一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法

一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法，該方法以溫敏型質粒pKS2為載體，通過同源重組的方法去除嘌呤操縱子(purEKBCSQLFMNHD)的啟動子部分片段，其優選序列片段是缺失purE基因前-193～-29bp片段，缺失該片段后的菌株解除了purR(嘌呤操縱子的阻遏蛋白)的阻遏效應和該段片段的回文結構帶來的轉錄衰減作用。purF編碼磷酸核糖焦磷酸(PRRR)轉酰胺酶基因通過點突變脫敏，其優選是217亮氨酸突變為異亮氨酸(L217I)，其所受產物腺苷酸，鳥苷酸的反饋抑制被解除。經過改造后的基因工程菌鳥苷生產能力明顯提高。
【專利說明】一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體地說，涉及一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產 量的方法。 技術背景
[0002] 鳥嘌呤核苷，即鳥苷，是嘌呤核苷類的一種，是鳥嘌呤N-9與D-核糖的C-1通過 β_糖苷鍵相連形成的。鳥苷在食品和醫藥工業有非常廣泛的用途。在食品工業，鳥苷磷酸 酯為鳥苷酸，鳥苷酸和肌苷酸組成呈味核苷酸鈉作為新一代的核苷類食品增鮮劑，是味精 鮮味的十幾倍，是目前方便面調味包、調味品（如雞精、醬油等）的主要呈味成分之一。在 醫藥工業，鳥苷作為很多高效藥物的中間體，比如流感病毒、艾滋病毒和皰疹病毒等抗病毒 藥物。例如許多乙肝病毒藥物，如拉米夫定、恩替卡韋等，中間體都是鳥苷。
[0003] 目前，微生物發酵生產是鳥苷主要的生產方法，微生物發酵生產菌主要是芽孢桿 菌類，包括解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌很短小芽孢桿菌等。芽孢桿菌類作為生產鳥苷的 出發菌株的特點是磷酸戊糖途徑比較活躍，嘌呤核苷磷酸化酶活力低。在微生物體內，鳥 苷的生物合成途徑有兩條：分別是從頭合成途徑和補救合成途徑。在工業微生物生產中， 通過添加碳源、氮源、無機鹽和生長因子為原材料，經過一系列酶促反應，從頭合成生成鳥 苷。在芽孢桿菌中，生產核苷需要經過一個包含12個基因的操縱子（purEKBCSQLFMNHD)， 稱為嘌呤操縱子。嘌呤核苷酸生物合成的調控機制非常復雜，包括轉錄阻遏、轉錄衰減及末 端產物反饋抑制等。而嘌呤操縱子的調控直接導致嘌呤核苷的產量。purR是嘌呤操縱子 的阻遏蛋白，調控一系列有關噪呤代謝基因表達，Aloke等[Aloke Kumar Bera，Jianghai Zhu,Howard Zalkin, et al. Fuctional Dissection of the Bacillus subtilis pur Operator site. Jouranl of Bacteriology, 2003, 185(14) :4099-4109]報道purR基因特異 性的錨定在purE基因前兩個14個核苷酸反向重復稱之為"PurBox"上，阻礙嘌呤操縱子的 轉錄。嘌呤操縱子的轉錄除了受purR的阻遏作用外，還受轉錄衰減的調控。Daniel等報 道[Daniel J. Ebbole and Howard zalkin. Detection of pur Operon-attenuated mRNA and Accumulated Degradation Intermediates in Bacillus subtilis. The Journal of Biological Chemistry. 1988,263(22):10894-10902]調控操縱子的轉錄從 purE 基因上游 242個核苷酸開始，在這之間有兩個回文結構，使轉錄提前終止，這個終止轉錄并不依賴〇 因子。因此，通過對嘌呤操縱子上游基因進行操作可以解除purR表達的阻遏蛋白對嘌呤操 縱子的轉錄起始的阻遏效應，也可以避免回文結構使嘌呤操縱子的轉錄提前結束。
