利用玉米黑粉菌mig2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法，包括以下步驟：1)MIG:GFP質粒載體的構建；2)球孢白僵菌DNA提取；3)球孢白僵菌原生質體的制備；4)PEG介導的遺傳轉化；5)PCR檢測；6)轉化子熒光觀察。本發明技術方案獲得的原生質體再生率達70％以上。
【專利說明】利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法。
【背景技術】
[0002]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一種致病性與適應性很強,且寄主范圍廣的昆蟲病原真菌，已被作為昆蟲真菌制劑廣泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育種過程中，啟動子是外源或內源基因導入效率的重要因素之一。
[0003]目前，球孢白僵菌的遺傳轉化啟動子主要采用來源于構巢曲霉的PgpdA啟動子，長度為2000余bp，雖然具有良好的轉化效率，但單一的啟動子對不同類型基因進行轉化時，會受到酶切位點而影響遺傳轉化載體的構建，其大小也會影響遺傳轉化載體的構建，并且影響轉化效率，因此，開發一種新的高效啟動子能夠為球孢白僵菌遺傳轉化載體的構建提供更多的選擇，為球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育種奠定基礎。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法。其具體技術方案為:
[0005]一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法，包括以下步驟:
[0006]1)MIG:GFP質粒載體的構建
[0007]利用特異引物以質粒MIG = CAR為模板擴增得MIG2-5全序列，克隆到pUCm_T載體上，形成pUC-MIG，并測序驗證；然后用XbaI和NcoI雙酶切pUC_MIG和PF質粒，回收MIG片段，克隆到用相同酶切的PF載體上，形成MIG =GFP載體；
[0008]2)球孢白僵菌DNA提取
[0009]10mg菌粉液氮研磨成粉末；
[0010]置于預先加入600 μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ；
[0011]加入100 μ LlO % SDS,充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴Ih,不用顛倒；
[0012]加入100 μ L3MNaAc,4 °C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ；
[0013]吸取上清液轉入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酌.抽提，12000r/min離心1min ；
[0014]取上清加入RNA酶，65°C水浴30min ；
[0015]加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心1min ；
[0016]取上清，加入2倍體積的冰預冷無水乙醇，-20 V冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ；
[0017]棄上清，留沉淀，以50-100 μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min,洗漆1-2 次；
[0018]干燥后，加入50 μ LTE溶解DNA，保存于_20°C備用；
[0019]3)球孢白僵菌原生質體的制備
[0020]將培養好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；
[0021]滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中；
[0022]在EP管中加入4mL的LB液體培養基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
[0023]28°C 下 100r/min 培養 20_25min ；
[0024]將EP管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；
[0025]用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；
[0026]28°C下100r/min培養lh，并鏡檢觀察，此時視野中應得到透明圓球狀的原生質體；
[0027]4) PEG介導的遺傳轉化
[0028]將得到的原生質體懸液吸取400 μ L到2個新的EP管中，做好標記，分別為CK對照 MIG:GFP ；
[0029]對應管中分別加入10 μ LMIG:GFP質粒，冰浴20min ；
[0030]每個管中各加入100 μ LPEG4000溶液，混勻，冰浴20min ；
[0031 ] 各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ；
[0032]加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；
[0033]吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標記，于28 °C恒溫箱培養24h ；
[0034]將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復吸打；吸出100 μ L均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養基上，于28°C恒溫箱培養并觀察；
[0035]5) PCR 檢測
[0036]首先利用氯化芐法提取白僵菌基因組DNA ；
[0037](I) 10mg菌粉液氮研磨成粉末；
[0038](2)置于預先加入600 μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ；
[0039](3)加入100 μ L10% SDS,充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴Ih,不用顛倒；
[0040](4)加入100 μ L3MNaAc，4°C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ；
[0041](5)吸取上清液轉入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心1min ；
[0042](6)取上清加入RNA酶，65°C水浴30min ；
[0043](7)加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心 1min ；
