基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續培養方法
【專利摘要】一種基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續培養方法，包括以下步驟：（1）將黑曲霉孢子液接種至種子培養基，培養制備成熟的種子液；（2）成熟的種子液經過分散器處理，得到分散菌絲種子液；（3）將步驟（2）得到的部分分散菌絲種子液以5~15%接種量轉接至發酵培養基發酵，當發酵培養基還原糖濃度低于0.5%時發酵結束；（4）將步驟（2）得到的部分分散菌絲種子液以5~15%接種量接種至種子培養基，培養制備得到下一級成熟的種子液，然后回到步驟（2），即實現黑曲霉種子連續培養。本發明提供的黑曲霉種子連續培養方法，能直接減少黑曲霉孢子繁瑣的培養過程，同時可以有效縮短成熟種子培養時間，提高原料利用率。
【專利說明】基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及發酵工程【技術領域】，尤其是涉及一種基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑 曲霉種子連續培養方法。
【背景技術】
[0002] 檸檬酸（Citric Acid)又名枸櫞酸，化學名稱是2-羥基丙烷三羧酸，無色晶體，常 含有一分子結晶水，無臭，具有很強的酸味，易溶于水，在冷水中比熱水中更容易溶解，常用 來鑒定和分離。在食品化妝醫藥、建筑、印染、洗滌等行業具有廣泛的用途，因其具有令人愉 悅的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，已成為當前世界上生成量和消費量最大的食用 有機酸。檸檬酸在新興行業的應用需求呈現出逐漸增長的趨勢。檸檬酸在環境可持續發展 方面有廣泛應用，可以有效清除焊接殘留，在生物聚合物、藥物運輸、組織工程中培養細胞 方面也具有巨大的潛力。
[0003] 檸檬酸發酵普遍采用黑曲霉二級發酵方式，即首先培養成熟的種子，然后成熟的 種子液轉接發酵培養。傳統種子培養過程是采用黑曲霉孢子接種方式，需要大量成熟的黑 曲霉孢子，黑曲霉孢子制備過程比較復雜。一批成熟的黑曲霉孢子需要經過平板篩選，斜面 培養，茄子瓶培養，最后麩曲桶培養等逐級擴大培養過程，制備過程繁瑣，活性篩選復雜，工 作量大，制備周期需要30d以上。同時，采用孢子接種方式培養種子工藝，僅孢子萌發需要 至少12h，因而成熟種子培養時間較長。
[0004] 傳統黑曲霉孢子逐級擴大培養過程存在流程長且復雜、篩選工作量大、周期長等 缺點，需要消耗大量的原料成本以及運行成本。因而，如何改進黑曲霉孢子制備過程，縮短 成熟種子培養時間，降低生產成本，是檸檬酸發酵生產亟待解決的一個重要問題。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術存在的上述問題，基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續培 養方法。本發明提供的黑曲霉種子連續培養方法，能直接減少黑曲霉孢子繁瑣的培養過程， 同時可以有效縮短成熟種子培養時間，提高原料利用率。
[0006] 本發明的技術方案如下： 一種基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續培養方法，包括以下步驟： (1) 將黑曲霉孢子液接種至種子培養基，培養20~32h，制備成熟的種子液； (2) 成熟的種子液經過分散器處理，得到分散菌絲種子液； (3) 將步驟（2)得到的部分分散菌絲種子液以5~15% (v/v)接種量轉接至發酵培養基 發酵，當發酵培養基還原糖濃度低于〇. 5%時發酵結束； (4) 將步驟（2)得到的部分分散菌絲種子液以5~15% (v/v)接種量接種至種子培養基， 培養16~24h，制備得到下一級成熟的種子液，然后回到步驟（2)，即實現黑曲霉種子連續培 養。
[0007] 步驟（1)中接種后黑曲霉孢子液濃度為4(Γ55萬個/ml接種。步驟（1)和步驟（4) 中的種子培養基的總糖8~12%，總氮0. 15~0. 4%。
[0008] 步驟（2)中成熟的種子液經過分散器處理，菌體的菌球或菌塊平均直徑 4(Tl00um。步驟（3)中的發酵培養基的總糖14?16%，總氮0. 05?0. 15%。
[0009] 所述種子培養基、發酵培養基為淀粉質原料液化液配制的培養基，原料包括玉米 粉，木薯，紅薯。其他菌絲經過分散處理的微生物發酵，均適用本技術。
