衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通過使用該核酸各自制備的表達載體、轉化細胞和丙型...的制作方法

衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通過使用該核酸各自制備的表達載體、轉化細胞和丙型 ...的制作方法
【專利摘要】本發明提供了包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區、NS3蛋白質編碼區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區、NS5B蛋白質編碼區和3'非翻譯區的核酸，其中所述核酸在NS3蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區或NS5B蛋白質編碼區中具有引起選自下述的一個或多個氨基酸置換的核苷酸置換：M（1205）K、F（1548）L、C（1615）W、T（1652）N、A（2196）T、A（2218）S、H（2223）Q、Q（2281）R、K（2520）N和G（2374）S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQIDNO：6中所示的氨基酸序列定義的。
【專利說明】衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通過使用該核酸各自制備 的表達載體、轉化細胞和丙型肝炎病毒顆粒
[0001] 本申請是國際申請日為2009年12月25日、國際申請號為PCT/JP2009/071644、 進入國家階段的申請號為200980157561. X、發明名稱為"衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及 通過使用該核酸各自制備的表達載體、轉化細胞和丙型肝炎病毒顆粒"的PCT申請的分案申 請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及丙型肝炎病毒衍生的核酸以及使用該核酸制備的表達載體、轉化細胞 和丙型肝炎病毒（HCV)顆粒。

【背景技術】
[0003] 使得有效病毒擴增成為可能的實驗系統是病毒研究以及抗病毒藥物研究和開發 所必需的。此外，如果存在使用培養細胞用于擴增病毒的系統或使用培養細胞用于評估病 毒生長的系統，那么病毒研究以及關于抗病毒藥物的研究和開發將得到極大進步。
[0004] 丙型肝炎病毒(在下文中，稱為HCV)屬于黃病毒（Flaviviridae)科，包括單鏈 (+)有義RNA作為其基因組，并且已知其引起丙型肝炎。近期研究已揭示丙型肝炎病毒依 賴于基因型或血清型分類為許多類型。根據使用HCV毒株核苷酸序列的Simmonds等人的 系統發育分析法，HCV分類為6個基因型，并且基因型進一步分類為幾個亞型（Simmonds， P.等人，H印atology，1994,10:1321-1324)。多種HCV基因型的全長基因組的核苷酸序列 目前已得到確定（Choo 等人，Science，1989, 244 :359-362 ;Kato 等人，J. Med. Virol·， 2001,64:334-339 ;0kamoto，H 等人，J. Gen Virol.，1992,73 :673-679 ;和 Yoshioka 等人， Hepatology,1992,16 ：293-299)〇
[0005] 直到最近，用HCV感染培養細胞或HCV基因組在培養細胞中的復制仍是不可能的。 因此，深入HCV復制機制或HCV感染機制之內的研究需要使用黑猩猩作為實驗動物的使用 體內系統的實驗。然而，由基因型Ib的HCV的Conl毒株、N毒株和0毒株以及基因型Ia的 HCV的H77毒株制備亞基因組復制子RNA已使得能夠在使用培養細胞的體外系統中進行關 于深入HCV復制機制之內的研究的實驗（日本專利公開（Kokai)號2001-17187 A ;Lomann 等人，Science，1999,285 :110-113 ;Blight 等人，Science，2000, 290 :1972-1974 ;Friebe 等人，2001,75 :12047-12057 ;和 Ikeda 等人，J. Virol.，2002,76 :2997-3006)。此處，術語 "HCV亞基因組復制子RNA"指包括HCV基因組的一部分的RNA，其不能產生感染性HCV顆粒 但能夠自我復制引入細胞內的HCV基因組衍生的RNA。
[0006] 此外，連同亞基因組復制子RNA，通過其經由體外引入Huh7細胞內產生感染性 HCV顆粒的全基因組復制子RNA已由基因型2a的HCV的JFH-I毒株制備。這已使得能 夠使用培養細胞用體外系統進行實驗，也用于深入HCV感染機制之內的研究（Kato, T等 人，Gastroenterology，2003,125 :1808-1817 ;和 Wakita，T 等人，Nat Med.，2005,11 : 791-796)。此處，術語"HCV全基因組復制子RNA"指包括全長HCV基因組的RNA，其能夠自 我復制引入細胞內的HCV基因組衍生的RNA并且能夠產生感染性HCV顆粒。
