專利名稱：功能性植物、為培育該功能性植物而使用的啟動子及其應用方法
技術領域：
本發明涉及功能性植物、為培育該功能性植物而使用的啟動子及其應用方法。更具體地說，本發明涉及利用cDNA文庫的數據庫來獲得特異性啟動子，由此培育功能性植物的方法。
背景技術：
在基因工程發展過程中，開發出了各種培育轉基因植物的方法。在轉基因植物中，為了使特定的基因特異性地表達，需要將用于促進表達的啟動子這樣的遺傳元件與該特定的基因可操作地連接，再通過轉化等將上述連接形成的混合物導入植物中。
調節植物中的基因表達的啟動子是植物遺傳工程的必須元件。植物中被選擇用作基因表達的啟動子有多種(BENFEY P N；REN L；CHUAN-H，EMBO J，9(6).1990.1685-1696.，1990)。可以根據本領域公知的方法來鑒定啟動子區。簡單地說，構建將啟動子區的候選序列與報道基因(例如GUS基因)可操作地連接而形成表達盒。使用構建的表達盒轉化適當的植物細胞，再將轉化細胞再分化為植物。利用適當的檢測系統(例如色素染色)檢測轉化植物中報道基因的表達。根據檢測結果，可以確認啟動子區及其表達特性。
細胞(例如植物細胞)中，為了使基因表達，該基因必須與通常細胞中由某種酶識別的啟動子進行可操作地連接。被稱為啟動子或者轉錄調節區、通常存在于基因5’非編碼區(即緊鄰編碼區的5’區)的區域起始用于生成mRNA轉錄產物的基因轉錄。接著mRNA在細胞的核糖體中進行翻譯，以獲得編碼的多肽，具有代表性的啟動子含有約500-1500個堿基，在其控制下，基因得以進行受到控制的表達。轉基因植物中的異源基因或基因的所選擇的序列表達時，具代表性的是要使用組成型啟動子，即，使用總是且在整個植物的幾乎所有組織中誘導產物的表達的啟動子。
為了使植物中所選擇的基因表達，采用了來自病毒的啟動子。具有上述啟動子的已知病毒基因的例子有病毒花椰菜花葉病毒家族(一組雙鏈DNA病毒)，還有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S(Balazs等人，1982；Guilley等人，1982；Odell等人，1985；Odell等人，1987；Odell等人，1988；Tommerup等人，1990；Jefferson等人，1987a；Jefferson等人，1987b)和CaMV 19S的啟動子(Fraley等人，1994)、以及玄參花葉病毒(FMV)(Rogers，1995)的啟動子。
目前已鑒定和分離了由細菌源得到的、用于調節植物中的基因表達的啟動子，例如來自農桿菌(Agrobacterium)的啟動子。這樣的啟動子的例子有來自農桿菌T-DNA胭脂堿合成酶(nos)基因的啟動子，還有胭脂堿合成酶(nos)啟動子(Rogers，1991)、章魚堿合成酶(ocs)啟動子(Leisner和Gelvin，1998)和麥根酸合成酶(mannopinesynthase，mas)啟動子。
CaMV35S啟動子在高效表達系統中也有很多弊病。組成型高效表達、即在所有組織中總是持續地大量生產基因產物，這使得植物個體內部有限的代謝產物不必要地在無用的組織中浪費，結果有可能導致繁殖量的降低和產量的減少。組成型高效表達使得基因產物在可利用的部位蓄積，對此，可能增加消費者的疑慮，另外組成型高效表達有可能誘導植物體內的沉默結構。
并且，只要是提供組成型表達的有效的植物啟動子(來自植物源的啟動子)，幾乎均不為人所知。僅有的例子是hsp80——來自花椰菜的熱休克蛋白80(Brunke和Wilson，1993)和番茄泛素蛋白(tomato ubiquitin protein)的啟動子(Picton等人，1993)。這些啟動子可在轉化的植物組織中用于誘導異源核酸序列的組成型表達，但與CaMV 35S啟動子同樣，組成型高效表達、即在所有組織中總是持續地大量生產基因產物，這使得植物個體內部有限的代謝產物不必要地在無用的組織中浪費，結果有可能導致繁殖量的降低和產量的減少。組成型高效表達使得基因產物在可利用的部位蓄積，對此，可能增加消費者的疑慮，另外組成型高效表達有可能誘導植物體內的沉默結構。
因此，現有的啟動子難以培育可實現所需功能的表達的轉基因植物。
(發明所要解決的問題)從而，本發明以培育功能性植物為課題，特別是以構建用于使所需的基因在所需的植物部位任意表達的系統為課題。
附圖簡述
圖1表示同源性檢索結果被視為屬于同一組的序列的一個例子。大部分EST序列數據都是DNA測序儀的原始數據。排除DNA測序儀的誤差，同源性檢索結果多，將克隆進行比較，然后設計引物以進行引物步移。方框圈起的部分和*表示所有克隆中的相同序列。一表示缺失。“原始克隆”表示數據庫的參照克隆。“檢索結果”表示同源性檢索結果。“共有”表示共有序列。“設計引物”表示設計的引物。
圖2表示分離轉錄控制區的方法概要。
圖3是表示根中GFP基因的表達的圖。上部分為可見光下的照片，下部分表示激勵光照射下GFP的熒光發光。WT表示野生型，0082表示屬于EB0082_2的克隆，1583表示屬于RA1583_1的克隆，50060表示屬于CG0060_1的克隆。
圖4表示葉中GFP基因的表達。上部分為可見光下的照片，下部分表示激勵光照射下GFP的熒光發光。WT表示野生型，0082表示屬于EB0082_2的克隆，1583表示屬于RA1583_1的克隆，50060表示屬于CG0060_1的克隆。
圖5表示米粒中GFP基因的表達。上部分為可見光下的照片，下部分表示激勵光照射下GFP的熒光發光。WT表示野生型，0082表示屬于EB0082_2的克隆，1583表示屬于RA1583_1的克隆，50060表示屬于CG0060_1的克隆。
圖6表示以由生長的愈傷組織提取的DNA為模板進行PCR，檢測HPT基因(上側箭頭位置)的有無。是表示GPT基因導入水稻愈傷組織的圖。左端表示尺寸標記，各泳道是以由分別導入了下述載體的愈傷組織提取的DNA為模板，在生成1.1kb的HPT基因特異性擴增產物的條件下進行PCR泳道1-3是以由沒有基因導入的愈傷組織提取的DNA為模板，泳道4-6是由CaM35S啟動子驅動HPT基因的載體，泳道7-9由來自屬于RA1583_1的克隆的來自RA1583_1啟動子驅動HPT基因的載體，泳道10-12是由來自屬于CG0060_1的克隆的來自CG0060_1啟動子驅動HPT基因的載體。13和14作為陽性對照，以HPT基因片段和pTH1質粒為模板。15表示作為陰性對照的DNA提取中使用的緩沖液；16表示分別以滅菌水為模板進行PCR。上部分的箭頭表示預想的HPT基因擴增產物的尺寸。15和16中未出現擴增產物。
圖7是表示添加潮霉素前后各愈傷組織的生長的照片。A和B是來自RA1583_1的克隆的啟動子區，C和D是來自CG0060_1的克隆的啟動子區，E和F是具有通過作為陽性對照使用的CaMV35S啟動子驅動HPT基因的結構的載體，G和H是使用野生型的結果。A、C、E和G表示使愈傷組織在潮霉素存在下生長的結果，B、D、F和H表示生長前的結果。
(序列表的說明)SEQ ID No.1是來自CG0060_1的克隆的啟動子區。
SEQ ID No.2是來自EB0082_2的克隆的啟動子區。
SEQ ID No.3是來自RA1583_1的克隆的啟動子區。
SEQ ID No.4是GenomeWalker的適配子引物(adapter primers)。
SEQ ID No.5是實施例4的含有部分適配子引物序列和限制酶識別序列的引物。
SEQ ID No.6是實施例4的含有翻譯起始點前的序列和限制酶識別序列的引物。
SEQ ID No.7是在合有來自CG0060_1的克隆的啟動子區的兩端添加了限制酶識別序列的啟動子盒。
SEQ ID No.8是在實施例5中使用的、含有水稻基因組序列的一部分和限制酶識別序列的引物。
SEQ ID No.9是在實施例5中使用的、含有翻譯起始點稍前的序列和限制酶識別序列的引物。
SEQ ID No.10是含有來自EB0082_2的克隆的啟動子區的、在兩端添加了限制酶識別序列的啟動子盒。
SEQ ID No.11是在實施例6中使用的、含有翻譯起始點稍前的序列和限制酶識別序列的引物。
SEQ ID No.12是含有來自RA1583_1的克隆的啟動子區的、在兩端添加了限制酶識別序列的啟動子盒。
發明內容
本發明著眼于cDNA文庫數據庫中的表達頻率，分離具有所需表達頻率的基因中所含的啟動子，通過與所需的基因一起利用其啟動子，來培育在希望的部位表達所需基因產物的功能性植物，從而解決了上述課題。
因此，本發明提供下述內容。
1.植物，該植物包含至少一個進行特異性表達的啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
2.項目1的植物，其中上述基因的表達是組成型表達。
3.項目1的植物，其中上述基因在葉中特異性表達。
4.項目1的植物，其中上述基因在愈傷組織中特異性表達。
5.項目1的植物，該植物為水稻。
6.項目1的植物，其中上述基因是抗病基因或抗蟲基因。
7.項目1的植物，其中上述基因是選自維生素合成基因、糖合成基因、脂質合成基因、聚酮合成基因、光學合成類基因、功能性成分合成基因和轉錄因子的基因。
8.啟動子，該啟動子進行特異性表達，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
9.項目8的啟動子，所述啟動子不驅動果實中基因的表達。
10.項目8的啟動子，所述啟動子特異性驅動葉中基因的表達。
11.項目8的啟動子，所述啟動子特異性驅動愈傷組織中基因的表達。
12.表達盒，該表達盒含有進行特異性表達的啟動子，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
13.項目12的表達盒，該表達盒驅動組成型基因的表達。
14.項目12的表達盒，該表達盒特異性驅動葉中基因的表達。
15.項目12的表達盒，該表達盒特異性驅動愈傷組織中基因的表達。
16.植物的可利用部位，該植物的可利用部位由包含至少一個進行特異性表達的啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因的植物獲得，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定。
17.項目16的可利用部位，該可利用部位是葉、莖或果實。
18.生產所需基因產物的方法，該方法包括確定啟動子的特異性的步驟，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定；將該啟動子與編碼該所需基因產物的核酸分子進行可操作的連接，制備連接混合物的步驟；將該連接混合物導入植物的步驟；使該植物生長的步驟；以及收集該植物中的該所需基因產物的步驟。