[0010] 本發明有益的技術效果在于： 傳統的檸檬酸生產菌種的黑曲霉孢子逐級擴大培養存在流程復雜、周期長、孢子活力 篩選工作量大、種子培養周期長等問題，本發明基于菌絲球分散技術，采用分散菌絲替代傳 統孢子接種實現黑曲霉種子連續培養，直接減少傳統種子培養方式中孢子逐級擴大培養工 藝，縮短種子培養周期，降低原料與能量消耗；同時分散菌絲顆粒纏繞的菌絲較稀薄，利于 傳質與溶氧，提高糖酸轉化率。
[0011] 本發明具有以下優點： (1) 黑曲霉種子連續培養，直接減少孢子逐級擴大培養過程，減少此過程的原料消耗成 本與運行成本； (2) 采用分散的菌絲接種培養種子液，直接縮短孢子接種方式的孢子萌發時間，減少成 熟種子培養時間，減少過程運行成本； (3) 與傳統菌絲球接種發酵相比，采用相對分散的菌絲接種發酵方式，增大與介質接觸 的比表面積，利于傳質與溶氧，提高糖酸轉化率。
[0012] 本發明中種子連續培養10批次以上，從種子發酵結果看，糖酸轉化率> 98%，發酵 周期6(T70h，檸檬酸發酵水平正常。
【具體實施方式】
[0013] 在下面所有的實施方案中，總糖、還原糖采用菲林試劑滴定法，檸檬酸的測定采用 0. 1429mol/L的NaOH滴定，孢子計數采用血球計數板。菌絲分割采用高速分散機處理。其 它無特殊說明，均采用本領域常用的知識和方法。下面實施例中的黑曲霉種子的來源是宜 興協聯生物化學有限公司生產菌種。
[0014] 實施例1 : 葡萄糖與豆柏粉分別配制種子培養基（總糖為8%，總氮0. 15%)與發酵培養基（總糖為 16%，總氮0. 15%);移種后孢子液濃度為55萬個/ml接種；培養20h，得到成熟的種子液，種 子液菌絲經分散器分散，處理后的菌球平均直徑為l〇〇um，分別接入下一級種子培養基與發 酵培養基，接種量均為5%。其中接入下一級種子培養基的，種子培養24h，種子液經分散器 分散，處理后的菌球平均直徑80um，分別接入下一級種子培養基與發酵培養基；其中接入 下一級發酵培養基的，當發酵培養基中還原糖濃度降至0. 5%以下時發酵結束，如此循環。
[0015] 發酵第一批次結束時，發酵酸度15.65% (v/v)，糖酸轉化率97. 8%，發酵周期64h ; 循環8次時，發酵酸度15. 74% (v/v)，糖酸轉化率98. 4%，發酵周期65h。如此循環10次，糖 酸轉化率> 98%，發酵周期< 65h，檸檬酸發酵水平正常。
[0016] 實施例2: 玉米粉與去離子水按1:3比例在60°C左右的配料罐中混合均勻，加入氫氧化鈣將pH調 至6. 0,按25U/g玉米粉加入高溫α -淀粉酶，經過二次噴射液化，經碘試合格(淺棕色)，得 到玉米液化混液；80%的混液經過板框過濾得到玉米液化清液。玉米液化混液與清液按照 一定的比例混合配制種子培養基（總糖10%，添加一定量的硫酸銨調節總氮0.4%)與發酵 培養基（總糖14%，總氮0. 05%)。移種后孢子液濃度為58萬個/ml接種；培養26h，得到成 熟的種子液，種子液菌絲經分散器分散，處理后的菌球平均直徑為55um，分別接入下一級種 子培養基與發酵培養基，接種量分別為15%(v/ v)，10%(v/v)。其中接入下一級種子培養基 的，種子培養16h，種子液經分散器分散，處理后的菌球平均直徑lOOum，分別接入下一級種 子培養基與發酵培養基；其中接入下一級發酵培養基的，當發酵培養基中還原糖濃度降至 0. 5%以下發酵結束，如此循環。
[0017] 發酵第一批次結束時，發酵酸度13. 78% (v/v)，糖酸轉化率98. 4%，發酵周期65h ; 循環7次時，發酵酸度13. 8% (v/v)，糖酸轉化率98. 6%，發酵周期65h。如此循環10次，糖酸 轉化率> 98%，發酵周期< 65h，檸檬酸發酵水平正常。
[0018] 實施例3: 同實施例2,玉米粉與水按照一定的比例混合均勻，經過二次噴射液化得到玉米液化混 液，玉米液化混液與水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸銨配制種子培養基（總糖 8%，總氮0. 2%)。木薯粉與水按照1:4比例在60°C左右的配料罐中混合均勻，加入氫氧化鈣 將pH調至5. 8,按25U/g木薯粉加入高溫α -淀粉酶，經過二次噴射液化，經碘試合格，得到 木薯液化液；木薯液化液與水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸銨，配制發酵培養基 (總糖15. 6%，總氮0. 076%)。移種后孢子液濃度為48萬個/ml接種；培養32h，得到成熟的 種子液，種子液菌絲經分散器分散，處理后的菌球平均直徑為68um，分別接入下一級種子培 養基與發酵培養基，接種量分別為1〇%(ν/ν)，15%(v/v)。其中接入下一級種子培養基的，種 子培養24h，種子液經分散器分散，處理后的菌球平均直徑51um，分別接入下一級種子培養 基與發酵培養基；其中接入下一級發酵培養基的，當發酵培養基中還原糖濃度降至〇. 5%以 下發酵結束，如此循環。
