一個高產藥用天然產物的硬紫草轉LeMYB1基因毛狀根株系的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一個能高產紫草藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉LeMYB1基因毛狀根株系。該株系通過構建一個受茉莉酸甲酯高效誘導表達的關鍵轉錄因子基因LeMYB1的植物過表達載體，然后將該載體轉入發根農桿菌ATCC15834后，侵染硬紫草的無菌苗而獲得。該株系易于繁殖、生長迅速，所產紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無菌苗所獲得的毛狀根株系的2.88倍。本發明不僅可有效解決我國硬紫草資源的日益短缺、人工栽培周期長、受氣候及地理條件制約等問題，并且可高效大量生產硬紫草藥用天然產物。該高產株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產硬紫草藥用天然產物提供材料支撐，具有廣闊的開發應用前景。
【專利說明】一個高產藥用天然產物的硬紫草轉LeMYBI基因毛狀根株系
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物生物【技術領域】，涉及將攜帶編碼轉錄因子基因的植物表達載體轉入發根農桿菌，然后再侵染硬紫草無菌苗而誘導出高產藥用天然產物的轉基因毛狀根株系O
【背景技術】
[0002]紫草屬紫草科多年生藥用草本植物，主要包括新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.) > 內蒙紫草(Arnebia guttata Bunge.)、硬紫草(Lithospermumerythrorhizon Sieb.et Zucc)和漠紫草(Onosma paniculatum Bur.et Franch)等。其根系可產生紫草寧及其衍生物等藥用天然產物活性成分，具有抗免疫缺血、抗腫瘤，治療風濕性關節炎、多硬化癥、艾滋病、過敏性紫癜、銀屑病以及保肝護肝、降血糖、降血粘度、降壓、解熱、鎮痛止痛等功效[1_4]。另外，紫草的多糖成分能增強機體特異性和非特異性免疫能力；紫草油具有治療燒傷、燙傷、急慢性膿耳、口腔潰瘍、褥瘡、痔瘡、急慢性濕疹以及促進傷口愈合等功效[5_7]。紫草色素的抗真菌作用還可作為生物毒素用于番茄葉霉病的防治[8’9]。此外，紫草素還可作為天然色素，被聯合國食品添加劑法典委員會列入食品、化妝品、藥品添加劑范圍，廣泛用于化妝品、防曬制品(如塑料制品)、食品、藥品等著色以及印染、洗滌劑的添加劑等，被國際譽為紅色素之王[1°_12]。因此，紫草已逐漸成為醫療、食品色素和化妝品及防病治病開發新藥研究的熱點。
[0003]隨著現代生物技術的發展，采用細胞培養工程技術生產并提高人類所需的紫草寧及其衍生物，成為一種非常重要的生物技術手段。上世紀70年代，日本即已成功運用兩階段培養體系，即在光照條件下B5固體培養基上繁殖紫草細胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產培養基中培養紫草細胞進行工業化生產紫草寧[13]。然而在植物細胞培養過程中普遍存在細胞系不穩定，細胞生長緩慢，不耐剪切及代謝物產量低等問題，成為其實現規模化生產的瓶頸。
[0004]毛狀根體系的建立可為大量生產天然活性物質提供有效的手段。發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是屬于根瘤菌科農桿菌屬革蘭氏陰性菌,能侵染絕大多數雙子葉植物和少數單子葉植物，誘發被侵染植物受傷部位產生毛狀根。發根農桿菌之所以具有這種致根特性是由于它具有能誘導毛狀根產生的Ri質粒，Ri質粒是發根農桿菌染色體外的一個大質粒，帶有冠癭堿合成基因和生長素合成基因。毛狀根培養是較細胞培養產生天然產物更優越的實驗材料M。此外，由于發根農桿菌攜帶的Ri質粒能將外源基因整合到寄主染色體、其誘導產生的毛狀根易獲得再生植株等優點，因此，建立特定植物的轉基因毛狀根體系，提高毛狀根中次生代謝物的產量，在定向植物分子育種方面具有廣泛應用前景。近年來利用發根農桿菌已成功轉化多種藥用植物并建立了毛狀根轉基因體系，極大地方便了藥用天然產物得生產及遺傳育種研究。