19.培育特異性表達所需基因產物的植物的方法，該方法包括確定啟動子的特異性的步驟，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定；將該啟動子與編碼該所需基因產物的核酸分子進行可操作地連接，制備連接混合物的步驟；將該連接混合物導入植物的步驟；使該植物生長的步驟。
20.項目19的方法，其中上述啟動子的特異性通過DNA芯片分析來確定。
21.基因產物，該基因產物由植物獲得，所述植物是通過項目19的方法而獲得的。
發明的實施方式以下詳細說明本發明。本說明書中，如無特別說明，可將單數形式的冠詞(例如英語中的“a”、“an”、“the”等，德語中的“ein”、“der”、“das”、“die”等及其變格，法語中的“un”、“une”、“le”、“la”等，西班牙語中的“un”、“una”、“el”、“la”等，其他語言中與此相對應的冠詞、形容詞等)理解為也包括其復數形式的概念。另外，如無特別說明，可理解為本說明書中所使用的術語是以該領域通常采用的含義來使用。
本說明書中使用的“功能性植物”是指某種植物的某種功能比天然狀態的功能有明顯(優選統計學意義上的顯著)變化(例如增加、增強、減少、消失等)的植物。這里，植物的“功能”是指植物的生理作用。
本說明書中使用的“啟動子”是決定基因轉錄的起始位點，并且直接調節其頻率的DNA上的區域域，是RNA聚合酶結合并起始轉錄的堿基序列。
本說明書中，“啟動子區”是指某種結構基因序列附近、具有啟動子活性的區域域。“推定(deduced)啟動子區”是指某種結構基因序列附近、被認為具有啟動子活性的區域域。推定啟動子區多是推定為基因轉錄起始時RNA聚合酶所結合的基因上游堿基序列、推定蛋白質編碼區的第1外顯子上游約2kbp以內的區域域，因此，如果使用DNA分析軟件預測基因組堿基序列中的蛋白質編碼區，則可推定出啟動子區。推定啟動子區隨每種結構基因而變動，但通常位于結構基因的上游，不過并不限于此，也可以位于結構基因的下游。優選推定啟動子區存在于第一外顯子翻譯起始點的上游約2kbp以內。
含有至少連續10個本發明的啟動子序列中的核苷酸序列的核酸分子可具有與本發明的啟動子相同或相似的活性。所述活性可通過使用葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、螢光素酶基因或綠色熒光蛋白(GFP)基因作為報道基因進行測定(assay)、生物化學或細胞組織學鑒定來確認。所述測定屬于本領域的常用技術(Maliga等人.，Methods inPlant Molecular BiologyA labortory course.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1995)；Jefferson，Plant Molec.Biol.Reporter 5387(1987)；Ow等人.，Science 234856(1986)；Sheen等人.，Plant J.8777-784(1995))，本領域人員不會有任何困難地即可驗證含有至少連續10個本發明的啟動子序列中的核苷酸序列的核酸分子可具有與本發明的啟動子相同或相似或基本同等或以上的活性。本說明書中，如果在上述測定中判定在檢測誤差范圍內具有相同的啟動子活性，則稱為具有基本同等或以上的啟動子活性。
本發明的啟動子的長度通常為10個核苷酸或以上，可優選為20個核苷酸或以上、30個核苷酸或以上、40個核苷酸或以上、50個核苷酸或以上、60個核苷酸或以上、70個核苷酸或以上、80個核苷酸或以上、90個核苷酸或以上、100個核苷酸或以上、150個核苷酸或以上、200個核苷酸或以上、300個核苷酸或以上的長度。
本發明的啟動子可以與現有的啟動子(例如最小啟動子(由來自35S啟動子的約80個堿基對構成的啟動子)(Hatton等人.，Plant J.，7859-876(1995)；Rouster等人.，Plant J.，15435-440(1998)；Washida等人.，Plant Mol.Biol.，401-12(1999))等)連接使用。此時，即使是原來不顯示組織特異性或顯示微弱的特異性、或者顯示其它特異性的啟動子，通過添加本發明的啟動子或其片段，也可以制備在根和/或莖尖強烈發揮組織特異性功能的啟動子(Hatton等人.，Plant J.，7859-876(1995)；Rouster等人.，Plant J.，15435-440(1998)；Washida等人.，Plant Mol.Biol.，401-12(1999))。
本說明書中使用的“植物”是屬于植物界的生物的總稱，代表性地指具有生成細胞壁、葉綠素同化作用的有花植物。“植物”包括單子葉植物也包括雙子葉植物。優選的植物例如有小麥、玉米、水稻、大麥、高粱等屬于禾本科單子葉植物。除優選植物外，例如還有煙草、青椒、茄子、甜瓜、西紅柿、甘薯、卷心菜、蔥、嫩莖花椰菜、胡蘿卜、黃瓜、柑橘類、白菜、生菜、桃、馬鈴薯和蘋果。優選的植物并不限于作物，也包括花、樹木、草、雜草等。如未另外注明，植物也指植物體、植物器官、植物組織、植物細胞和種子等任意部分。植物器官的例子有根、葉、莖和花等。植物細胞的例子有愈傷組織和懸浮培養細胞。
本說明書中使用的植物的“可利用部位”是植物的一部分，是指生物攝取該植物時，該生物可攝取的部分。生物為人、植物為水稻時，“可利用部位”也稱為“可食用部分”，通常的可利用部分包括米粒。所食用的米粒中的胚乳作為白米，可稱為水稻中的可食用部位。米粒是指水稻種子的構成要素——穎、胚、胚乳、種皮中的胚和胚乳。生物為牛、植物為水稻時，通常可利用部位是指除根以外的整個植物體。本說明書中的“果實”是指子房發育形成的器官，果實內，受精胚珠發育形成種子(禾本科中特稱為穎果)。本說明書中的“種子”是指胚珠發育形成的普遍性的傳播體，由胚、胚乳和種皮構成。
本說明書中，“基因”是指遺傳的功能性單位，通常占據染色體上的特定位點(基因座)。基因通常可以在細胞分裂中進行正確的自我復制，控制酶等其它蛋白質的合成。作為功能單位的基因，由DNA大分子的非連續性的分段構成，該DNA分子包含編碼特定肽的氨基酸序列的正確堿基序列(A、T、G和C)。基因通常由DNA承載信息，但也有由RNA承載的。如上所述，通常基因存在于染色體中，所有的染色體除了例如男人的性染色體(X和Y)之外，都是成對的，因此除了配子之外，基因通常成對地存在于所有的細胞中，在植物中也同樣。除編碼蛋白質的區域域(外顯子)之外，基因通常包括存在于外顯子之間的內含子、第1外顯子上游的表達控制區(啟動子區)、蛋白質編碼區的下游區。
本說明書中，基因“特異性表達”是指該基因在植物的特定部位或時期以與其他部位或時期不同(優選高)的水平表達。特異性表達可以只在某一部位(特異性部位)表達，也可以在除此之外的部位表達。優選特異性表達只在某一部位表達。
本說明書中，“可操作地連接”是指所需序列的表達(操作)置于某個轉錄控制序列(例如啟動子)或翻譯控制序列的控制下。啟動子為了與基因可操作地連接，通常在該基因的剛剛上游處配置啟動子，但也未必一定要相鄰。因此此時，“該啟動子與該基因可操作地連接”只要是該啟動子可控制該基因的表達，則可以是任何的相對的位置關系。
本說明書中，基因在植物中表達時，通常“部位特異性”是指該基因在植物的部位(例如根、莖、干、葉、花、種子、胚芽、胚、果實等)中的表達特異性。“時期特異性”是指該基因根據植物生長階段(例如發芽后的出芽天數)的表達特異性。“應激應答性”是指對于給與植物的至少一種應激，該基因的表達發生變化。
本說明書中使用的“cDNA數據庫”是指由植物組織中提取mRNA，由mRNA合成cDNA，進行大規模克隆，確定序列，將確定了序列的cDNA形成數據庫。在水稻基因組計劃中，為分別從芐基腺嘌呤處理的愈傷組織、赤霉素處理的愈傷組織、熱休克處理的愈傷組織、繁殖期的愈傷組織、幼根、幼綠葉、幼黃化葉、開花期的穗提取mRNA，構建了來自mRNA的cDNA文庫，隨機地確定了堿基序列形成的數據庫。cDNA數據庫中的表達頻率是通過計算所用樣品的個數中實際表達的個數的比例來算出。cDNA數據庫例如有基于像水稻基因組計劃這樣的基因組計劃中所發表的數據庫而制成的數據庫。
根據表達頻率確定的啟動子的特異性依賴于含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率。因此本發明中使用的啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率來確定。
這樣，根據本發明的說明，本領域人員都可以對所需基因賦予所需表達特性，可以培育出使所需基因具有所需特異性并表達的植物。
本說明書中，導入的基因“不表達”是指該基因完全不表達，或以對該導入了基因的宿主基本上不產生影響的程度表達。以基本上不產生影響的程度表達的代表性例子有例如以政府機關規定的標準或以下表達。
本說明書中，某種因子“驅動”(drive)基因的表達是指通過該基因處于該因子的控制下，促進了該基因的表達。某種因子“不驅動”基因的表達，則是指該基因即使處于該因子的控制下，也完全不促進該基因的表達，或以對該導入了基因的宿主基本上不產生影響的程度促進表達。某種因子不驅動基因的表達時，該基因例如可以以政府機關規定的標準或以下進行表達。
本發明的啟動子也可以使用與其序列相似的序列。這樣的序列可通過FASTA等序列比對程序確定同源性進行選擇，還可以通過雜交來選擇。
本說明書中，用于雜交的“嚴謹的條件”是指對于目標序列，具有同源性的核苷酸鏈的互補鏈優先與目標序列雜交，并且不具同源性的核苷酸鏈的互補鏈基本上不雜交的條件。某個核酸序列的“互補鏈”是指根據核酸的堿基之間的氫鍵而對應的核酸序列(例如A對T、G對C)。嚴謹的條件與序列有關，在各種狀況下均不同。更長的序列則在更高的溫度下特異性地雜交。通常，嚴謹的條件選擇在規定的離子強度和pH下對特定的序列比其熔解溫度(Tm)低約5℃。Tm是在規定的離子強度、pH和核酸濃度下，50％的與目標序列互補的核苷酸以平衡的狀態與目標序列雜交的溫度。“嚴謹的條件”與序列有關，根據各種環境參數而不同。核酸雜交的一般性指南在Tijssen(1993)、Laboratory Technniques In Biochemistry And MolecularBiology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第2章“Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assay”、Elsaevier，New York中有說明。
通常的分子生物學方法可參考Ausubel F.A.等人編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY；Sambrook J等人(1987)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY等，本領域人員可容易地實施。