[0007] 同時，丙型肝炎目前主要通過用干擾素-α或干擾素-β的單藥劑療法以及用干 擾素-α和病毒唑的組合療法進行治療，所述病毒唑是嘌呤核苷衍生物。然而，已知即使當 執行這些療法時，對于所有治療患者中的僅約60%觀察到療效。還已知如果療法中斷，那 么疾病在有效治療患者中的一半或更多中再次突然爆發。另外，干擾素的療效與HCV基因 型相關，并且從而已知療效對于基因型Ib低但對于基因型2a商（Mori，S.，等人，Biochem. Biophis. Res. Commun., 1992,183:334-342)。
[0008] 為什么干擾素療效取決于HCV基因型而不同的原因仍未得到闡明。認為原因之一 是HCV復制機制或HCV復制效率中存在差異。
[0009] 然而，HCV亞基因組復制子RNA的存在局限于來自基因型IaUb和2a的HCV毒株 的幾個類型。此外，全基因組復制子RNA的存在局限于來自基因型2a的HCV的JFH-I毒 株的一個類型。因此，闡明HCV基因型和HCV復制機制或HCV復制效率之間的關系是困難 的。此外，可以人工制備且用于HCV疫苗的原料的病毒顆粒類型也局限于由全基因組復制 子RNA生成的那些。因此，具有特征性復制機制或復制效率的HCV的其他亞基因組復制子 RNAs或全基因組復制子RNA的發現是期望的。
[0010] 不存在來自相同基因型的HCV或來自就復制機制或復制效率而言具有不同特征 的相同HCV毒株的亞基因組復制子RNAs或全基因組復制子RNAs。因此，HCV復制機制或 HCV復制效率中的差異無法使用具有相同遺傳背景的樣品進行比較。此外，無法鑒定通過新 抗HCV治療劑靶向的HCV復制所需的因子，并且無法篩選能夠不依賴于復制機制或復制效 率發揮有利效應的抗HCV治療劑。


【發明內容】

[0011] 本發明待解決的問題 本發明的目的是提供具有高自我復制能力的新HCV亞基因組復制子RNA和全基因組復 制子RNA。
[0012] 用于解決問題的手段 本發明人已將由HCV基因組制備的亞基因組復制子RNA引入培養細胞內，所述HCV基 因組從暴發性丙型肝炎患者中分離，并且隨后深入研究在已自我復制的亞基因組復制子 RNA中生成的突變。因此，他們已揭示了顯著增加自我復制能力（自主復制能力)的突變。此 夕卜，通過使編碼HCV基因組的結構蛋白質的區域等與具有顯著增加自我復制能力的突變的 HCV亞基因組復制子RNA連接，他們已成功制備了能夠產生感染性HCV顆粒的全基因組復制 子RNA。因此，他們已完成了本發明。
[0013] 具體地，本發明提供了包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區、NS3蛋白質編碼 區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區、NS5B蛋白質編碼區和3' 非翻譯區的核酸，其中所述核酸在NS3蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區或NS5B蛋白質編 碼區中具有引起選自下述的一個或多個氨基酸置換的核苷酸置換：M (1205)K、F (1548)L、 C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N 和 G (2374)S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的。
[0014] 核酸優選具有至少引起NS5A蛋白質編碼區中的氨基酸置換A (2218) S的核苷酸 置換。
[0015] 核酸優選進一步包括丙型肝炎病毒基因組的核心蛋白質編碼區、El蛋白質編碼 區、E2蛋白質編碼區、p7蛋白質編碼區和NS2蛋白質編碼區。
[0016] 在一個優選實施方案中，核酸編碼在序列表中的SEQ ID NO :5或6中所示的氨基 酸序列中具有選自下述的一個或多個氨基酸置換的氨基酸序列：M (1205) K、F (1548) L、 C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N 和 G (2374)S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的。
[0017] 在另一個優選實施方案中，核酸由序列表中的SEQ ID NO : 12或13中所示的核苷 酸序列組成。
[0018] 核酸可以進一步包括標記基因和/或IRES序列。
[0019] 核酸可以是亞基因組復制子RNA。
[0020] 可替代地，核酸可以是全基因組復制子RNA。