[0004] purF編碼PRPP轉酰胺酶是芽孢桿菌屬內鳥苷合成途徑上的一個關鍵酶，催化 PRPP生成5-磷酸核糖胺，促進胞內的PRPP進入嘌呤（pur)合成途徑。何逵夫等（何逵夫，馬 躍超，杜姍姍，謝希賢，徐慶陽，陳寧.解淀粉芽孢桿菌關鍵酶基因過量表達對鳥苷積累的 影響.微生物學報.2012, 52 (6) : 718?725)通過換用強啟動子增強purF的表達來增加鳥 苷的產量，指出過量表達策略能使鳥苷產量提高，這可能與胞內的核苷酸濃度很低以至于 反饋抑制沒有形成有關。但關鍵酶的反饋抑制并未解除。PRPP轉酰胺酶主要受到腺苷酸的 反饋抑制，還受到GMP的反饋抑制作用。Shimaoka等（Shimaoka Μ·，Takenaka Υ·，Kurahashi 0. , etal. Effect of amplification of desensitized purF and prs on inosine accumulation in Escherichia coli[J].J Biosci Bioeng, 2007, 103 (3) :255-61)將脫敏 的PurF和Prs導入到大腸桿菌中表達，成功地提高了肌苷的產量。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服現在技術的不足，提供一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷 產量的方法。
[0006] 本發明的方法涉及的宿主菌是解淀粉芽孢桿菌，通過對該菌進行兩個位點的改 造。兩個改造位點一個是嘌呤操縱子（purEKBCSQLFMNHD)的啟動子部分片段即是缺失purE 基因前-193?-29bp片段；第二個是purF編碼磷酸核糖焦磷酸（PRRR)轉酰胺酶基因氨基 酸217亮氨酸突變為異亮氨酸（L217I)的點突變。經過改造后的基因工程菌鳥苷生產能力 提1?。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0008] -種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法，包括如下步驟：嘌呤操縱子 (purEKBCSQLFMNHD)的啟動子部分片段即purE基因（編碼磷酸核糖氨基咪唑碳酸化酶） 前-193?-29bp片段缺失；或是將purF基因（編碼磷酸核糖焦磷酸PRRR轉酰胺酶）的 217位氨基酸亮氨酸突變為異亮氨酸（L217I)。所述purE基因前-193?-29bp片段缺 失，其DNA序列如SEQIDN0:1所示。所述purF基因氨基酸序列217位突變，其DNA序列如 SEQIDN0:2 所示。
[0009] 在上述方法中，所述構建解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensXH- Δ p〇 : PCR 擴增解淀粉芽孢桿菌 DSM7 菌株（BacillusamyloliquefaciensDSM7 :ATCC23350) 嘌呤啟動子基因的DNA片段，然后通過融合PCR將purE基因前-193?-29bp片 段缺失，融合PCR擴增產物連接入pKS2質粒基因，最后將重組的pKS2質粒轉化 入解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensXH，經過同源重組，得到解淀粉芽孢桿菌 B. amyloliquefaciensXH-Δp〇 ；
[0010] 在上述方法中，所述構建解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens XH7- Λ po-purF-217 :PCR 擴增解淀粉芽抱桿菌 DSM7 菌株 (BacillusamyloliquefaciensDSM7 :ATCC23350)purF 基因，然后通過融合 PCR 將 purF 基因 217位氨基酸突變（L217I)由原來的亮氨酸突變為異亮氨酸，融合PCR擴增產物連接入pKS2 質粒基因，最后將重組的pKS2質粒轉化入解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensXH-Δρ〇， 經過同源重組，得到解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens ΧΗ7- Λ p〇-purF-217。 toon] 利用改造后所得解淀粉芽孢桿菌工程菌生產鳥苷的方法，包括以下步驟：將解 淀粉芽抱桿菌 Bacillus amyloliquefaciens XH7- Λ p〇-purF-217 在 37 °C 的固體活 化培養基中培養24?36h，得到活化的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens XH7- Λ p〇-purF-217 ;然后將活化的解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens XH7-Λ po-purF-217以單菌落接入搖瓶種子培養基，37 °C培養6?7h，按體積比10 %的 接種量接種到搖瓶發酵培養基中，37°C發酵60?72h，將發酵液加熱、離心，將上清液過 0. 22 μ m的膜HPLC檢測鳥苷含量。