代表性的嚴謹的條件是鹽濃度小于約1.0M Na+，更具代表性的是pH7.0-8.3、約0.01-1.0M的Na+濃度(或其它鹽)；關于溫度，短核苷酸(例如10-15個核苷酸)則至少約30℃，長核苷酸(例如比50個核苷酸長)則至少約60℃。嚴謹的條件還可通過添加甲酰胺這樣的非穩定劑(unstabilizer)來實現。本說明書中的嚴謹的條件例如有在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(37℃)的緩沖溶液中的雜交，以及用0.1×SSC在60℃洗滌。
“應激”是指對植物施加物理性、化學性、生物學性的妨礙植物正常生長的因子。應激例如有物理性應激(光、熱、冷卻、冷凍、紫外線、X射線、切斷、摩擦等)，化學性應激(氧應激、化學物質、生理活性物質等)、生物學性應激(病毒、病原體(例如稻瘟病菌)感染等)等。因此本發明的啟動子也包括在經受這些應激時特異性表達的啟動子。
本說明書中，本發明的啟動子的表達為“組成型”，這是指在植物的所有組織中、在該植物生長的幼年期和成熟期的任意階段都以大致定量來表達的性質。具體來說，在與本說明書的實施例同樣的條件下進行RNA印跡分析時，例如在任意時刻(例如2個或以上的時刻(第5天和第15天))、在相同或對應的部位都可見表達，此時以本發明的定義，該表達是組成型的。可認為組成型啟動子對于在通常的生長發育環境下維持植物的恒定性起到作用。本發明的啟動子的表達是“應激應答性”，這是指對植物體施加至少一種應激時，其表達量發生變化的性質。特別是，將表達量增加的性質稱為“應激誘導性”，將表達量減少的性質稱為“應激減少性”。“應激減少性”的表達的前提是在正常情況下可見表達，因此這是與“組成型”的表達有重復的概念。由植物的任意部分提取RNA，通過RNA印跡分析來分析其表達量，或通過蛋白質印跡分析對所表達的蛋白質進行定量，由此可確定上述性質。
本說明書中，“抗病性”是對植物的性質而言，是可使發病程度減小的能力。本說明書中，“抗蟲性”是對植物的性質而言，是可使蟲害程度減小的能力。本說明書中，“病害特異性”是指病害發生時某種啟動子具有特異性。本說明書中，“蟲害特異性”是指蟲害發生時某種啟動子具有特異性。“抗藥基因”是指該基因產物在宿主中表達時，使宿主具有耐藥性的基因。抗藥基因優選可使轉化植物的篩選容易進行的基因，可優選使用提供卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶II(nptII)基因、和提供潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因等。
本發明的啟動子不僅可用于單子葉植物，也可用于雙子葉植物以及其他生物的改變。這可通過兩種植物間轉錄調控的基本機理類似予以說明。例如有報道指出玉米的zein基因啟動子在煙草中以相同的組織特性表達(Schernthaner等人.，EMBO J.，71249-1255(1988))、水稻的谷蛋白基因啟動子在煙草中以相同的組織特性表達(Leisy等人.，Plant Mol.Biol.，1441-50(1989))。特別優選的對象植物除水稻之外，還有小麥、玉米、大麥、高粱、柑橘類、白菜、生菜、煙草、桃、馬鈴薯、西紅柿和蘋果等。
本說明書中，提到基因時，“載體”是指可將目標多核苷酸序列轉移到目標細胞中的物質。這樣的載體的例子有可在原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物個體和植物個體等宿主細胞中自復制，或可摻入染色體中，在適合本發明的多核苷酸轉錄的位置含有啟動子的載體。植物細胞的“重組載體”的例子有Ti質粒、煙草花葉病毒載體等。表達盒優選采用植物表達載體的形式。“植物表達載體”是指除結構基因和調控其表達的啟動子之外，還有各種調控元件以在宿主植物細胞中可操作的狀態連接的核酸序列。調控元件優選含有終止子、抗藥基因和增強子。植物表達載體的類型和所用調控元件的種類根據宿主細胞改變，這是本領域技術人員熟知的事項。本發明中使用的植物表達載體還可以具有T-DNA區。特別是在使用農桿菌轉化植物時，T-DNA區可提高基因的導入效率。
“終止子”位于基因編碼蛋白質的區域域的下游，是DNA轉錄為mRNA時與轉錄的終止、polyA序列的添加有關的序列。已知終止子與mRNA的穩定性有關，對基因的表達量有影響。終止子有CaMV35S終止子、胭脂堿合成酶基因的終止子(Tnos)、煙草PR1a基因的終止子，但并不限于這些。
“增強子”可用于提高目標基因的表達效率。增強子優選含有CaMV35S啟動子內上游一側的序列的增強子區。可以使用多個增強子。
用于構建植物表達載體的載體可優選使用pBI系載體、pUC系載體或pTRA系載體。PBI系和pTRA系的載體可經由農桿菌將目標基因導入植物中。可優選使用PBI系的雙元載體或中間載體系。例如有pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等。這些載體包含可導入植物的區域(T-區)的基因、作為標志基因的在植物啟動子控制下表達的nptII基因(提供卡那霉素抗性)。PUC系的載體可將基因直接導入植物。例如有pUC18、pUC19、pUC9等。植物表達載體可采用本領域公知的基因重組技術構建。
植物表達載體向植物細胞中導入時，可以采用本領域公知的方法，例如經由農桿菌的方法和直接導入細胞的方法。經由農桿菌導入的方法例如可使用Nagel等人的方法(Nagel等人(1990)、Microbiol.Lett.，67.325)。該方法如下首先，通過電穿孔法用植物表達載體轉化農桿菌，然后按照Gelvin等人(Gelvin等人編(1994)、Plant Molecular Biology Manual(Kluwer Academic PressPublishers))的方法將轉化的農桿菌導入植物細胞。將植物表達載體直接導入細胞的方法有電穿孔法(參照Shimamoto等人(1989)、Nature、338274-276；和Rhodes等人(1989)、Science、240204-207)、粒子槍法(參照Christou等人(1991)、Bio/Technology 9957-962)以及聚乙二醇(PEG)法(參照Datta等人(1990)、Bio/Technology 8736-740)。這些方法是本領域所公知的，可由本領域人員適當選擇適合所轉化的植物的方法。
導入了植物表達載體的細胞首先通過卡那霉素抗性等抗藥性來選擇。接著可按照本領域公知的方法再分化成植物組織、植物器官和/或植物體。并可由植物體獲得種子。導入的基因的表達可通過RNA印跡法或PCR法檢測。可根據需要通過例如蛋白質印跡法確認基因產物——蛋白質的表達。
作為載體的導入方法，只要是向植物細胞中導入DNA的方法即可，可以使用任意的方法。例如有轉染、轉導、使用下述菌體的轉化等農桿菌(Agrobacterium)(日本特開昭59-140885、日本特開昭60-70080、WO94/00977)、電穿孔法(日本特開昭60-251887)、使用粒子槍(基因槍)的方法(日本特許第2606856、日本特許第2517813)等。
本發明的啟動子驅動的表達的“檢測”或“定量”例如可使用包含mRNA的測定和免疫學測定方法的適當的方法來實現。分子生物學測定方法的例子有RNA印跡法、斑點印跡法或PCR法等。免疫學測定方法的例子有使用微量滴定板的ELISA法、RIA法、熒光抗體法、蛋白質印跡法、免疫組織染色法等。另外定量方法有ELISA法或RIA法等。
“表達量”是指在目標細胞等中，本發明的蛋白質或mRNA所表達的量。上述表達量的例子有本發明中使用抗體，通過包括ELISA法、RIA法、熒光抗體法、蛋白質印跡法、免疫組織染色法等免疫學測定方法的任意的適當的方法來評價本發明以蛋白質水平表示的多肽表達量；或通過包括RNA印跡法、斑點印跡法、PCR法等分子生物學測定方法的任意的適當的方法來評價的本發明以mRNA水平表示的多肽表達量。“表達量的變化”是指通過包括上述免疫學測定方法或分子生物學測定方法的任意的適當的方法來評價的、本發明以蛋白質水平或mRNA水平表示的多肽表達量的增加或減少。通過觀察表達量的絕對量或相對量，可以檢測某種啟動子是否發生特異性作用。
“轉化體”是指通過轉化而制備的細胞等生命體的全部或部分。轉化體的例子有原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞等。轉化體與其對象有關，也稱作轉化細胞、轉化組織、轉化宿主等。
本說明書中，“再分化”是指由個體的一部分復原成整個個體的現象。例如通過再分化，可由細胞及葉或根等組織片形成植物體。
將轉化體再分化成植物體的方法是本領域技術人員公知的。這樣的方法有Rogers等人.，Methods in Enzymology 118627-640(1986)；Tabata等人.，Plant cell Physiol.，2873-82(1987)；_Shaw，Plant Molecular BiologyA practical approach.IRLpress(1988)；Shimamoto等人.，Nature 338274(1989)；Maliga等人.，Methods in Plant Molecuar BiologyA laboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)等。因此，本領域人員可以根據目標轉基因植物適當使用上述公知方法，使其再分化。
再分化的轉化體具有希望改變的特性，這可根據該特性的種類，通過適當的測定來驗證。例如，可使作為報道基因的GUS基因與啟動子融合，導入植物體，制備轉化體，通過組織染色檢測GUS的活性。這里，可以將熒光蛋白GFP的基因或螢光素酶基因作為報道基因使用。它們可以用于各種啟動子的測定。詳細內容如后述的實施例所述。另外，試圖提供病原性細菌抗性作為應激抗性時，可以將模型菌例如煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)接種于再分化的植物體中，與對照植物體相比，觀察接種是否引起變化，由此評價特性的變化。
本說明書中，植物的栽培可以通過本領域公知的任意的方法進行。植物的栽培方法例如如《模型植物的實驗方案——水稻、擬南芥篇》細胞工程分冊植物細胞工程系列4；水稻的栽培方法(奧野員敏)第28-32頁；以及擬南芥的栽培方法(丹羽康夫)第33-40頁(監修島本功、岡田清孝)所示，本說明書不再詳述。例如擬南芥的栽培可以進行土培、巖棉培、水培的任意方式。在白色熒光燈(6000勒克斯左右)的連續照明條件下栽培，播種后約4周，最初開花，開花后16天左右，種子成熟。每個穗可獲得40-50粒種子，播種后2-3個月至枯死前之間，可獲得10000粒左右的種子。種子的休眠期短，成熟種子如果干燥了1周左右，吸水后2-3天內即可發芽。如果在吸水、播種后2-4天期間以4℃進行低溫處理，則發芽整齊。水稻的栽培主要以土培進行，在10000勒克斯或以上的光照條件下生長。播種約40天后，改為短光照條件，由此誘導抽穗，誘導抽穗后30天左右開花，開花后40天左右得到成熟種子。