[0021] 包括HCV亞基因組序列的核酸用作用于合成HCV亞基因組復制子RNA的模板或直 接用作HCV亞基因組復制子RNA。將HCV亞基因組復制子RNA引入培養細胞內，從而展示出 高于迄今獲得的HCV亞基因組復制子RNA的自我復制能力。因此，包括HCV亞基因組序列 的核酸可以用于篩選抑制HCV復制的抗HCV藥物或用于闡明HCV復制機制的研究。
[0022] 包括HCV全基因組序列的核酸用作用于合成HCV全基因組復制子RNA的模板或直 接用作HCV全基因組復制子RNA。將HCV全基因組復制子RNA引入培養細胞內，從而展示出 高于迄今獲得的HCV全基因組復制子RNA的自我復制能力，并且可以有效產生感染性HCV 顆粒。
[0023] 本發明進一步提供了包括在啟動子下游可操作地連接的核酸的表達載體。
[0024] 本發明可以進一步提供包括核酸的表達載體，所述核酸在啟動子下游可操作地連 接，并且編碼全基因組復制子RNA。
[0025] 本發明還提供了通過引入全基因組復制子RNA或表達載體獲得的轉化細胞，所述 表達載體包括編碼全基因組復制子RNA的核酸。在此類轉化細胞中，優選地，全基因組復制 子RNA是自我復制的。此類轉化細胞可以適當地用于產生丙型肝炎病毒（HCV)顆粒。根據 本發明進一步提供了通過培養轉化細胞獲得的丙型肝炎病毒（HCV)顆粒。本發明還提供了 針對此類丙型肝炎病毒（HCV)顆粒的抗體。
[0026] 本說明書包括日本專利申請號2008-335016的說明書和附圖的公開內容，本申請 要求所述專利的優先權。
[0027] 發明效果 根據本發明，可以提供具有高自我復制能力的HCV亞基因組復制子RNA和HCV全基因 組復制子RNA。此類復制子RNA可以用于篩選抑制HCV復制的抗HCV藥物或用于闡明HCV 復制機制的研究。此外，本發明的HCV全基因組復制子RNA具有高于迄今獲得的HCV全基 因組復制子RNA的HCV顆粒生產能力。因此，可以在體外大量制備感染性HCV顆粒。因而 獲得的HCV顆粒可以用作HCV疫苗或抗原用于制備抗HCV抗體。
[0028]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖IA顯示了 HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的全長基因組結構。圖IB和IC顯示 了用于合成來自JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的HCV亞基因組復制子RNA的載體pSGR-JFH-2. 1 和pSGR-JFH-2. 3的結構。圖ID顯示了來自JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的HCV亞基因組復制 子RNA的結構。
[0029] 圖2顯示了顯示通過來自JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的HCV亞基因組復制子RNA引 入其內的細胞的集落形成的照片。
[0030] 圖3顯示了在突變型復制子中發現的氨基酸突變，這在JFH-2. 3亞基因組復制子 RNA已引入其內的細胞中發生。
[0031] 圖4顯示了在JFH-2. 3亞基因組復制子中發現的氨基酸置換引入其內的突變型 JFH-2.1 HCV亞基因組復制子RNA (圖4A)，和顯示通過用其各自轉化的細胞的集落形成的 照片（圖4B)。
[0032] 圖5顯示了 J6/JFH-2. 1和J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV全基因組復制子RNAs的 結構。
[0033] 圖6顯示了 J6/JFH-2. 1和J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV全基因組復制子RNAs弓I 入其內的Huh7細胞中的核心蛋白質水平隨著時間過去的變化。
[0034] 圖7顯示了得自J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV全基因組復制子RNA引入其內的 Huh7細胞傳代培養物的培養上清液中的核心蛋白質水平隨著時間過去的變化。
[0035] 圖8顯示了評估J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒的感染性的結果。
[0036] 圖9顯示了 JFH-2. 1基因組RNA (HCV全基因組復制子RNA)和JFH-2. I A2218S HCV全基因組復制子RNA的結構。
[0037] 圖10顯示了得自JFH-2. I A2218S HCV全基因組復制子RNA引入其內的Huh7細 胞傳代培養物的培養上清液中的核心蛋白質水平隨著時間過去的變化。
[0038] 圖11顯示了評估JFH-2. I A2218S HCV顆粒的感染性的結果。