[0005]茉莉酸是一種能調控植物生長發育、抗逆境、創傷脅迫反應及植物次生代謝合成等多個生理過程的激素。茉莉酸類物質能誘導植物細胞生產更多的次生代謝產物，如茉莉酸可誘導植物產生尼古丁、芥子油苷、苜蓿堿、異類黃酮等生物堿和酚酸類次生代謝產物。紫草寧同樣受到茉莉酸及其甲酯類衍生物的高效誘導合成[15_17]。在茉莉酸類物質調節植物次生代謝產物合成中的過程中，轉錄因子起到相當重要的作用。
[0006]在本實驗室室前期研究外源茉莉酸甲酯(MeJA)誘導紫草寧合成的功能蛋白質組學過程中，我們發現了一個受到外源MeJA誘導表達的R2R3類MYB轉錄因子蛋白，結合其他植物中已有的對R2R3類MYB轉錄因子的研究結果_，推測其很可能參與介導了 MeJA促進紫草寧及衍生物合成的生物學過程。
[0007]紫草的LeMYBl是本實驗室克隆的一個編碼R2R3類MYB轉錄因子蛋白基因[19]。紫草細胞從B5轉入M9中后，LeMYBl受誘導表達，且受到MeJA的高效調控；而且該基因在紫草根部(紫草寧合成的特異性部位)高表達，推測該基因參與茉莉酸介導的對紫草寧的合成調控[19]。
[0008]通過轉基因技術將紫草本身的LeMYBl基因轉入紫草中過表達，提高紫草毛狀根中紫草寧的含量，從中篩選出高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系，在理論上是完全可行的。
[0009]通過轉基因技術獲得高產藥用天然產物的紫草毛狀根株系，不僅在系統研究紫草藥用天然產物生物合成途徑及其分子調控機制方面具有重要的理論意義，并在商業化生產紫草藥用天然產物方面具有非常重要的應用前景和價值。盡管目前國內外有利用毛狀根為材料對紫草寧合成調控進行的相關研究，但并無將紫草R2R3類MYB蛋白的相關基因轉入發根農桿菌，誘導出能高效合成紫草藥用天然產物的紫草轉基因毛狀根并藉此提高紫草寧合成的相關報道。
【發明內容】
[0010]本發明需要解決的問題是通過轉基因技術獲得一個高產藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉基因毛狀根株系，主要是通過將所選擇的LeMYBl基因構建植物過表達載體并轉入發根農桿菌ATCC15834，然后侵染硬紫草無菌苗，誘導出含目的基因的硬紫草轉基因毛狀根，對獲得的轉基因毛狀根擴大培養并進行分子鑒定和藥用天然產物含量測定。
[0011]本發明的技術方案包括如下步驟:
[0012](I)將硬紫草種子表面清洗干凈，低溫浸泡在自來水中兩天，期間換水2-3次，然后用濕砂和種子混勻后放入4°C冰箱層積處理約I個月左右，種子出芽后，用自來水沖洗掉沙子，用0.1 %升汞消毒發芽的種子5分鐘，然后用無菌水沖洗5-7次，將水吸干后接種在1/2MS無激素的固體培養基上于25°C，16小時光照8小時黑暗培養2周。待幼苗長至2_4cm高度并伸展出第2-3對真葉時用作被侵染材料。
[0013](2)轉基因侵染菌液制備:高保真酶擴增目的基因LMYB1，將獲得的目的片段與真核表達載體pBI121-eGFP連接，將連接產物用凍融法轉化發根農桿菌ATCC15834感受態細胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養基擴增至0D600 = 0.8時，添加乙酰丁香酮(AS)，作為轉基因侵染菌液。
[0014](3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根:用無菌針浸蘸上述活化的具有侵染特性的菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對真葉的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖節處一下，共穿刺2-3次。然后將侵染的幼苗轉移到MS固體培養基上于25°C弱散射光培養培養。針刺一周左右即可發現侵染部位出現白色突起，隨后在侵染部位的白色突起首先變成絨毛狀，然后長出一條或多條白色的毛狀根。將誘發的毛狀根從侵染點部位剪切下來，培養在含有頭孢霉素500mg/L的B5培養基上，每周轉接一次，直至徹底除菌后，移到不含抗生素的B5培養基上擴大培養。
[0015](4)硬紫草轉基因毛狀根的液體培養基培養:將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基擴大培養。