對本發明的啟動子表達的分析可通過使用DNA陣列的基因分析方法來進行。關于DNA陣列，(秀潤社編、細胞工學分冊“DNA微陣列和最新PCR法”)中有全面的概述。另外，最近還使用DNA陣列進行植物的分析(Schenk PM等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9711655-11660)。以下簡單地說明DNA陣列以及使用該陣列的基因分析方法。
“DNA陣列”是指使DNA在基板上排成列(陣列)并固定于其上的裝置。DNA陣列根據基板的大小或所載DNA的密度，分為DNA宏陣列(DNA macroarrays)和DNA微陣列等。
宏陣列和微陣列的區域分并沒有嚴格界限，通常“DNA宏陣列”是指在膜上將DNA點樣形成的高密度濾膜(high density filter)，“DNA微陣列”是指使DNA載于玻璃、硅氧烷等基板表面的裝置。根據所承載種類的不同，有cDNA陣列、寡DNA陣列等。
高密度寡DNA陣列之中，應用制造半導體集成電路的照相平版印刷技術(photolithography)，可同時在基板上合成多種寡DNA，由于所得陣列類似半導體芯片，因而特別被稱為“DNA芯片”。使用該方法制作的陣列有GeneChip(注冊商標)(Affimetrix、CA)等(參照Marshall A等人、(1998)Nat.Biotechnol.1627-31和Ramsay G等人、(1998)Nat.Biotechnol.1640-44)。使用本發明的微陣列進行基因分析時，優選使用該GeneChip(注冊商標)。在狹義上DNA芯片如上定義，但也可指DNA陣列或DNA微陣列全體。
DNA微陣列是上述在玻璃基板上將數千-數萬或更多的基因DNA以高密度排列的裝置，因此通過與cDNA、cRNA或基因組DNA的雜交，可以以基因組規模對基因表達譜或基因多態進行分析。通過該方法，可以進行信號傳導系統和/或轉錄控制路徑的分析(Fambrough D等人(1999)，Cell 97，727-741)、組織修復機理的分析(Iyer VR等人、(1999)，Science 28383-87)、藥物的作用機理(Marton MJ、(1999)，Nat.Med.41293-1301)、發育、分化過程中基因表達變化的廣泛分析、病態中發生表達變化的基因組的鑒定、或與信號傳導系統或轉錄控制有關的新基因的發現等。另外，對于基因多態，也可以將多個SNP在1個DNA微陣列中分析(Cargill M等人、(1999)，Nat.Genet.22231-238)。
以下對使用DNA微陣列進行測定的原理進行說明。DNA微陣列是在表面經適當加工的如載玻片的固相基板上高密度定固定多種不同的DNA探針而制成的。之后在適當的雜交條件下，使標記的核酸(目標)進行雜交，通過自動檢測器檢測各個探針的信號。將該數據通過計算機進行大量分析。例如在基因監測中，在以寡DNA或cDNA為探針的微陣列中，mRNA通過反轉錄反應形成摻入了熒光標記物的目標cDNA，使目標cDNA雜交，通過熒光圖像分析儀進行檢測。此時，可使用T7聚合酶進行cRNA合成反應，或通過該酶促反應進行其他各種信號擴增反應。
Fodor等人將組合化學與半導體制造的照相平版印刷技術結合，開發了在基板上合成聚合物的技術(Fodor SP等人、(1991)Science251767-773)。將其稱為合成型DNA芯片。照相平版印刷可以進行極微細的表面加工，因此可以制備10μm2/DNA樣品這樣集成度高的DNA微陣列。該方法通常可在玻璃基板上合成25-30種左右的DNA。
Lockart等人報告了使用合成型DNA芯片的基因表達(Lockart DJ等人(1996)Nat.Biotechnol.141675-1680)。該方法可以消除原有形式的芯片因可合成的長度短而導致特異性低的缺點。這里，為了看到1個基因的表達，通過制備與十多處對應的完全配對(perfect match，PM)寡核苷酸探針以及制備在PM探針中央的1個堿基處插入突變的錯配(mismatch，MM)寡核苷酸探針，解決了該問題。在這里，MM探針作為雜交特異性的指標使用，由PM探針和MM探針的信號比可確定基因表達的水平。PM探針和MM探針的信號比同等時，稱為交叉雜交，不能解釋為顯著的信號。
在所謂的附著式DNA微陣列中，制作DNA附著于載玻片上形式的DNA微陣列，然后進行熒光檢測(也可參照http//cmgm.stanford.edu/pbrown)。該方法中，無需大規模的半導體制造儀器，只要有DNA陣列點樣儀和檢測儀，在實驗室內即可測定。該方法具有可以選擇附著的DNA的優點。關于是否高密度，例如以100μm的間隔點直徑100μm的斑點，則在計算上1cm2可以點樣2500個DNA。因此，通常載玻片(有效面積約4cm2)可承載約1萬個DNA。
合成型DNA陣列的標記方法例如有雙色熒光標記法。該方法是將2個不同的mRNA樣品分別用不同的熒光標記，在同一微陣列上進行競爭性雜交，測定兩種熒光，通過比較來檢測基因表達的不同。熒光色素例如最常采用Cy5和Cy3，但并不限于它們。Cy3和Cy5的優點是熒光波長幾乎不重疊。雙色熒光標記法不僅在檢測基因表達的不同時使用，也可用于檢測突變或多態性。
在用DNA陣列進行的測定中，可以使用陣列點樣儀。基本上陣列點樣儀是與高性能伺服馬達組合，在計算機控制下使針頭或載玻片架沿XYZ軸方向操作，將DNA樣品由微量滴定板運送到載玻片表面上的裝置。針頭被加工成各種形狀。例如，可將DNA溶液存于像鳥嘴一樣分開的針頭上，對多個載玻片點樣。中間夾有洗滌、干燥的循環，然后承載下一次DNA樣品，上述步驟循環往復。這里，為防止樣品之間的混雜，要注意充分進行針頭的洗滌、干燥。這樣的陣列點樣儀有SPBIO2000(Hitachi Software Engineering；一次點樣式)、GMS417Arrayer(寶酒造；環形針式)、Gene Tip Stamping(Nippon Laser&Electronics；筆式)等。
在用DNA陣列進行的測定中，所用的DNA固定方法有各種。作為基板的材質，玻璃與膜相比，有效固定面積小、電荷量也少，因此可在其上進行各種涂層。實際上實施聚L-樹脂涂層或硅氧烷化等(參照Schena M等人(1995)Science 270467-470、Schena M等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9310614-10619)。另外也可以使用市售的DNA微陣列專用帶涂層的載玻片(例如聚碳化二亞胺(polycarbodiimide)玻璃(日清紡)等)。當為寡DNA時，也可采用使DNA末端氨基化，與硅烷化玻璃交聯的方法。
可主要使PCR擴增的cDNA片段載于DNA微陣列上。cDNA的濃度不夠時，存在不能充分檢測出信號的情況。因此，在PCR中未能獲得足夠量的cDNA片段時，可重復幾次PCR，匯總所得PCR產物并純化、濃縮。關于探針cDNA，通常多將大量cDNA隨機地承載，但根據試驗目的，可以承載經選擇的一組基因(例如本發明的基因組或啟動子組)或由RDA(代表性差異分析)所得的有表達變化的候選基因。優選避免重復克隆。克隆可以從手頭的cDNA文庫制備，也可以集中購買cDNA克隆。
在使用DNA陣列進行的測定中，用熒光檢測器等檢測DNA微陣列上雜交的熒光信號。這樣的檢測器可以利用目前的各種檢測器。例如斯坦佛大學的研究小組開發了original scanner，該掃描儀將熒光顯微鏡與操作步驟結合起來(參照http//cmgm.stannford.edu/pbrown)。只要斑點不是太高密度，以往的凝膠熒光圖像分析儀FMBIO(Hitachi Software Engineering)、Storm(Moleular Dynamics)等也可以進行DNA微陣列的讀取。其它可利用的檢測器有ScanArray 4000、同系列5000(General Scanning；掃描式(共聚焦式))、GMS418 Array Scanner(寶酒造；掃描式(共聚焦式))、Gene Tip Scanner(Nippon Laser&Electronics；掃描式(非聚焦式))、Gene Tac 2000(Genomic Solutions；CCD照相機式)等。
由DNA微陣列得到的數據是龐大的，因此用于進行克隆與斑點的對應管理、進行數據分析等的數據分析軟件是很重要的。這樣的軟件可以采用各種檢測系統所附帶的軟件(Ermolaeva O等人(1998)Nat.Genet.2019-23)。數據庫的格式例如有Affymetrix提倡的GATC(基因分析技術聯盟)的形式。
本發明的啟動子和功能性植物還可以通過采用差異顯示(differential display)技術的基因分析法來進行分析。
差異顯示技術是用于檢測或鑒定表達發生變化的基因的方法。該方法如下從2個或以上的樣品中分別制備cDNA，使用任意的primerset，通過PVR進行擴增，然后將生成的多種PCR產物通過凝膠電泳進行分離，形成圖譜，然后根據各條帶相對信號強度的變化來克隆表達發生變化的基因。
本發明中采用的數據庫可以包括DNA芯片的分析結果。另外，使用DNA芯片進行表達頻率的分析，根據其結果可以確定本發明的啟動子的特異性。
優選實施方案的說明第一方面，本發明提供功能性植物。該功能性植物包含至少一個進行特異性表達的啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因。本發明的功能性植物的啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。表達頻率的分析方法為本領域人員所公知，如上所述。
在一個實施方案中，本發明的功能性植物中使用的基因不在果實中表達。在另一實施方案中，其基因在葉中特異性表達。在其他實施方案中，其基因在愈傷組織中特異性表達。
本發明的功能性植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。在一個實施方案中，本發明的功能性植物可以是單子葉植物。在一個優選的實施方案中，本發明的功能性植物可以是谷物(例如小麥、玉米、水稻、大麥、高粱)。更優選本發明的功能性植物是水稻。其他優選的實施方案中，本發明的功能性植物可以是食用或嗜好用作物(tastematerial)(例如煙草、青椒、茄子、甜瓜、西紅柿、甘薯、卷心菜、蔥、嫩莖花椰菜、胡蘿卜、黃瓜、柑橘類、白菜、生菜、桃、馬鈴薯和蘋果)。在另外的實施方案中，本發明的功能性植物可以是觀賞性植物(例如像薔薇那樣觀賞花的植物(矮牽牛、香石竹、菊、洋桔梗、夏堇)、像松樹那樣的樹木)。