[0039] 圖12顯示了得自用J6/JFH-2. I A2217S衍生的突變型HCV RNA轉染的Huh7細胞 (Huh7. 5. 1細胞)傳代培養物的培養上清液中的核心蛋白質水平隨著時間過去的變化。在圖 12 中，J6/JFH2-AS、CS、LP、TI、CS/LP、CS/TI、TI/LP、CS/TI/LP、AT/CS/TI/LP、引入所有 4A 突變的病毒和引入所有4B突變的病毒分別指示J6/JFH-2. I A2217S、J6/JFH-2. I A2217S (CS)、J6/JFH-2.1 A2217S (LP)、J6/JFH-2.1 A2217S (TI)、J6/JFH-2.1 A2217S (CS/LP)、 J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI),J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP),J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/ LP)、J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)、J6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA) 和 J6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)。關于 J6/JFH-2.1 A2217S (TI/MT/ MK/NT/IV/SG/TA)的結果用空心圓圈顯示，并且關于 J6/JFH-2. I A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/ VG/IV/KR)的結果用實心圓圈顯示。
[0040] 具體實施方案 (1)根據本發明的突變型HCV復制子RNA和編碼該RNA的核酸 丙型肝炎病毒（HCV)基因組是包括約9, 600個核苷酸的單鏈（ + )RNA。這種基因組RNA 包括5'非翻譯區（也稱為"5' UTR"或"5' NTR")、由結構區和非結構區組成的翻譯區、和3' 非翻譯區（也稱為"3'UTR"或"3'NTR")。在結構區中，編碼HCV結構蛋白質，并且在非結構 區中，編碼非結構蛋白質。
[0041] HCV結構蛋白質和非結構蛋白質首先由翻譯區作為連續前體蛋白質(多聚蛋白質） 轉錄且翻譯。使HCV結構蛋白質接受通過宿主細胞中的蛋白酶的有限降解，并且使非結構 蛋白質部分接受通過2類自動催化作用的HCV蛋白酶活性的有限降解，并且隨后這些蛋白 質作為成熟蛋白質分開釋放。
[0042] HCV結構蛋白質是組成HCV病毒顆粒部分的核心、El、E2和p7。核心是核心蛋白 質，El和E2是包膜蛋白質，并且p7是形成在宿主細胞的膜上起作用的離子通道的蛋白質。
[0043] HCV非結構蛋白質是NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它們是具有涉及病毒基 因組復制或HCV蛋白質加工的活性的酶蛋白質。各種HCV基因型是已知的，并且各種基因 型的HCV基因組已知具有相似的基因結構。
[0044] HCV 5'非翻譯區（5' UTR或5' NTR)提供了用于蛋白質翻譯的內部核糖體進入位 點（IRES)和復制所需的元件，包括來自全長HCV基因組的N末端的約340個核苷酸。
[0045] HCV 3'非翻譯區（3'UTR或3'NTR)具有幫助HCV復制的功能，且除多聚U區外還 包括約100個核苷酸的另外區域。
[0046] 應用HCV基因組，本發明提供了可以高效率自我復制的RNA或編碼該RNA的DNA， 包括突變已引入其內以增加自我復制能力的HCV亞基因組序列或HCV全基因組序列。
[0047] 術語"復制子RNA"在本發明中指在細胞中可自我復制(可自主復制）的RNA。引入 細胞內的復制子RNA自我復制，并且所得到的RNA拷貝在細胞分裂后分配給子代細胞，從而 使得使用復制子RNA穩定引入細胞內是可能的。在本發明中，在HCV背景中的術語"基因 型"指根據由Simmonds等人開發的國際分類法（International Classification)分類的基 因型。
[0048] 在一個優選實施方案中，本發明提供了包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區、 NS3蛋白質編碼區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區、NS5B蛋白 質編碼區和3'非翻譯區的核酸，其中所述核酸在NS3蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區或 NS5B蛋白質編碼區中具有引起選自下述的一個或多個氨基酸置換的核苷酸置換：M (1205) K、F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、 K (2520) N和G (2374) S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨 基酸序列定義的。此類核酸一般是突變型HCV復制子RNA或編碼該突變型RNA的DNA。
