至導致植株死亡。而在生殖生長時期，低溫導致配子體發育不完全，花粉敗育，直接影響產量。每年全球因低溫傷害造成的農作物損失高達數千億美元，因此如何克服低溫傷害，培育抗低溫的基因工程作物是作物分子設計育種的熱點問題。
[0003]植物中存在著一個復雜的低溫脅迫信號應答網絡系統。植物在受到低溫脅迫后能通過該系統進行一系列的基因遺傳修飾，對自身的代謝和生長進行調節以適應該不利因素對其造成的影響。利用這一應答網絡中關鍵基因，可以有效提高植物對低溫的耐受性。但目前基因工程操作中，多使用組成型啟動子驅動這些關鍵節點基因過表達，所獲轉基因植株雖然能夠表現出較強的低溫耐性，但組成型啟動子帶來的不必要表達往往造成植株的矮小，發育延滯和物質能量浪費，不利于潛在的實際應用推廣。因此，利用冷誘導啟動子，僅在低溫脅迫時激活關鍵調控基因，將是抗冷基因工程改良的主要發展方向之一。
[0004]目前已有部分冷誘導啟動子的報道，如擬南芥PCBF3等。這些啟動子雖然可以較為特異的響應環境低溫脅迫誘導，但或多或少的存在本底表達泄露、誘導后強度不足支撐功能基因充分發揮抗冷作用等缺陷。因此，分離鑒定低本底、誘導倍數高、誘導后高表達的新型冷誘導啟動子對作物基因工程將有著重要意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種驅動外源基因在低溫誘導條件下表達的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。其中，本文中所涉及的“植物”是指單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻。
[0006]為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種植物冷誘導強表達啟動子，所述植物冷誘導強表達啟動子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻冷誘導強表達啟動子，本文中稱為PoscolcM或啟動子Poscold4。具體而言,本申請的發明人發現日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare) L0C_0s03g52410.1基因上游包括轉錄起始位點在內的1841bp的DNA序列，具有驅動目標基因在寒冷條件下特異性表達的的功能,并且分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0007]優選地，本發明提供的植物冷誘導強表達啟動子的DNA序列為SEQ ID No:l所示的序列，即PoscolcM或啟動子Poscold4。
[0008] 另一方面，本發明提供一種植物冷誘導強表達啟動子，其DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者,所述植物冷誘導強表達啟動子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者所述植物冷誘導強表達啟動子具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交的產物。這些植物冷誘導強表達啟動子序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅動目標基因在植物中表達。
[0009]另一方面，本發明還提供一種包含上述植物冷誘導強表達啟動子的表達盒。
[0010]又一方面，本發明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的植物冷誘導強表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述植物冷誘導強表達啟動子連接于待表達的基因序列的上游；優選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-Poscold4，該重組表達載體為將SEQ ID No:1所示的序列即PoscolcM或啟動子PoscolcM構建于pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIA1391-Poscold40或者待表達基因可以為任何對作物的耐寒性具有改善能力的基因。通過本發明的啟動子驅動該耐寒基因在寒冷條件下集中表達，從而實現改善作物耐寒性狀的功能。
[0011]另一方面，本發明還提供一種宿主菌，所述宿主菌包含本發明提供的上述植物冷誘導強表達啟動子、上述表達盒、或上述重組表達載體；優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0012]另一方面，本發明提供一種轉化子，所述轉化子包含本發明提供的上述植物冷誘導強表達啟動子、上述表達盒、上述重組表達載體、或上述宿主菌。其中，所述轉化子優選為轉基因細胞系、愈傷組織或植株。
[0013]再一方面，本發明提供上述植物冷誘導強表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。所述應用包括將本發明提供的上述植物冷誘導強表達啟動子連接于載體的待表達的基因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于目標基因之前)，從而構建重組表達載體，將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0014]并且優選地，所述應用可以用于改良植物生長特性，所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻。