在另一實施方案中，本發明中采用的基因可以是抗病基因或抗蟲基因(例如防御素、somatin、殼多糖酶、Bt、半胱氨酸蛋白酶抑制劑)。
本發明的優選的實施方案中，本發明中采用的基因可以是選自維生素合成基因、糖合成基因、脂質合成基因、聚酮合成基因、光學合成基因、功能性成分合成基因和轉錄因子的基因。
另一方面，本發明涉及進行特異性表達的啟動子。該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
在一個實施方案中，本發明的啟動子不驅動果實中基因的表達。在另一實施方案中，本發明的啟動子特異性驅動葉中基因的表達。在其他實施方案中，本發明的啟動子特異性驅動愈傷組織中基因的表達。在另一實施方案中，本發明的啟動子只在可利用部位特異性驅動基因的表達。在其它實施方案中，本發明的啟動子在葉中特異性驅動基因的表達。在另外的實施方案中，本發明的的啟動子在花中特異性驅動基因的表達。在其它實施方案中，本發明的啟動子在果實中特異性驅動基因的表達。在另外的實施方案中，本發明的啟動子在種子中特異性驅動基因的表達。
其它方面，本發明提供含有進行特異性表達的啟動子的表達盒。該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
在一個實施方案中，本發明的表達盒不驅動果實中基因的表達。在另一實施方案中，本發明的表達盒特異性驅動葉中基因的表達。在其他實施方案中，本發明的表達盒特異性驅動愈傷組織中基因的表達。在另一實施方案中，本發明的表達盒只在可利用部位特異性驅動基因的表達。在其它實施方案中，本發明的表達盒在根中特異性驅動基因的表達。在另外的實施方案中，本發明的的表達盒在莖中特異性驅動基因的表達。在其它實施方案中，本發明的表達盒在花中特異性驅動基因的表達。在另外的實施方案中，本發明的的表達盒在果實中特異性驅動基因的表達。在又一實施方案中，本發明的表達盒在種子中特異性驅動基因的表達。
其他方面，本發明提供植物的可利用部位，該植物的可利用部位由包含至少一個進行特異性表達的啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因的植物獲得。該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定。優選可利用部位是葉或果實。在優選的實施方案中，可以使該啟動子在可利用部位不表達。此時，該基因可以是抗病基因或抗蟲基因(例如防御素、somatin、殼多糖酶、Bt、半胱氨酸蛋白酶抑制劑)。在一個實施方案中，該啟動子在可利用部位特異性地驅動表達。此時該基因可以是選自維生素合成基因、糖合成基因、脂質合成基因、聚酮合成基因、光學合成基因、功能性成分合成基因和轉錄因子的基因。
另一方面，本發明提供培育特異性地表達所需基因產物的方法，該方法包括確定啟動子的特異性的步驟，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定；
將該啟動子與編碼該所需基因產物的核酸分子進行可操作的連接，制備連接混合物的步驟；將該連接混合物導入植物的步驟；使該植物生長的步驟。
本發明還提供生產所需基因產物的方法。該方法包括以下步驟確定啟動子的特異性的步驟，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定；將該啟動子與編碼該所需基因產物的核酸分子進行可操作的連接，制備連接混合物的步驟；將該連接混合物導入植物的步驟；使該植物生長的步驟；以及收集該植物中的該所需基因產物的步驟。
在一個實施方案中，該啟動子的特異性可通過DNA芯片分析來確定。
在一個方面，本發明提供由本發明的方法得到的基因產物。基因產物有抗生素等藥物、多肽、蛋白質等。基因的二次代謝產物也可由本發明的方法得到。
以下根據實施例說明本發明，但以下實施例只是舉例的目的。本發明的范圍并不受上述實施方案的限定，只受權利要求的限定。
實施例(實施例1利用cDNA文庫鑒定特異性啟動子)(由水稻組織提取RNA)由以下的水稻組織中提取RNA芐基腺嘌呤處理的愈傷組織、赤霉素處理的愈傷組織、熱休克處理的愈傷組織、繁殖期的愈傷組織、幼根、幼綠葉、幼黃化葉、開花期的穗。簡單的辦法是在異硫氰酸胍和苯酚存在下使磨碎的植物組織進行蛋白質改性，與水層一起回收總RNA。真核生物的3末端具有polyA序列，因此使其吸附于固定有寡dT的載體上并進行洗脫，由此可特異性分離。
(由提取的RNA構建cDNA文庫)使用逆轉錄酶由提取的mRNA合成互補DNA鏈(1st Strand)，使RNaseH和DNA聚合酶作用，合成2nd Strand，構建cDNA文庫。
(cDNA文庫的分析)將構建的cDNA文庫與登記于DDBJ的已知序列進行比對，總結出每個相同或類似的基因的表達頻率。首先，由同源性檢索的結果提取出具有整個序列超過90％的非常高的同源性的克隆。第二，將該克隆相互比對，對其序列中特定位置上是否有堿基水平的差異進行了研究。當特定位置明顯有兩種或以上的堿基偏差時，則判定有同族的不同的基因；沒有偏差時，則判斷只是堿基序列自動確定裝置的讀取誤差。將判斷為相同的一個例子表示在圖1。其結果表示在以下的表中。
這里，CB表示芐基腺嘌呤處理的愈傷組織，CG表示赤霉素處理的愈傷組織，CH表示熱休克處理的愈傷組織，CK表示繁殖期的愈傷組織，RA表示幼根，SS表示幼綠葉，ST表示幼黃化葉，EB表示開花期穗，EC表示成熟早期的穗。
根據上表可以選擇顯示所需表達圖譜的啟動子。這里，例如選擇了脫分化狀態(愈傷組織)特異性啟動子、葉特異性啟動子、組成型表達啟動子。
脫分化狀態(愈傷組織)特異性啟動子由只在選自CB、CG、CH和CK的至少一個部位顯示表達、或該部位比其它部位顯示更多表達的基因的啟動子區獲得。這里，在以下的實施例中使用ID屬于CG0060_1的克隆。其序列表示為SEQ ID NO.1。
葉特異性啟動子由只在選自SS和ST的至少一個部位顯示表達、或該部位比其它部位顯示更多表達的基因的啟動子區獲得。這里，在以下的實施例中使用ID屬于EB0082_2的克隆。其序列表示為SEQID NO.2。
組成型啟動子由在整個部位幾乎顯示均勻的表達的基因的啟動子區獲得。這里選擇了ID屬于RA1583_1的克隆。其序列表示為SEQID NO.3。
(實施例2對所選擇的啟動子進行特異性確認)通過該實施例確認實施例1中選擇的各克隆是否具有目標特異性。具體的步驟如下。
(確定所選擇的克隆的堿基序列)首先確認所選擇的克隆是否與預想的序列相同。確定序列時，可通過本領域人員公知的雙脫氧染色終止法(dideoxy dyetermination)進行。簡單地說，通過熱變性使要確定序列的DNA鏈成為單鏈狀態，此時使引物附著于比要確定堿基序列的位置更上游的位置。在每個堿基上都附著了不同熒光色素的三磷酸雙脫氧核苷酸和三磷酸脫氧核苷酸的存在下，通過DNA聚合酶進行DNA合成反應。當雙脫氧核苷酸三磷酸被摻入時，DNA合成的延伸停止。用丙烯酰胺凝膠將該反應產物進行電泳，按照分子量進行分離，機械判讀熒光色素，即可確認堿基序列。
接著將確定的序列與登記在DDBJ的序列進行比對，確認上述各克隆具有目標序列。
(實施例3啟動子區的獲得)本實施例中，使用已確認具有目標序列的克隆來獲得啟動子區。可簡單地表示為以下的步驟。
首先，以登記于DDBJ的數據為基礎設計引物，使用市售的采用PCR基本技術分離已知序列的上游的試劑盒(Genomewalker；Clontech、美國)進行克隆，獲得目標基因的啟動子區。其方案如圖2所示。
這些片段具有0.6kb-2.5kb左右的長度。
(實施例4使用愈傷組織特異性啟動子培育功能性植物)(通過綠色熒光蛋白構建表達載體)使用綠色熒光蛋白、來自CG0060_1的克隆的啟動子區(SEQ IDNO.1)構建表達載體，其中推測來自CG0060_1的克隆的啟動子是驅動在愈傷組織特異性表達的啟動子。具體步驟如下。
用限制酶EcoRV完全消化水稻基因組DNA，在所有生成的DNA片段的兩端添加GenomeWalker的適配子引物(SEQ ID NO.4)，通過由適配子引物內部的序列和已知序列設計的引物對進行PCR反應，由此獲得啟動子區。
為了使用方便，在獲得的片段的兩端添加了限制酶識別序列。在5’末端一側設計含有適配子引物序列的一部分和限制酶識別序列的引物(SEQ ID NO.5)，3’末端一側設計含有翻譯起始位點之前緊鄰的序列和限制酶識別序列的引物(SEQ ID NO.6)，進行PCR反應，制備兩端添加了限制酶識別序列的啟動子盒(SEQ ID NO.7)。
如下構建雙元載體在雙元載體pTN1內部的設計的多克隆位點(multi-cloning site)HindIII和EcoRI之間插入下述結構的DNA片段通過啟動子盒形式的本發明的啟動子來驅動綠色熒光蛋白基因、通過來自農桿菌胭脂堿合成酶基因的轉錄終止信號序列進行轉錄終止。
(表達載體導入水稻)用構建的載體轉化水稻。其具體步驟如下。
將構建的載體通過電穿孔法導入農桿菌中，得到轉化農桿菌。將進行了預培養的水稻在轉化農桿菌存在下進行3天共培養，使其被農桿菌感染。用乙醇和次氯酸鈉溶液滅菌，在含有2，4-D的培養基上培養5天，用得到的水稻成熟種子培育農桿菌轉化的水稻。
(結果)結果，通過該啟動子得到了轉化水稻細胞。
(感染細胞的選擇)轉化水稻細胞通過在pTN載體中編碼的nptII基因獲得了遺傳霉素抗性，因此可用含有遺傳霉素的N6培養基培養，只篩選轉化水稻細胞。
(轉化水稻的再分化)接著，由轉化水稻再分化。其具體步驟如下。
轉化水稻細胞在含有細胞分裂素的培養基上誘導再分化，進一步在不含激素的培養基上培育，直至生長為可土培的個體，然后栽入盆中。
(結果)結果得到了植物的各組織。
(特異性表達的確認)將所得愈傷組織、植物體分成各部位(根、葉、莖、胚乳、胚)，確認表達特性。
(結果)結果如圖3-5所示。如圖所示，證實來自CG0060_1的啟動子在根中不驅動特異性表達。
另外證實驅動在愈傷組織中的特異性表達。還證實在葉和米粒中低于檢出下限。
(實施例5使用葉特異性啟動子培育功能性植物)(通過綠色熒光蛋白構建表達載體)使用綠色熒光蛋白、來自EB0082_2的克隆的啟動子區(SEQ IDNO.2)構建表達載體。其中推測來自EB0082_2的克隆的啟動子是驅動葉特異性表達的啟動子。
用限制酶DraI完全消化水稻基因組DNA，在所有生成的DNA片段的兩端添加GenomeWalker的適配子引物(SEQ ID NO.4)，通過由適配子引物內部的序列和已知序列設計的引物對進行PCR反應，由此獲得啟動子區。
