一種從阿膠中提取dna的方法
【專利摘要】本發明提供了一種從阿膠中提取DNA的方法，由于阿膠本身屬于蛋白質成分高，且粘性大的物質，使DNA提取不易，而且阿膠在制作過程中，原料經反復熬煮，致使DNA部分遭到破壞，更增加了阿膠DNA提取的難度，本發明方法規定了蛋白酶K作用的最佳時間、最佳用量，使用十二烷基硫酸鈉消化，平衡酚、氯仿、異戊醇抽提，使用96％乙醇與乙酸鉀析出DNA，最后用乙醇洗滌、干燥，采用該方法可成功提取高質量的阿膠DNA，可應用于阿膠分子鑒定，該方法簡單、經濟、易于操作。
【專利說明】—種從阿膠中提取DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種DNA提取方法，特別涉及一種從阿膠中提取DNA的方法。
【背景技術】
[0002]阿膠是脊索動物門哺乳綱馬科動物驢的皮，經煎煮、濃縮制成的固體膠塊，味甘平，入肺、肝、腎經，具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，已有2000多年的歷史。由于阿膠功效獨特，供不應求，各地均出現其他動物皮熬制的代用品，給醫藥市場帶來了混亂。為了鑒別市場所售的阿膠成分，目前較前沿的鑒別方法是分子鑒定，即將阿膠的DNA提取出來，用分子學手段檢測所提取DNA的動物來源，以此確定阿膠的真偽。但由于阿膠本身屬于蛋白質成分高，且粘性大的物質，使DNA提取不易，而且阿膠在制作過程中，原料經反復熬煮，致使DNA部分遭到破壞，更增加了阿膠DNA提取的難度。
[0003]目前從阿膠中提取DNA的方法主要依據為行標SDS法(中華人民共和國農業行業標準NY/T 674-2009)，經實驗，該DNA提取方法對阿膠樣品中DNA的提取率非常低，往往在抽提蛋白時，將DNA —起帶走，導致提取DNA的結果不佳，不能夠進行后續的實驗工作。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種經濟、便捷、易行的從阿膠中提取DNA的方法。
[0005]為達到上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0006]一種從阿膠中提取DNA的方法，包括以下步驟:
[0007]I)向200mg粉碎后的阿膠中加入0.9~1.1mL SDS提取/裂解緩沖液并攪拌均勻得混合液A,向混合液A中加入95~105mg/mL的蛋白酶K水溶液后混合均勻得混合液B,加入的蛋白酶K水溶液與SDS提取/裂解緩沖液的體積比為0.9~1.1:20 ;將混合液B于67.5~68.5°C溫浴1.4~1.6h得混合液C ；
[0008]2)向混合液C中加入0.9~1.1倍混合液C體積的平衡酚后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液Al ;向料液Al中加入0.9~1.1倍料液Al體積的平衡酚后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液A2 ；
[0009]3)向料液A2中加入0.9~1.1倍料液A2體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液BI ；向料液BI中加入0.9~1.1倍料液BI體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液B2 ；向料液B2中加入0.9~1.1倍料液B2體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液B3，溶劑A為平衡酚與氯仿的混合物，溶劑A中平衡酚:氯仿的體積比為25:24 ；
[0010]4)向料液B3中加入0.9~1.1倍料液B3體積的溶劑B后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液Cl，溶劑B為氯仿與異戊醇的混合物，溶劑B中氯仿:異戊醇的體積比為24:1 ；
[0011]5)利用乙醇沉淀法處理料液Cl，使料液Cl中的DNA沉淀，然后依次經過分離、洗滌以及干燥獲得DNA。
[0012]所述步驟2)至步驟4)中，離心的條件為:10000g以及4°C下離心10~15min。
[0013]所述步驟5)具體包括以下步驟:
[0014]a)將料液C1、0.09~0.11倍料液Cl體積的5mol/L乙酸鉀水溶液和1.9~2.1倍料液Cl體積的質量分數為96%的乙醇水溶液混合，然后于-19~-21°c靜置過夜，然后離心，傾倒離心得到的上清，得沉淀A ;
[0015]b)用499-501 μ L質量分數為70%的乙醇水溶液洗滌沉淀Α，然后離心，傾倒離心得到的上清，得沉淀B;