[0015]本發明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0016]GTCATCATCCGTCCAAAATCCTGGACAAGGTTTTCACCTAGAGCTTCTTGCCGAGGGGGGAGGGGTACCTCAACAATGCCCTCAGGAGGGTTACCACGCTTGAAGGCGTAGCCATTGCTGGCCCAAAGAATTGGGCTAAGCTTTCGCTCGGAACCCTTTACCGCCGTGGTCCGTCTCTCCATCCGAATCCACCATCTAAACATCGGCGGCACATGGCTTCCACCACACCCGACCGACGCCCCTCTGCCGGTCATCCAGTCCTGCCAACGACAAGACTACCACCACACCACACCGACGCCCCTCCGTCAGCCGACTTCGTCGAACCGCCATCCCTAAGAGCTGGCCCAGGACCCTTCCGTTCCACCACCCGCCGGCCACCTCGCCAGATCTAGCTGAAGGAGAACCCGGGATTGGGTGGCACTGCTTCGGTACCCTAAGCTTCCCCCGTTAACGAGCAGCCACCTCAATCCAATCTAGAAACTCCCCGCAAAGAAGGGGAGGAGCTCTAGGAAGGGTGAGGGTGCCGACCGGCAACGAGGAAGATGACTCACCGCCGCCAGCTCCCTTTGCACTGCCATCTGACCACCAACGCCCCCGTAGCCCGGCTGCCGCGCCTCGCCTTGCCACCGGGGCGGCATTAGCAAAATGGAGCAGGAGGCCGCACGCCGGCAATAGCACCCATGGTGTGCACATGGCGGGCGTGCCCTGCTGCGGCCGGGAAGGACAAGCAGCAGAGGGCTAGGGCGCCACCCCTAGCCGCCGAAGACACGGCCGCCGCGCCCCAGGCTGCTCGCCGAGCCGCCGCTGCCGCCCCCAGCTGCCTTCCGCCGAGCCGCCGCCTCTGCTTCCGGGCCAGCCAACCTTTTGTGAAGCAGTCTAAATTCAGCTCCTCAAAATTTTGTTCATTCTTATTTTA
GATGCAGCTCTTGTATAGCTGAGCCGTGGCAAGCAGACCCAACACCTGAGTGCCCTCTTCCAATCCCGCCACTGAAA
CAGGCCCGCGGCAAGCGTTCTCATCTGCCGGCCGCGCAATCGTCGGCGAACGTCATACCGGCCGAGAAGTAGTAGTA
CTCCGTATTAGATATGCAGGGGACGAATTGCCCCCCGGCGGATTGAGCAAGCGGCGCCGGCGATCGCGTTCCAACAG
ATCGAGAAGGTCACTGACCAGTCCACTAATCCAGCCAGACGACCCGTCAATTAATCCAGAGAACACGGACTGCGTCA
GTCAGACACACCGCCACAGACGCGGCTCACGCCACCCTTCCCTCTATGGCCCCGTCACGTTCTCCGCCTTTTCCTTT
CACACCCTCCTCGATCGGTCGCCCGGCCACGGGCGGGCCACGGCCACCGAGCGGTGAAAAGGGGCAGCAAACGCACG
CTTCCCACCCCGCCGTTTTTACGTGGTCGCCGCGCAACACCACCGACGACGACGTCAACCCGCACCCACCGGGGGCT
CGTTCCACACGCGCGCGCAAGCGCAACCACCGCTACCAACTGCCTCCTTCCGCTGAGGCGCTGACCGAGAGAGACAA
ATGGGGCACGTTTAAACTCAAGTCTCGCCTTCTTCTTCCCACCCACGCCAACGAAAAGCCCAGCAACCACCACGAAA
CCCACGCGAAACACACGCCCTCCCCGCCAAGTCAGCTCTCCTCTCCCAACCGTATATAACCCCCGCTTCCCCTTCCC
CAGGAGAAATCCACCCATTCCGCCGCCTCCTCGCAGCTCGGAGAATTTTTTTTTTCGAGAATTCGATCGAGAGCGAG
CCACGCTTGCGTGCTTTGGAAGAAAATCATATATCAAGCAGCAGCAGCAGCTGTCGGAGATGTCGCGGTACGTGGAG
T
[0017]需要說明的是:上述啟動子的DNA序列中，序列開頭以斜體并加粗表示的序列“GTCATCATCCGTCCAAAATCCT”為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計22bp ；序列末尾以斜體并加粗表示的序列“GAGATGTCGCGGTACGTGGAGT”為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存序列(該留存序列與反向引物的相應序列互補)，共計22bp ;該DNA序列中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調的是，本文中所提到的啟動子既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的是，即便本領域技術人員在本發明的基礎上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發明的保護范圍之內。
[0018]綜上所述，本發明的發明人發現、提取并鑒定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare) L0C_0s03g52410.1基因上游包括轉錄起始位點在內的1841bp的DNA序列，并將其命名為PoSCold4(序列表中的SEQ ID No:1)。將該序列經酶切后連接到植物雙元表達載體PCAMBIA1391上，獲得相應的重組質粒(即重組表達載體)，利用該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105，然后用農桿菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行⑶S表達定量檢測發現，轉基因植株在低溫誘導處理后，整體上的Gus基因表達水平提聞，從而證明該1841bp的序列具有驅動基因表達的活性，而且該啟動子驅動的Gus基因在水稻低溫誘導處理后表達。
[0019]本發明所述的啟動子序列可與植物雙元表達載體連接，用于取代組成型啟動子。并且，該啟動子序列可以與所需的靶標基因連接，構建重組植物表達載體，經轉化后，在低溫誘導處理后可驅動靶標基因在植株中特異性表達，從而提高外源靶標基因在植物中的表達量，增加轉基因的效果。
[0020]技術效果