為了使用方便，在獲得的片段的兩端添加限制酶識別序列。5’末端一側設計含有水稻基因組序列的一部分和限制酶識別序列的引物(SEQ ID NO.8)，3’末端一側設計含有翻譯起始位點之前緊鄰的序列和限制酶識別序列的引物(SEQ ID NO.9)，進行PCR反應，制備兩端添加了限制酶識別序列的啟動子盒(SEQ ID NO.10)。
(表達載體導入水稻)用構建的載體轉化水稻。簡單地說，構建如下雙元載體在雙元載體pTN1內部的設計的多克隆位點HindIII和EcoRI之間插入下述結構的DNA片段通過啟動子盒形式的本發明的啟動子來驅動綠色熒光蛋白基因、通過來自農桿菌胭脂堿合成酶基因的轉錄終止信號序列進行轉錄終止。
(結果)結果，通過該啟動子得到了轉化水稻細胞。
(制備轉化水稻的愈傷組織)接著，由轉化水稻制備愈傷組織。其具體步驟如實施例7所示。
(結果)結果得到了植物組織。
(轉化水稻的再分化)接著，使轉化水稻再分化。其具體步驟如實施例7所示。
(結果)結果得到了植物體。
(特異性表達的確認)將所得愈傷組織、植物體分成各部位(根、葉、莖、胚乳、胚)，確認表達特性。
(結果)結果如圖3-5所示。如圖所示，證實來自EB0082_2的啟動子在根中不驅動特異性表達(圖3)。
另外證實驅動葉中的特異性表達(圖4)。還證實該啟動子在米粒中驅動的表達低于檢出下限(圖5)。
(實施例6使用在胚乳中不表達的啟動子培育功能性植物)(通過綠色熒光蛋白構建表達載體)使用綠色熒光蛋白、來自RA1583_1的克隆的啟動子區(SEQ IDNO.3)構建表達載體。其中推測來自RA1583_1的克隆的啟動子是具有在胚乳中不表達的特異性的啟動子。
用限制酶PvuII完全消化水稻基因組DNA，在所有生成的DNA片段的兩端添加GenomeWalker的適配子引物(SEQ ID NO.4)，通過由適配子引物內部的序列和已知序列設計的引物對進行PCR反應，由此獲得啟動子區。
為了使用方便，在獲得的片段的兩端添加限制酶識別序列。5’末端一側設計含有適配子引物序列的一部分和限制酶識別序列的引物(SEQ ID NO.5)，3’末端一側設計含有翻譯起始位點之前緊鄰的序列和限制酶識別序列的引物(SEQ ID NO.11)，進行PCR反應，制備兩端添加了限制酶識別序列的啟動子盒(SEQ ID NO.12)。
(表達載體導入水稻)用構建的載體轉化水稻。簡單地說，構建如下雙元載體在雙元載體pTN1內部的設計的多克隆位點HindIII和EcoRI之間插入下述結構的DNA片段通過啟動子盒形式的本發明的啟動子來驅動綠色熒光蛋白基因、通過來自農桿菌胭脂堿合成酶基因的轉錄終止信號序列進行轉錄終止。
(結果)結果，通過該啟動子得到了轉化水稻細胞。
(感染細胞的選擇)接著，選擇感染細胞。其具體步驟如實施例7所示。
(轉化水稻的再分化)接著，使轉化水稻再分化。其具體步驟如實施例7所示。
(結果)結果得到了植物的各組織。
(特異性表達的確認)將所得愈傷組織、植物體分成各部位(根、葉、莖、胚乳、胚)，確認表達特性。
(結果)結果如圖3-5所示。如圖所示，證實來自RA1583_1的克隆的啟動子區在葉中驅動特異性表達(圖4)。該啟動子區在根中不驅動特異性表達。
另外證實顯著檢出作為可利用部位在米粒的胚芽中有特異性表達。
(實施例7驅動愈傷組織特異性表達的克隆的啟動子區的有用性驗證)下面，對推測為驅動在愈傷組織中特異性表達的啟動子——來自CG0060_1的克隆的啟動子區的啟動子，驗證其表達強度的實用性。具體步驟如下。
(啟動子區與報道基因的連接)下面，使用表達載體，將抗生素抗性基因——潮霉素磷酸轉移酶(HPT)與上述克隆的啟動子區連接，確認其表達強度的實用性。其步驟簡示如下。
對于具有通過CaMV35S啟動子驅動HPT基因的結構的雙元載體pTH1，除去其CaMV35S啟動子部分，取而代之，構建具有通過本發明的啟動子驅動HPT基因的結構的雙元載體。根據單子葉植物的超快速轉化法(日本特許第3141084號)所述方法導入水稻細胞。
(結果)結果如圖6和7所示。
由圖6中的電泳圖可知由本實施例制備并生長的水稻的愈傷組織中摻入了潮霉素磷酸轉移酶。另外，如圖7所示，本實施例構建的載體轉化的愈傷組織具有潮霉素抗性。結果顯示pTH是具有下述結構的載體通過作為陰性對照使用的CaMV35S啟動子驅動HPT基因。
還驗證插入本實施例中使用的啟動子的基因具有潮霉素抗性的足夠的表達強度。另外，作為對照使用的野生型則不具潮霉素抗性(圖7)。由此證實來自CG0060_1的克隆包含愈傷組織特異性啟動子區。
(實施例8在胚乳中不表達的啟動子區的有用性的驗證)下面，對推測為具有在胚乳中不表達的特異性的啟動子——來自RA1583_1的克隆的表達強度的實用性進行研究。具體步驟如下。
(啟動子區與報道基因連接)使用表達載體，將抗生素抗性基因與上述克隆的啟動子區連接，確認其作為啟動子的表達強度的實用性。其步驟如實施例7所示。
(結果)結果如圖6和7所示。
由圖6中的電泳圖可知本實施例制備并生長的水稻的愈傷組織中摻入了潮霉素磷酸轉移酶。另外，如圖7所示，由本實施例構建的載體轉化的愈傷組織具有潮霉素抗性。
還驗證插入本實施例中使用的啟動子的基因具有潮霉素抗性的足夠的表達強度。另外，作為對照使用的野生型則不具潮霉素抗性(圖7)。由此證實來自RA1583_1的克隆具有潮霉素抗性的足夠的表達強度。
(比較例)作為比較，使用來自CaMV 35S的啟動子，進行與實施例7和8的同樣的試驗。同樣該啟動子也賦予了潮霉素抗性。
(結論)如上所述，證實了利用具有某種特異性的啟動子培育的功能性植物實際上具有目標功能。其中所述特異性是根據含有啟動子的基因在cDNA數據庫中的表達頻率來確定的。
得以設計、培育上述功能性植物，這是現有技術無法實現的，是具有劃時代意義的技術，產業上的利用價值難以估量。
本發明提供改變了基因表達圖譜的功能性植物，以使其在目標部位特異性表達或不表達、。
工業實用性通過構建本發明的功能性植物的方法，得以構建用于使所需基因在植物的所需部位任意表達的系統。本發明的方法可提供可使基因產物在任意所需部位表達或不表達的功能性植物。這樣可以自由自在地提供功能植物，這在產業上非常有用。
序列表SEQUENCE LISTING<110>國立農業研究機構<120>功能性植物、用于培育該功能性植物的啟動子、及其應用方法<130>NG001PCT<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1705<212>DNA<213>水稻<400>1atcattaggc caaaagatcc cttattcaca acagtccata agaaattgct ttctccacag 60tacacaccat atttggataa ttgcattgga gcaatagatg gtactcacat ccaagttgtg 120gtgccaaatt cagctgctgt tcaacatagg aatagacata aggagaagag tcagaatgtt 180atgtttgtct gtgactttga tatgagattt actttcgtgc ttgctggctg gcctggttcg 240gttcatgaca tgagggtatt caatgatgca caaactagat ttagtgccaa gtttccaaag 300ccacctccag gaaagtttta tctcgtagac tcgggatacc caaataggct gggttatcta 360gcaccataca agggtataac atatcattcc aagagtacaa cgaaagcaca ttgccaaggg 420gaagaaggga gcactttaat tactgccatt attcgtgtcg gaatgtcata gagaggtcat 480ttggggtctt gaagaacaag tggaggattt tgtttagttt acctagctac tcgcaggaaa 540aacaaagcag aattatccat gcatgcatag cacttcataa tttcattaga gacagtcaaa 600tggctaatac agagttcgac aattgtgacc atgatgaaaa ttatgatcca ttgggtggaa 660cctctgctcc atctagtgaa ccaacaaacg atttggactc gcgtgtcatg aaccaatttc 720gggactgggt tgccgatgga ttgtggtctt tgaaaggaat gtaatgaatg gttcaaattt 780attgtgaatt gtatttggtt taacttgtca attgaaccat gagtgcttgt aatttgtaac 840attgaaactt ctgtgatgta tttcaacaac ttgagatgtg tatgagcttc tttgaatttc 900tgtgattagg ccgtgatatt gatgatgaaa atgatgtggg ggttattgct tgtgattcgg 960cttgctgaag gtgtgtattt gtccaaatta tgatggatta aaacatgtga tgttggggtg 1020aaacattgat ttggcttgca tttggttgtg ctgtcatgca gcaacaatgg ttttgcttgt 1080aaagtgctag cagcggcagc aaacagcatg ctgcagcaag gggcatggtg cagtccactt 1140tgtatggttt tagggggtaa tatggtcatt gtgcagcgca tttaataaac tttagtccct 1200tttagtccct ataaccaaac agttatggac taaaatgatt agtcctaaga ctaaaataag 1260tccctaggac ttatggatcc aaacaccacc atagtagaag ctatgggcgg gggcggcagt 1320ccgggtggca gcatcttcga tagagtggca gccgtccacc ggccgcttca tcgcgcgtgg 1380cggcagtcca cccagtatgc cgtcgtgggt aaccaatcgg catcgagacc tatccgcggg 1440acgaagccaa ccgttcgaat ggtgtgcgcg cgtgcatgca tgcgcgcggt ctcagttaat 1500gcattgcctc tcccgagtca agtggcgtgc tatgtttgca gaggcaaaca tgcatgagca 1560gatggcctgg tgaacttata tactcccggc aggcaagtga agtgcatgcc tgtatagctt 1620