[0016](5)轉基因毛狀根分子鑒定:提取野生型和轉基因毛狀根材料的DNA，運用PCR方法同時檢測農桿菌Ri質粒中RolC基因和35S-LeMYBl-GFP融合基因，判斷硬紫草轉基因毛狀根是否為真正的轉基因株系。
[0017](6)紫草寧合成及測定:將鑒定的轉基因紫草毛狀根經B5液體生長培養基培養15天后轉入M9生產紫草寧液體培養基，置于26°C黑暗條件下搖動培養，一周后紫草寧含量即可達到很高濃度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧及其衍生物，紫外分光光度計測定含量，以野生型紫草毛狀根(只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根)為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0018]本發明與現有技術相比，其有益效果是:
[0019]如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧及其衍生物的培養體系，已經成為紫草寧藥用研究及商業化應用的一個制約因素。至今未見通過誘導出轉入LeMYBl基因的毛狀根，藉此提高紫草寧及其衍生物產量的相關文獻報道。本發明首次將一個紫草R2R3類MYB家族蛋白的關鍵轉錄因子基因LeMYBl轉入植物表達載體，將該載體轉入發根農桿菌后再轉入紫草無菌苗，誘導出紫草轉基因毛狀根；獲得的硬紫草轉基因毛狀根中紫草寧含量較野生型紫草毛狀根顯著提高。該方法可克服紫草愈傷細胞誘導、培養困難，細胞易于老化褐化、紫草寧產量不高、產量不穩定、夏季難產或不產紫草寧等諸多問題；解決了利用愈傷細胞進行遺傳轉化存在的技術難度高、周期長、轉化效率偏低等問題，轉基因毛狀根誘導和繁殖不受外界環境、季節等因素制約，大大提高了紫草轉基因效率；轉入的LeMYBl基因有助于紫草藥用天然產物合成的分子調控機制研究，對紫草功能基因鑒定和研究及植物分子育種具有重要指導意義，對其他轉基因困難的木本植物提供了可靠的借鑒方法；獲得的紫草寧高產轉基因毛狀根株系具有廣闊的開發應用前景和商業價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1針刺莖節法誘導出的轉LeMYBl基因的硬紫草毛狀根
[0021]圖2轉LeMYBl基因毛狀根在B5固體培養基中培養
[0022]圖3轉LeMYBl基因毛狀根在B5液體培養基中擴大培養
[0023]圖4轉LeMYBl基因毛狀根RolC基因、35S_LeMYBl-GFP-R融合基因的檢測
[0024]圖5轉LeMYBl基因毛狀根在M9液體培養基中培養時大量產生藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)
[0025]圖6轉LeMYBl基因毛狀根與野生型毛狀根中紫草寧及其衍生物含量的測定及比較
【具體實施方式】
[0026]實施例1、硬紫草轉LeMYBl基因毛狀根的誘導
[0027](I)硬紫草無菌苗培養:選取飽滿的硬紫草種子，無菌水清洗后置于4°C環境中黑暗培養1-2個月，直至種子發芽；挑取剛發芽的種子，清水洗干凈；用0.1 %的升汞消毒5min，再用無菌水清洗5-7次；置于MS基本培養基，26°C _28°C光照培養，獲得一定數量的紫草無菌苗。一個月后，當紫草無菌苗長出兩片真葉后，作為誘導毛狀根的外植體。
[0028](2)過表達載體構建及轉基因侵染菌液制備:根據本實驗室已克隆的紫草LeMYBl序列(Genbank Access1n N0.KC818628)設計引物 LeMYBl-OM-F:5' -GACTCTAGAATGGTGAGAGCACCATGTTGTG-3 ' ；LeMYB1-OM-R:5 ' -GGTGGATCCCGGGCCCGCTACTGATTTTCCAGC-3 ',高保真酶擴增目的片段；將獲得的目的片段切膠回收，并與pBI121-eGFP載體連接，構建PB 1121 -LeMYB 1-eGFP質粒；將pB 1121 -LeMYB I _eGFP質粒用凍融法轉化發根農桿菌ATCC15834感受態細胞；挑取陽性克隆，轉入YEB液體培養基，在26_28°C，10rpm的搖床中擴增至0D600 = 0.8時，添加100 μ M的AS，作為轉基因侵染菌液。