[0019] 發酵第一批次結束時，發酵酸度15. 41% (v/v)，糖酸轉化率98. 8%，發酵周期64h ; 循環8次時，發酵酸度15. 47% (v/v)，糖酸轉化率99. 2%，發酵周期63h。如此循環10次，糖 酸轉化率> 98%，發酵周期< 65h，檸檬酸發酵水平正常。
[0020] 實施例4 : 同實施例2,玉米粉與水按照一定的比例混合均勻，經二次噴射液化得到玉米液化混 液，玉米液化混液與水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸銨配制種子培養基（總糖 9%，總氮0. 18%)。同實施例3,木薯粉與水按照1:4比例混合經二次噴射液化，得到木薯液化 液；木薯液化液、玉米液化混液與水按照一定的比例混合，配制發酵培養基（總糖15. 8%，總 氮0. 09%)。移種后孢子液濃度為40萬個/ml接種；培養25h，得到成熟的種子液，種子液菌 絲經分散器分散，分散后的菌球平均直徑為72um，分別接入下一級種子培養基與發酵培養 基，接種量分別為15%(v/v)，15%( v/v)。其中接入下一級種子培養基的，種子培養20h，種 子液經分散器分散，處理后的菌球平均直徑66um，分別接入下一級種子培養基與發酵培養 基；其中接入下一級發酵培養基的，當發酵培養基中還原糖濃度降至〇. 5%以下發酵結束， 如此循環。
[0021] 發酵第一批次結束時，發酵酸度15. 46%(v/v)，糖酸轉化率97. 89%，發酵周期63h ; 循環10次時，發酵酸度15. 66% (v/v)，糖酸轉化率99. 1%，發酵周期64h。如此循環10次，糖
【權利要求】
1. 一種基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續培養方法，其特征在于包括以下 步驟： (1) 將黑曲霉孢子液接種至種子培養基，培養20~32h，制備成熟的種子液； (2) 成熟的種子液經過分散器處理，得到分散菌絲種子液； (3) 將步驟（2)得到的部分分散菌絲種子液以5~15% (v/v)接種量轉接至發酵培養基 發酵，當發酵培養基還原糖濃度低于〇. 5%時發酵結束； (4) 將步驟（2)得到的部分分散菌絲種子液以5~15% (v/v)接種量接種至種子培養基， 培養16~24h，制備得到下一級成熟的種子液，然后回到步驟（2)，即實現黑曲霉種子連續培 養。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中接種后黑曲霉孢子液濃度為 40?55萬個/ml接種。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)和步驟（4)中的種子培養基的總 糖8?12%，總氮0· 15?0· 4%。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中成熟的種子液經過分散器處理， 菌體的菌球或菌塊平均直徑4(Tl00um。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中的發酵培養基的總糖14~16%， 總氮 0· 05?0· 15%。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述種子培養基、發酵培養基為淀粉質原 料液化液配制的培養基，原料包括玉米粉，木薯，紅薯。
7. 根據權利要求1飛任一項所述的方法，其特征在于其他菌絲經過分散處理的微生物 發酵，均適用本技術。
【文檔編號】C12R1/685GK104099253SQ201410329652
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】石貴陽, 王寶石, 張 杰, 胡志杰, 蔣小東, 孫福新, 李贏, 張梁, 李由然, 丁重陽, 顧正華 申請人:江南大學, 宜興協聯生物化學有限公司