[0012] 所述固體活化培養基成分（重量百分比）：1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母抽提 物，1 %葡萄糖，1.5%瓊脂，余量為水；搖瓶種子培養基成分（重量百分比）：葡萄糖1.5%， 蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，NaClO. 5%，余量為水，pH7. 2 ;搖瓶發酵培養基成分（重量百分 比）：葡萄糖8%，硫酸鎂0.6%，酵母粉0.8%，硫酸二氫鉀0. 15%，硫酸銨1.0%，氯化鉀 0· 15%，味精1.6%，碳酸鈣0.3%，余量為水，ρΗ7· 2。
[0013] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0014] (1)本發明是在一株解淀粉芽孢桿菌菌株上進行基因工程操作達到積累、提高鳥 苷產量的目的。涉及兩個新的改造位點，一是優選序列片段操縱子（purEKBCSQLFMNHD) 的啟動子部分片段即缺失purE基因前-193?-29bp片段，缺失該片段后的菌株解除了 purR(嘌呤操縱子的阻遏蛋白）的阻遏效應和該段片段的回文結構帶來的轉錄衰減作用。 二是purF編碼磷酸核糖焦磷酸（PRRR)轉酰胺酶基因優選是217亮氨酸突變為異亮氨酸 (L217I)，其所受產物腺苷酸，鳥苷酸的反饋抑制被解除。
[0015] (2)通過溫敏性質粒以同源重組的方法在基因組染色體上的改造，無抗生素標記 和外源DNA片段。所構建的工程菌因目的基因整合到染色體上，遺傳穩定性高，從而導致生 產性能穩定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例中1擴增purE基因起始密碼子-193?-29bp截斷的PCR產物電泳 圖；
[0017] 圖2是實施例中2擴增含有purF基因 L2171突變位點的PCR產物電泳圖；
[0018] 圖3是（a)實施例中1嘌呤啟動子缺失片段和（b)實施例中2purF基因點突變片 段構建示意圖；
[0019] 圖4是實施例中1嘌呤啟動子截斷片段DNA的載體構建示意圖；
[0020] 圖5是實施例中2含有purF(L217I)突變片段的載體構建示意圖。

【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0022] 以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括PCR擴增、質粒提取、DNA片 段酶切、連接、凝膠電泳都采用常規的方法，具體可參見《分子克隆實驗指南》（第三版） (SambrookJ, Russell DW，JanssenK, Argentine J.黃培堂等譯，2002,北京：科學出版社）。
[0023] 實施例1 :
[0024] 以解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensXH7為出發菌株的產鳥苷工程菌 B. amyloliquefaciens XH- Λ po 的構建
[0025] (1)含有嘌呤啟動子截斷片段的獲得：含有解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株（Bacillus amyloliquefaciens XH7:CP002927)嘌呤啟動子基因的DNA片段通過用該細菌的染色體 DNA作為模板進行PCR而獲得，引物為SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4擴增同源臂左臂，引物為 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6擴增同源臂右臂，基因 PCR擴增的產物膠回收，然后取等摩爾比 例的擴增產物作為模板，所用正向引物和反向引物分別為SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 6,擴增 出與purE基因起始密碼子-193?-29bp截斷基因大小相符的DNA片段，如圖1所示，圖中 泳道1為DNA marker ;泳道2、3均為RCR產物（purE基因起始密碼子-193?-29bp截斷 的基因）。通過Sanger測序結果證明獲得片段是將purE基因起始密碼子-193?-29bp的 DNA片段截斷的DNA片段。
[0026] (2)同源替換載體的構建：將溫敏性質粒PKS2用spel、kpnl雙酶切，spel、kpnl 雙酶切上下同源臂然后用cycle pure柱純化產物，以T4DNA連接酶連接，所使用的同源臂 是解淀粉芽孢桿菌DSM7的yebG和purE基因，將融合PCR的產物插入，即成功構建融合質 粒 PKS2-Apo。