[0029](3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根:用接種針蘸上述活化的具有侵染特性的轉基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節處一下，每株共穿刺2-3次；將侵染的無菌苗轉移到MS固體培養基上于26°C黑暗培養。一周左右即可發現侵染部位出現白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然后長出一條或多條毛狀根(圖1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法，誘導出紫草野生型毛狀根 ，作為對照材料。
[0030]實施例2、硬紫草轉LeMYBl基因毛狀根的培養
[0031](I)毛狀根除菌培養:誘導出來的毛狀根經過一星期的生長，剪取長度約Icm的毛狀根，轉入B5+500mg/L頭孢霉素的固體培養基除菌，再過一星期轉入B5+250mg/L頭孢霉素，直至除去殘留的發根農桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基擴大培養(圖2)；
[0032](2)毛狀根液體培養基擴大培養:將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基，10rpm的搖床中光照擴大培養(圖3)。
[0033]實施例3、硬紫草轉LeMYBl基因毛狀根的分子鑒定
[0034]取一定數量毛狀根，提取毛狀根DNA，設計檢測RolC與35S-LeMYB1-eGFP融合基因的引物分別為 RolC-F:5’ -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3’ ；RolC-R:5’ -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3’，35S-F-50:5/ -CACTATCCTTCGCAAGACCCT-3' ；GFP-R-100:5' -GCTGAACTTGTGGCCGTTT-3'，用PCR方法擴增，擴增產物測序比對，檢測毛狀根中農桿菌Ri質粒中RolC基因存在與否，野生型和轉LeMYBl基因毛狀根均檢測到RolC基因的存在，說明獲得的均為毛狀根；但35S-LeMYBl-GFP-R融合基因只在轉LeMYBl基因毛狀根中檢測到(圖4)，表明其確實為轉LeMYBl基因的毛狀根。
[0035]實施例4、硬紫草轉LeMYBl基因毛狀根紫草寧含量測定
[0036](I)將硬紫草轉LeMYBl基因毛狀根及野生型毛狀根轉入M9液體培養基，置于260CUOOrpm的搖床中黑暗培養，一周后紫草寧含量即可達到很高濃度(圖5);
[0037](2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧及其衍生物的M9液體，紫外分光光度計測定含量，以野生型紫草毛狀根為對照，計算轉LeMYBl基因毛狀根中紫草寧含量(圖6)。紫草寧含量總量包括紫草細胞或毛狀根和分泌到M9培養基中的紫草寧及其衍生物含量總和。具體方法如下:稱取在M9培養體系中的毛狀根，并取含有分泌的紫草寧及其衍生物的M9培養基，用石油醚浸泡，反復提取，直到提取液無色，合并提取液，紫外分光光度計測定0D520的吸光值，由下列方程得到紫草寧及其衍生物含量:含量(mg/gFW)=41.66X0D520X 稀釋倍數。
[0038](3)紫草寧及其衍生物含量測定顯示，所得到的這一個轉LeMYBl基因的硬紫草毛狀根(0M3)中紫草寧含量比野生型毛狀根中的含量提高2.88倍，而且該株系具有生長速度快、繁殖容易的特點，適于商業化生產所用，命名為LeMYB 1-0M3。
[0039]參考文獻
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【權利要求】
1.一個高產藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉LeMYBl基因毛狀根株系。
2.權利要求1中所 述的硬紫草轉基因高產株系的商業化應用。
【文檔編號】C12N15/82GK104178510SQ201410366272
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】戚金亮, 楊永華, 趙胡, 方榮俊, 趙華, 韓秋敏, 朱煜, 吳鳳瑤, 張東霞, 葛素囡, 王小明, 陸桂華, 楊榮武 申請人:南京大學