[0016]c)將沉淀B于22~27°C干燥I~2h，然后用99~101 μ L無菌去離子水溶解，溶解后于4°C保存備用。
[0017]所述步驟a)中，離心的條件為:1000g以及4°C下離心10~15min。
[0018]所述步驟b)中，離心的條件為:12000g以及4°C下離心10~15min。
[0019]本發明的有益效果體現在:
[0020]本發明規定了最適阿膠的酶解時間及酶的用量等酶解條件，既保證了酶解的效果又合理的節約了時間，不造成經濟浪費；在提取過程中，通過改進平衡酚、平衡酚-氯仿、氯仿-異戊醇等溶劑的使用順序，控制使用酚類有機溶劑對樣品的洗脫次數，使得蛋白類雜質除去干凈，而又不使溶劑本身給系統中帶來新的雜質，既使阿膠中DNA最大限度的被提取出來，又不增加本身體系中酚類等小分子雜質的含量；利用本發明所述方法可提取得到阿膠中所含有的DNA，提取得到的DNA總量大、純度高，可以滿足中藥材分子鑒定對于DNA樣品的高質量要求，且方法簡單、經濟、易于操作，提高了阿膠分子學鑒定的可靠性和效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021 ] 圖1為阿膠中DNA凝膠電泳圖，其中，I為Marker ;a’、b ’為使用行標SDS法所提取得到的阿膠DNA ;a、b為使用本發明所建立的DNA提取方法所提取得到的阿膠DNA，圖右側數字表示Marker的片段大小,單位為bp。
[0022]圖2為PCR凝膠電泳圖，其中，1、2、3為使用本發明方法提取的DNA進行PCR反應后的電泳結果，I’、2’、3’為使用行標SDS法所提取的DNA進行PCR反應后的電泳結果，右邊三列為Marker,圖右側數字表示Marker的片段大小,單位為bp。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步說明。
[0024]實施例1
[0025]I)將市售的阿膠(東阿阿膠)粉碎，稱取200mg，放入2mL的離心管中，向離心管中加入100yL SDS提取/裂解緩沖液(即十二烷基硫酸鈉提取/裂解緩沖液，中華人民共和國農業行業標準NY/T 674-2009)，用長槍尖攪拌使阿膠溶解，然后向離心管中加入50 μ L100mg/mL的蛋白酶K(購于上海雅心生物技術有限公司)水溶液，攪拌均勻后放置于循環水浴鍋上并于68°C溫浴1.5h。
[0026]2)經過步驟I)后，向離心管中加入I倍體積的平衡酚(天津市河東區紅巖試劑廠)，輕緩顛倒混勻后于10000g、4°C離心10min，轉移上層水相至一新的離心管中，重復一次。
[0027]3)經過步驟2)后，在體系中加入I倍體積的平衡酚-氯仿(平衡酚:氯仿的體積比為25:24)，輕緩顛倒混勻，10000g、4°C離心10min，轉移上層水相至一新的離心管中，重復2次。
[0028]4)經過步驟3)后，在體系中加入I倍體積的氯仿-異戊醇(氯仿:異戊醇的體積比為24:1)，輕緩顛倒混勻后于10000g、4°C離心10min，此時界面清潔，轉移上層水相至一新的離心管中。
[0029]5)經過步驟4)后,在體系中加入0.1倍體積的5mol/L乙酸鉀水溶液和2倍體積的質量分數96%的乙醇水溶液，充分混合后_20°C過夜，然后于10000g、4°C離心15min，傾倒上清，得沉淀。加入500 μ L質量分數70%的乙醇水溶液洗滌沉淀，然后于12000g、4°C離心15min后傾倒上清。沉淀室溫(25°C )下自然干燥1.5h，加入100 μ L滅菌去離子水溶解沉淀，于4°C保存備用。
[0030]參見圖1，可以看出本發明提取得到的DNA條帶清晰，比行標SDS法提取的DNA亮度高，說明使用本發明方法所提取的DNA濃度要高于行標SDS法。
[0031]參見圖2，以本發明提取的阿膠DNA為模板，加入上下游引物進行PCR反應，DNA大小為482bp，從圖2中可以看到，1、2、3處可以清晰看到三條條帶，而I’、2’、3’處則模糊不清，說明使用本發明提出的方法可以獲得高純度的阿膠DNA。
[0032]實施例2
[0033]阿膠(福膠)提取步驟與結果與實施例1相同。
[0034]實施例3
[0035]阿膠(同仁堂)提取步驟與結果與實施例1相同。
【權利要求】