[0044](8)取上清，加入2倍體積的冰預冷無水乙醇，-20 V冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ；
[0045](9)棄上清，留沉淀，以50-100 μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min,洗漆1_2次；
[0046](10)干燥后，加入50 μ L TE溶解DNA，保存于_20°C備用；
[0047]利用基因組DNA做模版，以MIG2-5特異性引物進行PCR及電泳檢測；
[0048]6)轉化子熒光觀察
[0049]將轉化子在PDA平板上劃線26°C培養3天，掛下菌絲及孢子置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
[0050]優選地，步驟2)和步驟4)中所述提取液為I % SDS,0.5MNaCl、0.2MTris_Hcl、
0.01MEDTA、ph = 8.0。
[0051]與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明技術方案獲得的原生質體再生率達70%以上。應用來源于玉米黑粉菌的MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化，其轉化效率達到21個轉化子/ μ gDNA。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052]圖1是MIG =GFP載體圖譜
[0053]圖2是制備的原生質體
[0054]圖3是MIG =GFP轉化子及對照圖片；圖3a是轉化子圖片，圖3b是對照圖片；
[0055]圖4是轉化子PCR檢測圖片，泳道M為分子量marker，泳道I為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3為空白對照，泳道4-11為轉MIG =GFP基因樣品檢測；
[0056]圖5是轉MIG:GFP質粒轉化子熒光顯微檢測結果圖，其中，圖5 (a)為熒光下；圖5(b)為白光下；圖5(c)為合成光下。
【具體實施方式】
[0057]下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0058]I實驗方法:
[0059]1.1遺傳轉化載體的構建:將來源于玉米黑粉菌MIG2-5啟動子構建到以抗草胺磷基因bar為篩選標記,綠色突光蛋白GFP為標記基因，TtrpC為終止子的遺傳轉化載體上，構建MIG =GFP轉化載體。
[0060]1.2球孢白僵菌原生質體的制備及轉化
[0061]原生質體的獲得
[0062](I)將培養好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；
[0063](2)滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中；
[0064](3)在EP管中加入4mL的LB液體培養基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
[0065](4) 28 O 下 100r/min 培養 20_25min ；
[0066](5)將小管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；
[0067](6)用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；
[0068](7)28°C下100r/min培養Ih左右，并鏡檢觀察，此時視野中應得到透明圓球狀的原生質體。
[0069]PEG介導的遺傳轉化體系建立
[0070](I)將得到的原生質體懸液吸取400 μ L到三個新的EP管中，做好標記，分別為CK對照和MIG =GFP質粒；
[0071](2)對應管中分別加入10 μ LMIG:GFP質粒(MIG:GFP質粒濃度56.4ug/ μ L)冰浴20min ；
[0072](3)每個管中各加入100 μ L PEG4000溶液，混勻，冰浴20min ；
[0073](4)各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ；
[0074](5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；
[0075](6)吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標記，于28°C恒溫箱培養24h ；
[0076](7)將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復吸打。吸出100 μ L均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養基上，于28°C恒溫箱培養并觀察。
[0077]平均轉化效率分析
[0078](I)對MIG:GFP載體進行球孢白僵菌原生質體遺傳轉化，每個載體轉化5個平板；
[0079](2)轉化后對每個轉化平板進行轉化子數量的統計，取平均值，進行統計分析；
[0080]1.3轉化子的PCR檢測及熒光觀察
[0081](I)利用滅菌環將查氏培養基上的轉化子小心挑出，在提前準備的PDA平板上畫多個“Z”字，分別標記為轉MIG =GFP和CK。
[0082](2)將劃好的平板置于26°C恒溫培養箱恒溫培養3d。
[0083](3)此時得到轉化子第一代，繼續挑出孢子劃線在新的PDA培養基上，培養3d得到第二代孢子；
[0084](4)同上述過程，得到第三代轉化子孢子，在超凈工作臺中挑出，置于SDY培養基中搖2-3d。
[0085]PCR檢測:利用氯化芐法提取球孢白僵菌轉化子基因組DNA，然后利用基因組做模版，利用GFP基因特異性引物，進行PCR及電泳檢測。
[0086]熒光觀察:菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養基中搖三天，將實驗控制在相同的培養條件及時間，在培養第48h置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
[0087]2研究結果:
[0088]2.1載體MIG =GFP構建如圖1所示。
[0089]2.2轉化子的獲得及轉化效率評價
[0090](I)獲得的原生質體再生率達70%以上。
[0091](2)轉化子的獲得
[0092]利用PEG法將制得的hsp70_F質粒轉入原生質體后均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養基上，恒溫培養后結果如圖所示。圖3a為轉入MIG:GFP質粒的球孢白僵菌培養基，相比于圖3b的對照組，圖3a可看到明顯的球孢白僵菌菌落，證明原生質體轉化得到陽性轉化子。
[0093](3)轉化效率分析
[0094]每個轉化后原生質體懸液均勻涂在5個查氏培養基上，篩選培養3-4d后，MIG =GFP的轉化子個數平均值分別為21個/ μ gDNA。