[0049] 根據本發明的核酸是包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區、NS3蛋白質編碼 區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區、NS5B蛋白質編碼區和3' 非翻譯區的核酸，并且編碼包括至少NS3蛋白質、NS5A蛋白質或NS5B蛋白質的氨基酸序列， 其中一個或多個氨基酸置換選自 M (1205)K、F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196) T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S，如使用作為參考序列的 在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的。
[0050] 如本文使用的，除RNA和DNA外，術語"核酸"還指經由其結合形成的雜交核酸。另 夕卜，此處，術語"蛋白質編碼區"指編碼給定蛋白質的氨基酸序列的核苷酸序列，其可以包括 或可以不包括起始密碼子和終止密碼子。
[0051] 在說明書中，表達"如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示 的氨基酸序列定義的氨基酸置換"a (Z) b""，意指當氨基酸序列Y (優選地，與SEQ ID NO: "X"同源）與作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示的序列比對時，待與位于 SEQ ID NO :"X"中所示的氨基酸序列中在位置"Z"上的氨基酸"a"比對的在給定氨基酸序 列Y中的氨基酸(這優選地是但不限于與SEQ ID NO :"X"中相同的氨基酸"a"，或類似于氨 基酸"a"的氨基酸）由氨基酸"b"置換。此處，"a"和"b"代表給定氨基酸，其各自基于生 物學領域中一般用于氨基酸的單字母符號進行描述。
[0052] 因此，例如，表達"如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨 基酸序列定義的氨基酸置換A (2218) S"，意指當HCV前體蛋白質的氨基酸序列"Y"與SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列（HCV JFH-2. 3毒株的前體蛋白質的氨基酸序列)比對時，待與 SEQ ID NO :6的位置2218上的氨基酸A (丙氨酸）比對的在給定氨基酸序列Y中的氨基酸 的S (絲氨酸)置換。因此，例如當整個HCV前體蛋白質的氨基酸序列中的第2217位丙氨酸 (在位置2217上的丙氨酸)與SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列中在位置2218上的丙氨酸 比對時，在目的氨基酸序列中在位置2217上的丙氨酸由絲氨酸的置換對應于"如使用作為 參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的氨基酸置換A (2218) S"。
[0053] 此外，短語"如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示的氨基 酸序列定義的在位置"Z"上的氨基酸"，指當SEQ ID NO :"X"中所示的序列與序列Y (優選 地，與SEQ ID NO :"X"同源）比對時，待與SEQ ID NO :"X"中所示的氨基酸序列中在位置 "Z"上的氨基酸比對的在給定氨基酸序列Y中的氨基酸。表達"如使用作為參考序列的在 序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示的核苷酸序列定義的在位置"Z"上的核苷酸"也將類似 地理解。
[0054] 在說明書中，如果核酸是RNA，并且RNA的核苷酸序列或核苷酸通過參考序列表中 的SEQ ID NO (S)指定，那么相關SEQ ID NO中所示的核苷酸序列中的"T (胸腺嘧啶）"應 讀作"U (尿嘧啶)"。
[0055] 給定序列Y與SEQ ID NO :"X"中所示的序列的比對可以手工執行，或通過例 如Clustal W多重比對程序（Thompson，J. D.等人，（1994)Nucleic Acids Res. 22,第 4673-4680頁）使用缺省設置執行。