[0021]本發明所克隆的水稻啟動子PoscolcM能夠調控基因在植株中集中表達，在實際應用中具有顯著價值。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造，如通過該啟動子驅動目標基因在植株中表達，可以提高和改善水稻的生長特性，尤其是耐寒特性，從而培育出實用有效的耐寒植物品種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0023]圖1為將PoscolcM啟動子構建于pCAMBIA1391載體質粒中的示意圖，其中A為pCAMBIAl391示意圖，B為pCAMBIA1391_Poscold4示意圖，其中示出了利用PoscolcM啟動子驅動位于其下游的GUS基因表達；
[0024]圖2為對本發明的啟動子進行酶切驗證的結果示意圖。
[0025]圖3為低溫處理(4°C )下啟動子表達活性的示意圖，圖中示出了將萌發7天后的PoscolcM::gus轉基因幼苗和PActin::gus對照幼苗,放在4°C條件下分別冷處理4小時、8小時、12小時、24小時和48小時的結果，以便鑒定PoscolcM啟動子的誘導倍數和表達活性，圖中實心柱表示PActin::gus對照幼苗中⑶S表達強度，空心柱表示PoscolcM::gus轉基因幼苗中⑶S表達強度。
【具體實施方式】
[0026]以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。
[0027]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的生化試劑、耗材原料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0028]含有酶切位點的 PoscolcM啟動子的獲得
[0029]步驟1、引物的設計
[0030]根據NCBI中提供的水稻品種日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組序列，依據水稻PoscolcM基因的序列設計擴增引物，并根據選用的載體及靶標基因的特點，設計引物的酶切位點。
[0031]本實施例中以水稻雙元表達載體pCAMBIA1391 (圖1中A部分，來自于CAMBIA，公開使用載體，安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存)為例，靶標基因為Gus基因，具體設計的引物為:正向引物(SEQ ID No:2)5’端帶PstI，酶切位點(CTGCAG)，
[0032]反向引物(SEQ ID No: 3) 5，端帶BamHI酶切位點(GGATCC)，引物序列如下:
[0033]正向引物:CTGCAGGTCATCATCCGTCCAAAATCCTPstI
[0034]反向引物:GGATCCGAGATGTCGCGGTACGTGGAGTBamHI
[0035]由深圳華大基因公司合成。
[0036]步驟2、啟動子PoscolcM的獲得
[0037]以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴增啟動子PoscoId4，按常規PCR體系，采用如下擴增程序:
[0038]95°C預變性 5min ;95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循環 35 次；最后 72°C延伸 1min0
[0039]回收PCR擴增的目的片段，目的片段長度1841bp，將其連接到PGEM-T-Easy載體(購自Promega公司，按載體說明書中的比例混合)上,按照冷激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞后，使感受態細胞激活，進而將目的片段轉入到激活的感受態細胞中，然后，經菌落PCR篩選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用PstI和BamHI進行雙酶切驗證，如圖2所示。將經過鑒定的陽性克隆送交Invitrogen公司測序。驗證正確的克隆即為所要獲得的啟動子PoscolcM,其核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0040]植物表達載體的構建和農桿菌的轉化
[0041]從上面“啟動子PoscolcM的獲得”過程中獲得的陽性克隆中提取質粒，用PstI和BamHI雙酶切，回收啟動子Poscold4片段。同時利用PstI和BamHI對pCAMBIA1391進行線性化處理、回收PCAMBIA1391，將上述的PoscolcM片段和pCAMBIA1391片段用T4連接酶(購于TaKaRa公司)進行連接，得到啟動子PoscolcM與Gus基因融合的植物表達載體pCAMBIA1391-P0SC0ld4(圖1B)，利用凍融法將植物表達載體轉入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存)。
[0042]利用啟動子PoscolcM驅動Gus報告基因在水稻中表達
[0043]步驟1:農桿菌介導的水稻遺傳轉化
[0044]成熟種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉次氯酸鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀種子的沿糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導培養基上。30°C下暗培養11天后將愈傷與胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養3~5天后用于農桿菌轉化。
[0045]采用上述“植物表達載體的構建和農桿菌的轉化”過程中轉入了重組表達載體的根癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，獲得PoscolcM::gus轉基因水稻植株,該遺傳轉化、轉化子篩選及轉基因植株再生等參照Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformat1n based on phosphomannose isomerase positive select1n in Japonicarice (Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.D0I10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