[0027] (3)目的菌株的獲得：將構建好的融合質粒PKS2-Apo轉化芽孢桿菌XH7， 通過同源重組的方式整合到芽孢桿菌XH7基因組上，轉化方法參見以下文獻記載 Natalia P, Zakataeva, Oksana V et al. A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformab1e Bacillus amyloliquefaciens strains[J].Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 85:1201-1209),得到 新的菌株 B. amyloliquefaciens XH7- Λ po〇
[0028] 實施例2 :
[0029] 以解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensXH-Λ po為出發菌株的產鳥苷 工程菌 B. amyloliquefaciensXH7_ Λ po-purF-217 的構建
[0030] (l)purF基因擴增和突變片段的獲得：含有解淀粉芽孢桿菌XH7菌株（Bacillus amyloliquefaciens XH7:CP002927)嘌呤啟動子基因的DNA片段通過用該細菌的染色體 DNA作為模板進行PCR而獲得，引物為SEQ ID No7、SEQ ID No8擴增同源臂左臂，引物為 SEQIDN〇9、SEQIDNolO擴增同源臂右臂，基因 PCR擴增的產物膠回收，然后取等摩爾比例的 擴增產物作為模板，所用正向引物和反向引物分別為SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 10,擴增出 一條含有purF基因 L217I突變位點的大小相符的DNA片段。如圖2所示，圖中泳道1為 DNAmarker ;泳道2、3均為RCR產物（含有purF基因 L2171突變位點基因片段）。通過Sanger 測序結果證明獲得片段大小是有purF基因 L217I突變位點的基因，即leu(DNA:CTT)突變 為 ile(DNA:ATT)。
[0031] (2)同源替換載體的構建：將溫敏性質粒PKS2用spel、kpnl雙酶切，spel、kpnl 雙酶切上下同源臂然后用cycle pure柱純化產物，以T4DNA連接酶連接，所使用的同源臂 是解淀粉芽孢桿菌XH7的purF基因，將融合突變位點的purF產物插入，即成功構建融合質 粒 PKS2-purF-217。
[0032] (3)將融合基因整合到產核苷菌株基因組上獲得purF突變的菌株：將構 建好的融合質粒PKS2-purF-217轉化芽孢桿菌XH7- Λρο,通過同源重組的方式整 合到芽孢桿菌ΧΗ7基因組上，轉化方法參見以下文獻記載Natalia P，Zakataeva， Oksana V et al. A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains [J] · Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 85:1201-1209)，得到新的菌株 Bacillus amyloliquefaciens XH7_ Λ p〇-purF_217〇
[0033] 實施例3 :
[0034] 構建的解淀粉芽抱桿菌工程菌 Bacillus amyloliquefaciensXH- Λ po 和 B. amyl oliquefaciensXH7- Λ po-purF-217搖瓶發酵產鳥苷能力的檢測
[0035] (1)從保藏的甘油管中（甘油濃度18%，-80°C保藏）劃線于優選的固體活化培 養基（重量百分比）（成分：1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母抽提物，1%葡萄糖，1.5%瓊 月旨，余量為水）上，37°C培養24?36h ;挑取固體平板上長出的單菌落，接種于搖瓶種子培 養基（重量百分比）（成分：葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaC10.5%，ρΗ7·2) 中，37°C培養6?7h，按體積比10%的接種量接種到搖瓶發酵培養基（重量百分比）（葡萄 糖8%，硫酸鎂0.6%，酵母粉0.8%，硫酸二氫鉀0. 15% ;硫酸銨1.0%，氯化鉀0. 15%，味 精1.6%，碳酸鈣0.3% (分消），余量為水，ρΗ7·2。）中，37°C發酵60?72h。
[0036] (2)將發酵液于沸水中保溫5min，5000rpm轉速離心2min，將上清液過0· 22μηι的 膜HPLC檢測鳥苷含量。HPLC檢測鳥苷的條件是：流動相甲醇：水=10:90(體積比）；檢測 柱：Phenomenex Gemini5 μ mC18 規格 250*4. 6mm ;檢測波長：紫外 254nm ;流速：lml/min ;柱 溫：25?30°C。鳥苷標準品購于sigma公司。搖瓶結果如下表所示：