[0056] 在說明書中，每個HCV區域還可以用在每個區域的5'末端和3'末端上的核苷酸 位置進行鑒定，如使用作為參考序列的SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列（JFH-2. 3毒株的 全長基因組序列）定義的。在SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列中，5'UTR范圍從核苷酸 位置1到340,核心編碼區(核心區）范圍從核苷酸位置341到913, El編碼區（El區）范圍 從核苷酸位置914到1492, E2編碼區（E2區）范圍從核苷酸位置1493到2593, p7編碼區 (p7區）范圍從核苷酸位置2594到2782, NS2編碼區（NS2區）范圍從核苷酸位置2783到 3433, NS3編碼區（NS3區）范圍從核苷酸位置3434到5326, NS4A編碼區（NS4A區）范圍從 核苷酸位置5327到5488, NS4B編碼區（NS4B區）范圍從核苷酸位置5489到6271，NS5A編 碼區（NS5A區）范圍從核苷酸位置6272到7669, NS5B編碼區（NS5B區）范圍從核苷酸位置 7670到9445,并且3' UTR范圍從核苷酸位置9446到9686。
[0057] 在說明書中，HCV前體蛋白質中的氨基酸可以用氨基酸編號進行指定，所述氨基 酸編號通過用前體蛋白質的翻譯起始甲硫氨酸(M)編號為"第一個"氨基酸而給定。例如， JFH-2. 1毒株的前體蛋白質從翻譯起始甲硫氨酸開始，并且隨后以第3034位精氨酸（R)結 束。此外，JFH-2. 1毒株的第2218位氨基酸是NS5A區中包括的丙氨酸（A)。
[0058] 在說明書中，氨基酸置換通過例如A (2218)S或在位置2218上的A-S指示。具 體地，作為原則，它們都意指在位置2218上的A (丙氨酸）由S (絲氨酸）置換。在說明書 中，氨基酸或氨基酸殘基由生物學領域中一般用于氨基酸的單字母代碼或三字母代碼描述 (Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第 2 版，1989)。如上所述的氨 基酸也包括接受翻譯后修飾例如羥基化、糖基化或硫酸化的氨基酸。
[0059] 在本發明中，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸 序列定義的，將選自 M (1205)K、F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218) S、H (2223) Q、Q (2281) R、K (2520) N和G (2374) S的一個或多個氨基酸置換引入HCV前 體蛋白質中的NS3蛋白質、NS5A蛋白質和NS5B蛋白質內，從而可以增加編碼HCV前體蛋白 質的復制子RNA的自我復制能力。一個或多個氨基酸置換的此類引入可以通過使用本領域 技術人員已知的基因工程技術引入核苷酸置換執行，所述核苷酸置換引起編碼HCV復制子 RNA的DNA內的相關氨基酸置換。
[0060] 根據生物學領域中眾所周知的遺傳密碼表，通過比較置換后的氨基酸密碼子與置 換前的氨基酸密碼子，可以容易地指定引起一個或多個上述氨基酸置換的一個或多個核苷 酸置換。
[0061] 根據本發明的核酸例如突變型HCV復制子RNA或編碼該RNA的DNA并無限制，但 優選具有引起來自上述氨基酸置換中的至少氨基酸置換A(2218)S的核苷酸置換。這是因 為該氨基酸置換對于增強自我復制是特別有效的。例如，引起氨基酸置換A (2218) S的核 苷酸置換優選是這樣的核苷酸置換，其將編碼在氨基酸位置2218上的丙氨酸的密碼子(一 般而言，GCT、GCC、GCA或GCG)轉換為編碼絲氨酸的密碼子例如TCA、TCC、TCG、TCT、AGT或 AGC。
[0062] 除5'非翻譯區、NS3蛋白質編碼區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋白質編碼區、NS5A 蛋白質編碼區、NS5B蛋白質編碼區和3'非翻譯區外，根據本發明的核酸例如突變型HCV復 制子RNA或編碼該RNA的DNA可以進一步包括丙型肝炎病毒基因組的核心蛋白質編碼區、 El蛋白質編碼區、E2蛋白質編碼區和p7蛋白質編碼區。根據本發明的突變型HCV復制子 RNA或編碼該RNA的核酸可以進一步包括丙型肝炎病毒基因組的NS2蛋白質編碼區。根據 本發明的突變型HCV復制子RNA或編碼該RNA的核酸進一步優選包括核心蛋白質編碼區、 El蛋白質編碼區、E2蛋白質編碼區、p7蛋白質編碼區和NS2蛋白質編碼區，并且更優選以 這一次序包括它們。