1.一種從阿膠中提取DNA的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)向200mg粉碎后的阿膠中加入0.9~1.1mL SDS提取/裂解緩沖液并攪拌均勻得混合液A,向混合液A中加入95~105mg/mL的蛋白酶K水溶液后混合均勻得混合液B,加入的蛋白酶K水溶液與SDS提取/裂解緩沖液的體積比為0.9~1.1:20 ;將混合液B于67.5~68.5°C溫浴1.4~1.6h得混合液C ； 2)向混合液C中加入0.9~1.1倍混合液C體積的平衡酚后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液Al ;向料液Al中加入0.9~1.1倍料液Al體積的平衡酚后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液A2 ； 3)向料液A2中加入0.9~1.1倍料液A2體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液BI ；向料液BI中加入0.9~1.1倍料液BI體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液B2 ；向料液B2中加入0.9~1.1倍料液B2體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液B3，溶劑A為平衡酚與氯仿的混合物，溶劑A中平衡酚:氯仿的體積比為25:24 ； 4)向料液B3中加入0.9~1.1倍料液B3體積的溶劑B后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液Cl，溶劑B為氯仿與異戊醇的混合物，溶劑B中氯仿:異戊醇的體積比為24:1 ； 5)利用乙醇沉淀法處理料液Cl，使料液Cl中的DNA沉淀，然后依次經過分離、洗滌以及干燥獲得DNA。
2.根據權利要求1所述一種從阿膠中提取DNA的方法，其特征在于:所述步驟2)至步驟4)中，離心的條件為:1000g以及4°C下離心10~15min。
3.根據權利要求1所述一種從阿膠中提取DNA的方法，其特征在于:所述步驟5)具體包括以下步驟: a)將料液C1、0.09~0.11倍料液Cl體積的5mol/L乙酸鉀水溶液和1.9~2.1倍料液Cl體積的質量分數為96%的乙醇水溶液混合，然后于-19~-21 °C靜置過夜，然后離心，傾倒離心得到的上清，得沉淀A ； b)用499-501μ L質量分數為70%的乙醇水溶液洗滌沉淀Α，然后離心，傾倒離心得到的上清，得沉淀B; c)將沉淀B于22~27°C干燥I~2h。
4.根據權利要求3所述一種從阿膠中提取DNA的方法，其特征在于:所述步驟a)中，離心的條件為:1000g以及4°C下離心10~15min。
5.根據權利要求3所述一種從阿膠中提取DNA的方法，其特征在于:所述步驟b)中，離心的條件為:12000g以及4°C下離心10~15min。
6.根據權利要求1所述一種從阿膠中提取DNA的方法，其特征在于:該方法具體包括以下步驟: 1)向200mg粉碎后的阿膠中加入ImLSDS提取/裂解緩沖液并攪拌均勻得混合液A，向混合液A中加入100mg/mL的蛋白酶K水溶液后混合均勻得混合液B，加入的蛋白酶K水溶液與SDS提取/裂解緩沖液的體積比為1:20 ;將混合液B于68°C溫浴1.5h得混合液C ； 2)向混合液C中加入I倍混合液C體積的平衡酚后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液Al ;向料液Al中加入I倍料液Al體積的平衡酚后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液A2 ； 3)向料液A2中加入I倍料液A2體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液BI ；向料液BI中加入I倍料液BI體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液B2 ；向料液B2中加入I倍料液B2體積的溶劑A后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液B3，溶劑A為平衡酚與氯仿的混合物，溶劑A中平衡酚:氯仿的體積比為25:24 ； 4)向料液B3中加入I倍料液B3體積的溶劑B后顛倒混勻，然后離心，收集離心得到的上層水相得料液Cl，溶劑B為氯仿與異戊醇的混合物，溶劑B中氯仿:異戊醇的體積比為24:1 ； 5)利用乙醇沉淀法處理料液Cl，使料液Cl中的DNA沉淀，然后依次經過分離、洗滌以及干燥獲得DNA。
【文檔編號】C12N15/10GK104164422SQ201410404725
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】陳志宣, 龔國利 申請人:陜西科技大學