gagcaagtat ttggcagttt gctgccaact gctaccctat ttcaaatcta ggtaagatct 1680agctgcaggt tatacagaga aggca 1705<210>2<211>1543<212>DNA<213>水稻<400>2gatccaaggc atcattccca actacagaag tgcgaggaac atatgttcca cccttccatg 60taaattcttg catgaacttg gaaaataaaa tgttcgtttt agaatgtata atccctgtcc 120tacgcaaatt tataactaaa gctaactgtt cattgaatct ttcaggttga gctatatcgc 180aacgatcagc accgcttcaa gattgttgtt gatggtgaga gcgaagttga cttgatggtg 240caaactcggc acatgcgaga cgtcatcatt ctggtgatta gaggtcttgc tcaaaagttc 300aacagcacat ctctcaactc actcctcaag atagaagcat gaagatcgag ttgccaacct 360gatataactt acagtatgaa accgattaga aaaggttgtt cagtatcgat tcaagttgtt 420tagtttggag gatgtgtaat atttatagga tttggagcgt ggcagctttt gtgtatgggt 480gtggttgagt gtgttaaagt ttttcttttt ctcaaatcag gagcgggttg ctcttctgac 540cctggttttc catactcacg aaatgtacat aggaaaggga gggttggtga tatggtgttg 600cattaatata caagttgtgt atgcagttct catattaggc tatatgattg attgggaaga 660ttttctgttt tttctggctc gtcatcgttg gtttcatata caaaattcga aatggaaata 720tgtacgagtg atggttattg aagtgtccat tctattttaa ttctttgcgc gttgtgaggt 780aatctcatcg tggtgtaggc ttacagcagt aagatgcgtc gccaccgttg tttcacattg 840caaaatccat ttctgcaatt gcaagcaatg ggcttcaagt tcttgattat ttcagttcat 900gactcggcat agcaccagca aaggagcaac tggtaaagtg gcacatccac ttcagtgtcg 960atgcaagcaa ctcattccag cctacaggaa cagtaaatcc aggttcattt actcattttt 1020ctgtggttga aaaataccaa gatttccatt tttcttactg ctccacataa ttcctatttc 1080ccattctctt gcacttattc cagcctacag ggacagtaaa tccaggttca tttactcatt 1140tttctgcggt tgaaaaaata ccaagatttc catttttttt actgctccac ataattcctc 1200tttcccattc tcttgctcac tatatatgcc tgtcaatttt tttgacagaa catgcatcaa 1260gtcaccacca acaacatttg cagctgcatc caagaacatt gcatgcagag gtgagcatct 1320tatccacatt ggcaggctct aaccaggaga tgccacatca gcagcaagga tctgtaacct 1380atccatgagt ggccactgca gtccacaagc tccccttgtg gctcccattc cacatctcct 1440ccaagaatta aagcccaatg catctccatg gtggcactgg acattatttt ttttcctcga 1500aactcagctg caaggagaaa ggagaaggta gggtttccag ccc 1543<210>3<211>661<212>DNA<213>水稻<400>3ctgaagcatc gatgtttccc tgctctcatt tatctttctt ccatgtaagc aaatttgtct 60aggtgacacc agagagagac ggtaaataat agtaaataat agcctttgta cattccctta 120tgtagttgtg cagtctattt ttggtgtgcg agttcggagt tcgaagtgtt ctgaagaatc 180tcttcttgta atttctagaa atggcattga ggaaattacc agtcttggct taaaaacaag 240tctgtctcgt cattcaccgt gcttatttag gacttgttca actcctgtag aaattctcga 300
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<223>人工序列的說明引物<400>4gtaatacgac tcactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt 48<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>5atgcaagctt tcgacggccc gggctggt28<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>6gcatggatcc tgccttctct gtataacctg c31<210>7<211>1735<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明啟動子盒<400>7aagctttcga cggcccgggc tggtatcatt aggccaaaag atcccttatt cacaacagtc 60cataagaaat tgctttctcc acagtacaca ccatatttgg ataattgcat tggagcaata 120gatggtactc acatccaagt tgtggtgcca aattcagctg ctgttcaaca taggaataga 180cataaggaga agagtcagaa tgttatgttt gtctgtgact ttgatatgag atttactttc 240gtgcttgctg gctggcctgg ttcggttcat gacatgaggg tattcaatga tgcacaaact 300agatttagtg ccaagtttcc aaagccacct ccaggaaagt tttatctcgt agactcggga 360tacccaaata ggctgggtta tctagcacca tacaagggta taacatatca ttccaagagt 420acaacgaaag cacattgcca aggggaagaa gggagcactt taattactgc cattattcgt 480gtcggaatgt catagagagg tcatttgggg tcttgaagaa caagtggagg attttgttta 540gtttacctag ctactcgcag gaaaaacaaa gcagaattat ccatgcatgc atagcacttc 600ataatttcat tagagacagt caaatggcta atacagagtt cgacaattgt gaccatgatg 660aaaattatga tccattgggt ggaacctctg ctccatctag tgaaccaaca aacgatttgg 720actcgcgtgt catgaaccaa tttcgggact gggttgccga tggattgtgg tctttgaaag 780gaatgtaatg aatggttcaa atttattgtg aattgtattt ggtttaactt gtcaattgaa 840ccatgagtgc ttgtaatttg taacattgaa acttctgtga tgtatttcaa caacttgaga 900tgtgtatgag cttctttgaa tttctgtgat taggccgtga tattgatgat gaaaatgatg 960tgggggttat tgcttgtgat tcggcttgct gaaggtgtgt atttgtccaa attatgatgg 1020attaaaacat gtgatgttgg ggtgaaacat tgatttggct tgcatttggt tgtgctgtca 1080tgcagcaaca atggttttgc ttgtaaagtg ctagcagcgg cagcaaacag catgctgcag 1140caaggggcat ggtgcagtcc actttgtatg gttttagggg gtaatatggt cattgtgcag 1200cgcatttaat aaactttagt cccttttagt ccctataacc aaacagttat ggactaaaat 1260gattagtcct aagactaaaa taagtcccta ggacttatgg atccaaacac caccatagta 1320gaagctatgg gcgggggcgg cagtccgggt ggcagcatct tcgatagagt ggcagccgtc 1380caccggccgc ttcatcgcgc gtggcggcag tccacccagt atgccgtcgt gggtaaccaa 1440tcggcatcga gacctatccg cgggacgaag ccaaccgttc gaatggtgtg cgcgcgtgca 1500tgcatgcgcg cggtctcagt taatgcattg cctctcccga gtcaagtggc gtgctatgtt 1560tgcagaggca aacatgcatg agcagatggc ctggtgaact tatatactcc cggcaggcaa 1620gtgaagtgca tgcctgtata gcttgagcaa gtatttggca gtttgctgcc aactgctacc 1680ctatttcaaa tctaggtaag atctagctgc aggttataca gagaaggcag gatcc 1735<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>8atgcaagctt gatccaaggc atcattccca 30