[0063] 根據本發明的核酸的優選例子是編碼在序列表中的SEQ ID NO :5或6中所示的 氨基酸序列中具有選自下述的一個或多個氨基酸置換的氨基酸序列的核酸:M (1205) K、 F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N和G(2374)S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸 序列定義的。核酸編碼從暴發性肝炎患者中分離的JFH-2. 1毒株（SEQ ID N0:5)或JFH-2. 3 毒株（SEQ ID NO :6)的前體蛋白質的突變型。
[0064] 根據本發明的上述核酸的另一個優選例子是包括序列表中的SEQ ID NO : 12或13 中所示的核苷酸序列的核酸。
[0065] 根據本發明的核酸例如突變型HCV復制子RNA或編碼該RNA的DNA優選進一步包 括外源基因例如標記基因和/或IRES序列。此類標記基因的例子包括可以對細胞賦予選 擇性通過其僅選擇表達相關基因的細胞的選擇標記基因，和編碼充當基因表達指示的基因 產物的報道基因。在本發明中，此類選擇標記基因的優選例子包括但不限于新霉素抗性基 因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰轉移酶基因、Zeocin抗 性基因和嘌呤霉素抗性基因。在本發明中，報道基因的優選例子包括但不限于轉座子Tn9 衍生的氯霉素乙酰轉移酶基因、大腸桿菌cWi)衍生的β葡糖醛酸酶或β 半乳糖苷酶基因、螢光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、水母衍生的水母發光蛋白基因和分泌 的胎盤堿性磷酸酶（SEAP)基因。
[0066] 在本發明中的術語"IRES序列"指能夠引起核糖體與RNA內部結合以便起始翻譯 的內部核糖體進入位點。在本發明中此類IRES序列的優選例子包括但不限于EMCV IRES (腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點）、FMDV IRES和HCV IRES。
[0067] 根據本發明的核酸例如突變型HCV復制子RNA或編碼該RNA的DNA可以是包括 HCV亞基因組復制子序列的核酸，這僅包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區、NS3蛋白質 編碼區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區、NS5B蛋白質編碼區 和3'非翻譯區作為HCV衍生的序列。在本發明中，術語"HCV亞基因組"指HCV全長基因組 的部分序列。HCV亞基因組復制子RNA是包括HCV亞基因組的復制子RNA，但不包括范圍從 HCV全長基因組的5' UTR到3' UTR的全部區域。
[0068] 包括HCV亞基因組復制子序列的核酸的例子是RNA，其中在5'到3'方向，5' UTR、 包括來自核心編碼區5'末端的36個核苷酸的序列、螢光素酶基因(標記基因)、腦心肌炎病 毒IRES序列、NS3區、NS4A區、NS4B區、NS5A區、NS5B區和3' UTR例如以此次序連接。
[0069] 根據本發明的核酸例如突變型HCV復制子RNA或編碼該RNA的DNA還可以是HCV 全基因組復制子RNA。術語"HCV全基因組復制子RNA"指包括范圍從HCV全長基因組的 5' UTR到3' UTR的全部區域的復制子RNA，具體地，5' UTR、核心蛋白質編碼區(核心區)、E1 蛋白質編碼區（El區)、E2蛋白質編碼區（E2區)、p7蛋白質編碼區（p7區)、NS2蛋白質編碼 區（NS2區)、NS3蛋白質編碼區（NS3區）、NS4A蛋白質編碼區（NS4A區）、NS4B蛋白質編碼 區（NS4B區）、NS5A蛋白質編碼區（NS5A區）、NS5B蛋白質編碼區（NS5B區）和3' UTR。HCV 全基因組復制子RNA可以由HCV全長基因組序列組成或可以進一步包括另外序列。在本發 明中，術語"HCV全長基因組"或"全長HCV基因組"指包括HCV基因組的全長序列（范圍從 5' UTR到3' UTR)的RNA或編碼該RNA的DNA。
[0070] (2)根據本發明的復制子RNA的制備 使用編碼突變型HCV復制子RNA的DNA并且隨后將其用作模板，通過經由本領域技 術人員已知的任何基因工程技術制備復制子RNA表達載體，可以制備根據本發明的突變型 HCV復制子RNA，具體地突變型HCV亞基因組復制子RNA或突變型HCV全基因組復制子RNA。 本發明還提供了包括核酸(優選地，編碼突變型HCV復制子RNA的DNA)的載體，特別是表達 載體，所述核酸例如突變型HCV復制子RNA、編碼該RNA的DNA等，其在啟動子下游可操作地 連接。表達載體可以用于在體外有效合成突變型HCV復制子RNA。用于構建根據本發明的 復制子RNA表達載體的基礎技術如Lohmann等人的文獻（Science, 285 :110-113,1999)和 Kato 等人的文獻（Gastroenterology，125 :1808-1817, 2003)中所述。