[0095]2.3PCR檢測及熒光觀察
[0096](I) PCR 檢測
[0097]對經過三代繼代培養后的轉化子，提取總DNA后，利用MIG2-5特異性引物進行PCR檢測。由圖4可知，轉化子的PCR條帶大小與MIG2-5基因大小相符。
[0098](2)熒光觀察
[0099]菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養基中搖三天，得到的菌絲體由于有GFP熒光基因的表達，所以得到的白僵菌菌絲及孢子中均有熒光出現，具體如圖5所示。
[0100]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，本發明的保護范圍不限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)MIG:GFP質粒載體的構建 利用特異引物以質粒MIG = CAR為模板擴增得MIG2-5全序列，克隆到pUCm-T載體上，形成pUC-MIG，并測序驗證；然后用XbaI和NcoI雙酶切pUC_MIG和PF質粒，回收MIG片段，克隆到用相同酶切的PF載體上，形成MIG =GFP載體； 2)球孢白僵菌DNA提取 10mg菌粉液氮研磨成粉末； 置于預先加入600 μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ； 加入100 μ LlO% SDS’充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴lh，不用顛倒； 加入100μ L3MNaAc，4°C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ；吸取上清液轉入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min 離心 1min ； 取上清加入RNA酶，65°C水浴30min ； 加入體積比為25:24:1的水飽和酹/氯仿/Tris飽和酹抽提，12000r/min離心1min ；取上清，加入2倍體積的冰預冷無水乙醇，-20°C冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ； 棄上清，留沉淀，以50-100 μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min，洗滌1_2次； 干燥后，加入50 μ LTE溶解DNA，保存于_20°C備用； 3)球孢白僵菌原生質體的制備 將培養好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體； 滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中； 在EP管中加入4mL的LB液體培養基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
28°C 下 100r/min 培養 20_25min ； 將EP管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次； 用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩； 28°C下lOOr/min培養lh，并鏡檢觀察，此時視野中應得到透明圓球狀的原生質體； 4)PEG介導的遺傳轉化 將得到的原生質體懸液吸取400 μ L到2個新的EP管中，做好標記，分別為CK對照MIG:GFP ； 對應管中分別加入10 μ LMIG:GFP質粒，冰浴20min ； 每個管中各加入100 μ LPEG4000溶液，混勻，冰浴20min ； 各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ； 加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋； 吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標記，于28°C恒溫箱培養24h ；將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復吸打；吸出100 μ L均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養基上，于28°C恒溫箱培養并觀察； 5)PCR檢測 首先利用氯化芐法提取白僵菌基因組DNA ； (1)10mg菌粉液氮研磨成粉末； (2)置于預先加入600μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ； (3)加入100μ LlO % SDS’充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴Ih,不用顛倒； (4)加入100μ L3MNaAc，4°C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ； (5)吸取上清液轉入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酌.抽提，12000r/min 離心 1min ； (6)取上清加入RNA酶，65°C水浴30min； (7)加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心1min ； (8)取上清，加入2倍體積的冰預冷無水乙醇，-20°C冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ； (9)棄上清，留沉淀，以50-100μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min，洗滌1-2 次； (10)干燥后，加入50μLTE溶解DNA，保存于-2(rC備用； 利用基因組DNA做模版，以MIG2-5特異性引物進行PCR及電泳檢測； 6)轉化子熒光觀察 將轉化子在PDA平板上劃線26°C培養3天，掛下菌絲及孢子置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
2.根據權利要求1所述的利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法，其特征在于，步驟2)和步驟4)中所述提取液為1% SDS、0.5MNaCl、0.2MTris_Hcl、0.01MEDTA、ph = 8.0。
【文檔編號】C12N15/80GK104131027SQ201410353302
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】李啟云, 徐文靜, 路楊, 張佳詩, 張正坤, 鄭巖, 隋麗, 杜茜, 任金平, 田志來 申請人:吉林省農業科學院