[0046]步驟2、Poscold4-pCAMBIA1391植株的冷脅迫處理和PoscolcM的冷響應活性
[0047]將萌發后7 天的 Poscold4-pCAMBIA1391 植株和作為對照的 PActin_pCAMBIA1391植株(來自于美國康奈爾大學，由目前基因工程中常用的組成型啟動子水稻PActin驅動GUS基因，安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存)分別置于低溫(4°C )中，4小時、8小時、12小時、24小時和48小時處理后分別取全株樣本，使用天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，再使用天根生化科技有限公司的FastQuant RT試劑盒反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以ACTIN基因為內參，以天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus實時熒光定量PCR預混液為反應試劑，在ABI公司的PRISM7500熒光PCR儀上，通過qRT-PCR反應檢測P0scold4和PActin啟動子驅動的⑶S表達強度。其中，用于標定ACTIN基因的定量qRT-PCR引物為:
[0048]ACTIN 上游引物:5，-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3，，
[0049]ACTIN 下游引物:5’ -CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’
[0050]用于檢測⑶S基因表達的qRT-PCR引物為:[0051 ]⑶S 上游引物:5’ -TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3，
[0052]⑶S下游引物:5’ -CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3 ’
[0053]結果顯示，在沒有冷誘導時，Poscold4-pCAMBIA1391植株中Gus基因的表達量僅約為PActin驅動⑶S活性的萬分之五，而隨著冷處理，PoscolcM表達活性顯著提高，在冷處理24小時后，PoscolcM表達活性為PActin啟動子的1.5倍以上，結果見圖3。該結果說明PoscolcM是一種低本底、冷響應靈敏且誘導后強度極高的冷誘導啟動子。
[0054]以上對本發明【具體實施方式】的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。
【權利要求】
1.一種植物冷誘導強表達啟動子P0SC0ld4，其特征在于，所述植物冷誘導強表達啟動子Poscold4包含SEQ ID No:1所不的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM，其特征在于，所述植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列。
3.—種表達盒,其特征在于,所述表達盒包含權利要求1-2中任意一項所述的植物冷誘導強表達啟動子Poscold4。
4.一種重組表達載體,其特征在于,所述重組表達載體包含權利要求1-3中任意一項所述的植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM，在所述重組表達載體中，所述植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM連接于載體中待表達的基因序列的上游。
5.根據權利要求1所述的重組表達載體，其特征在于，所述待表達的基因為Gus基因或耐冷基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-Poscold4，其中pCAMBIA1391為植物雙元表達載體。
6.—種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權利要求1-2中任意一項所述的植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM、權利要求3所述的表達盒、或根據權利要求4或5所述的重組表達載體，其中，所述宿主菌為根癌農桿菌。
7.一種轉化子，其特征在于，所述轉化子包含權利要求1-2中任意一項所述的植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM、權利要求3所述的表達盒、或根據權利要求4或5所述的重組表達載體、或者權利要求6所述的宿主菌。
8.一種根據權利要求1-2中任意一項所述的植物冷誘導強表達啟動子在培育轉基因植物中的應用，其特征在于，所述應用包括:將根據權利要求1-2中任意一項所述的植物冷誘導強表達啟動子PoscolcM連接于載體中待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載體；將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述應用用于改良植物生長特性，所述植物為單子葉植物:水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥。
【文檔編號】C12N5/10GK104073493SQ201410326194
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】魏鵬程, 楊劍波, 李莉, 李 浩, 秦瑞英, 馬卉 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所