<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>9gcatggatcc ggctggagcc taccttctcc 30<210>10<211>1555<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明啟動子盒<400>10aagcttgatc caaggcatca ttcccaacta cagaagtgcg aggaacatat gttccaccct 60tccatgtaaa ttcttgcatg aacttggaaa ataaaatgtt cgttttagaa tgtataatcc 120ctgtcctacg caaatttata actaaagcta actgttcatt gaatctttca ggttgagcta 180tatcgcaacg atcagcaccg cttcaagatt gttgttgatg gtgagagcga agttgacttg 240atggtgcaaa ctcggcacat gcgagacgtc atcattctgg tgattagagg tcttgctcaa 300aagttcaaca gcacatctct caactcactc ctcaagatag aagcatgaag atcgagttgc 360caacctgata taacttacag tatgaaaccg attagaaaag gttgttcagt atcgattcaa 420gttgtttagt ttggaggatg tgtaatattt ataggatttg gagcgtggca gcttttgtgt 480atgggtgtgg ttgagtgtgt taaagttttt ctttttctca aatcaggagc gggttgctct 540tctgaccctg gttttccata ctcacgaaat gtacatagga aagggagggt tggtgatatg 600gtgttgcatt aatatacaag ttgtgtatgc agttctcata ttaggctata tgattgattg 660ggaagatttt ctgttttttc tggctcgtca tcgttggttt catatacaaa attcgaaatg 720gaaatatgta cgagtgatgg ttattgaagt gtccattcta ttttaattct ttgcgcgttg 780tgaggtaatc tcatcgtggt gtaggcttac agcagtaaga tgcgtcgcca ccgttgtttc 840acattgcaaa atccatttct gcaattgcaa gcaatgggct tcaagttctt gattatttca 900gttcatgact cggcatagca ccagcaaagg agcaactggt aaagtggcac atccacttca 960gtgtcgatgc aagcaactca ttccagccta caggaacagt aaatccaggt tcatttactc 1020atttttctgt ggttgaaaaa taccaagatt tccatttttc ttactgctcc acataattcc 1080tatttcccat tctcttgcac ttattccagc ctacagggac agtaaatcca ggttcattta 1140ctcatttttc tgcggttgaa aaaataccaa gatttccatt ttttttactg ctccacataa 1200ttcctctttc ccattctctt gctcactata tatgcctgtc aatttttttg acagaacatg 1260catcaagtca ccaccaacaa catttgcagc tgcatccaag aacattgcat gcagaggtga 1320gcatcttatc cacattggca ggctctaacc aggagatgcc acatcagcag caaggatctg 1380taacctatcc atgagtggcc actgcagtcc acaagctccc cttgtggctc ccattccaca 1440tctcctccaa gaattaaagc ccaatgcatc tccatggtgg cactggacat tatttttttt 1500cctcgaaact cagctgcaag gagaaaggag aaggtagggt ttccagcccg gatcc 1555
<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>11gcatggatcc tcttctctgc ttgggcga28<210>12<211>691<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明啟動子盒<400>12aagctttcga cggcccgggc tggtctgaag catcgatgtt tccctgctct catttatctt 60tcttccatgt aagcaaattt gtctaggtga caccagagag agacggtaaa taatagtaaa 120taatagcctt tgtacattcc cttatgtagt tgtgcagtct atttttggtg tgcgagttcg 180gagttcgaag tgttctgaag aatctcttct tgtaatttct agaaatggca ttgaggaaat 240taccagtctt ggcttaaaaa caagtctgtc tcgtcattca ccgtgcttat ttaggacttg 300ttcaactcct gtagaaattc tcgaaaattc ctcgacttta aatggagcct taccattttt 360tagcagatgc aacaactatt atactcctac ctgatgactg atgaggactg tgcagcgatc 420gatatgtgca tgtggccatg tccgaagcta attaaaggac ggaaggacca caagttggtg 480tataataatg gagagggcat tgaatcattg tttcaatatc cccatcagat aatattcaat 540aactcctatg gtgacgtcaa gcatcaatac atgaaggtta cttgttacca ccatcagaca 600agcatataat tgattgctct gatcaagcga tagcaaaaca aaatacaaac cagaacagtc 660tcaaagctcg cccaagcaga gaagaggatc c6919/9NG0019/9
權利要求
1.植物，該植物包含進行特異性表達的至少一個啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
2.權利要求1所述的植物，其中上述基因的表達為組成型表達。
3.權利要求1所述的植物，其中上述基因在葉中特異性表達。
4.權利要求1所述的植物，其中上述基因在愈傷組織中特異性表達。
5.權利要求1所述的植物，該植物為水稻。
6.權利要求1所述的植物，其中上述基因是抗病基因或抗蟲基因。
7.權利要求1所述的植物，其中上述基因是選自維生素合成基因、糖合成基因、脂質合成基因、聚酮合成基因、光學合成類基因、功能性成分合成基因和轉錄因子的基因。
8.啟動子，該啟動子進行特異性表達，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
9.權利要求8所述的啟動子，該啟動子不驅動果實中基因的表達。
10.權利要求8所述的啟動子，該啟動子特異性驅動葉中基因的表達。
11.權利要求8所述的啟動子，該啟動子特異性驅動愈傷組織中基因的表達。
12.表達盒，該表達盒含有進行特異性表達的啟動子，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率而確定。
13.權利要求12所述的表達盒，該表達盒驅動基因的組成型表達。
14.權利要求12所述的表達盒，該表達盒特異性驅動葉中基因的表達。
15.權利要求12所述的表達盒，該表達盒特異性驅動愈傷組織中基因的表達。
16.植物的可利用部位，該植物的可利用部位由包含進行特異性表達的至少一個啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因的植物獲得，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定。
17.權利要求16所述的可利用部位，該可利用部位是葉、莖或果實。
18.生產所需基因產物的方法，該方法包括確定啟動子的特異性的步驟，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定；將該啟動子與編碼該所需基因產物的核酸分子進行可操作的連接，制備連接混合物的步驟；將該連接混合物導入植物的步驟；使該植物生長的步驟；以及收集該植物中的該所需基因產物的步驟。
19.培育特異性表達所需基因產物的植物的方法，該方法包括確定啟動子的特異性的步驟，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率確定；將該啟動子與編碼該所需基因產物的核酸分子進行可操作的連接，制備連接混合物的步驟；將該連接混合物導入植物的步驟；使該植物生長的步驟。
20.權利要求19所述的方法，其中上述啟動子的特異性通過DNA芯片分析來確定。
21.基因產物，該基因產物由植物獲得，該植物是通過權利要求19所述的方法而獲得的。
全文摘要
本發明的課題在于構建一種使所需的基因在所需的植物部位任意表達的系統。該課題通過下述植物解決所述植物包含進行特異性表達的至少一個啟動子和與該啟動子可操作地連接的基因，該啟動子的特異性根據含有該啟動子的基因所在cDNA數據庫中含有該啟動子的基因的表達頻率來確定。cDNA數據庫可以利用基因組計劃中發表的內容。
文檔編號C07K14/415GK1625331SQ02828968
公開日2005年6月8日 申請日期2002年3月22日 優先權日2002年3月22日
發明者大槻寬, 大島正弘 申請人:獨立行政法人農業·生物系特定產業技術研究機構