[0037] 表1兩株工程菌搖瓶發酵產鳥苷評估結果（三次重復均值）
[0038]

【權利要求】
1. 一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法，其特征在于包括如下步驟：嘌呤操 縱子的啟動子部分片段即purE基因前-193?-29bp片段缺失；或是將purF基因的217位 氨基酸亮氨酸突變為異亮氨酸。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述purE基因前-193?-29bp片段缺失， 其DNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述purF基因氨基酸序列217位突變，其 DNA序列如SEQ ID N0:2所示。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述構建解淀粉芽孢桿菌 B. amyloliquefaciensXH-Λρο :PCR擴增解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株嘌呤啟動子基因的DNA 片段，然后通過融合PCR將purE基因前-193?-29bp片段缺失，融合PCR擴增產物連接入 pKS2質粒基因，最后將重組的pKS2質粒轉化入解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens XH， 經過同源重組，得到解淀粉芽孢桿菌13.311171〇1丨9116€3(^6118乂!1-八卩〇; 所述構建解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-Ap〇-purF_217 :PCR擴 增解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株purF基因，然后通過融合PCR將purF基因217位氨基酸突變 由原來的亮氨酸突變為異亮氨酸，融合PCR擴增產物連接入pKS2質粒基因，最后將重組的 pKS2質粒轉化入解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensXH-Δρο,經過同源重組，得到解淀 粉芽抱桿菌 Bacillusamyloliquefaciens XH7- Λ p〇-purF_217〇
5. 利用權利要求4所得解淀粉芽孢桿菌工程菌生產鳥苷的方法，其特征在于包括以下 步驟：將解淀粉芽抱桿菌 Bacillusamyloliquefaciens XH7- Λ po-purF-217 在 37°C的固 體活化培養基中培養24?36h，得到活化的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amylol iquefaciens XH7- Λ p〇-purF-217 ;然后將活化的解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens XH7-Λ po-purF-217以單菌落接入搖瓶種子培養基，37 °C培養6?7h，按體積比10 %的 接種量接種到搖瓶發酵培養基中，37°C發酵60?72h，將發酵液加熱、離心，將上清液過 0. 22 μ m的膜HPLC檢測鳥苷含量。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述固體活化培養基成分（重量百分比）： 1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母抽提物，1%葡萄糖，1.5%瓊脂，余量為水；搖瓶種子培養 基成分（重量百分比）：葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaClO. 5%，余量為水， PH7. 2 ;搖瓶發酵培養基成分（重量百分比）：葡萄糖8%，硫酸鎂0.6%，酵母粉0.8%，硫酸 二氫鉀0. 15%，硫酸銨1.0%，氯化鉀0. 15%，味精1.6%，碳酸鈣0.3%，余量為水，pH7. 2。
【文檔編號】C12R1/07GK104232674SQ201410336004
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】廖瑜玲, 謝暢豐, 李紅, 潘力, 謝清華 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司, 華南理工大學