[0071] 作為可以用于制備根據本發明的核酸的HCV毒株，可以使用從HCV患者中分離的 任何毒株或其衍生毒株。更優選使用從暴發性丙型肝炎患者中分離的HCV毒株。用于從 患者中分離HCV基因組的方法如Kato等人的文獻（Gastroenterology, 125 :1808-1817, 2003)中所述。在本發明中，在HCV背景中的術語"衍生毒株"指衍生自目的病毒株的毒株。
[0072] 任何丙型肝炎病毒毒株的基因組都可以用于制備根據本發明的核酸。優選使用基 因型2a的丙型肝炎病毒的至少一個基因組。編碼NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、 NS5A蛋白質和NS5B蛋白質的區域可以衍生自任何丙型肝炎病毒基因組。更優選地，使用 來自基因型2a的丙型肝炎病毒的基因組的此類區域。進一步優選地，使用一個或多個上 述氨基酸置換引入其內的來自HCV JFH-2. 1或HCV JFH-2. 3毒株、毒株的衍生毒株、或HCV JFH-I毒株的基因組的序列。
[0073] 根據本發明的核酸可以是來自一個、兩個或更多個類型的任意丙型肝炎病毒的基 因組的嵌合體。根據本發明的核酸可以是但不限于其中使用基因型2a的丙型肝炎病毒的 至少一個基因組的嵌合體。對于根據本發明的核酸的制備，例如可以使用HCV JFH-I毒株、 J6CF毒株、HCV JFH-2. 1毒株、HCV JFH-2. 3毒株或這些毒株的衍生毒株的基因組。
[0074] 根據本發明的突變型HCV復制子RNA可以例如通過下述方法進行制備，但所述方 法并不限于下述方法。首先，通過常規方法使編碼上述突變型HCV復制子RNA的DNA連接在 載體中的RNA啟動子下游，從而制備DNA克隆。RNA啟動子的例子包括但不限于，T7啟動子、 SP6啟動子和T3啟動子。T7啟動子是特別優選的。作為載體，可以使用pUC19 (TaKaRa)、 pBR322 (TaKaRa)>pGEM-3Z (Promega)>pSP72 (Promega)>pCRII (Invitrogen)>pT7Blue (Novagen)等，但例子并不限于這些。
[0075] 來自包括編碼突變型HCV復制子RNA的DNA的表達載體的突變型HCV復制子RNA 的制備(合成）可以使用例如MEGA script T7試劑盒（Ambion)等執行。此外，當載體引入 細胞內用于表達時，優選使用包括RNA聚合酶I啟動子和終止子的載體(在W02007-037428 (HCV#9)中描述)。
[0076] 如此制備的突變型HCV復制子RNA可以通過本領域技術人員已知的RNA提取法、 純化法等進行提取且純化。
[0077] (3)包括自我復制的突變型HCV復制子RNA的轉化細胞的制備 將上述制備的復制子RNA例如突變型HCV復制子RNA引入宿主細胞內，從而可以獲得 包括自我復制的復制子RNA的轉化細胞。本發明還提供了經由突變型HCV復制子RNA引入 細胞內獲得的轉化細胞，復制子RNA在所述轉化細胞中自我復制。
[0078] 復制子RNA引入其內的細胞可以是使得HCV復制子能夠復制的任何細胞。此類細 胞更優選是人肝衍生的細胞、人子宮頸衍生的細胞或人胚腎衍生的細胞。此類細胞的例子 包括Huh7細胞、HepG2細胞、頂Y-N9細胞、HeLa細胞和293細胞。此類細胞的進一步合適 例子包括Huh7細胞的衍生株，例如Huh7. 5細胞和Huh7. 5. 1細胞。此外，CD81基因和/或 Claudin 1基因在其中表達的細胞，例如Huh7細胞、!fepG2細胞、MY-N9細胞、HeLa細胞或 293細胞也是此類細胞的例子。在這些細胞中，優選使用Huh7細胞或Huh7細胞的衍生細 胞。
[0079] 復制子RNA可以使用本領域技術人員已知的任何技術引入細胞內。此類技術的例 子包括磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖法、脂轉染、顯微注射和電穿孔。優選地，執行脂轉染和 電穿孔。更優選地，特別優選執行基于電穿孔的方法。
[0080] 關于復制子RNA，可以引入單獨的靶復制子RNA，或還可以引入與另一種核酸混合 的靶復制子RNA。為了改變復制子RNA的量同時使待引入的RNA量維持在恒定水平，使靶復 制子RNA與從待用于引入的細胞中提取的總細胞RNA混合，并且隨后將混合物引入細胞內。 待引入細胞內的復制子RNA的量可以依賴于待采用的引入方法決定。在本文中待使用的復 制子RNA的量范圍優選地為1皮克到100微克，并且更優選10皮克到10微克。
[0081] 當使用包括標記基因的復制子RNA時，復制子RNA已引入其內且自我復制的細胞 可以使用標記基因的表達進行選擇。
[0082] 通過常規方法可以由引入細胞內且培養細胞后形成的集落克隆活細胞。以此類方 式，可以建立包括自我復制的復制子RNA的細胞克隆。
[0083] 如此建立的細胞克隆優選實際上通過下述證實復制子RNA的自我復制：例如，檢 測細胞中來自所引入復制子RNA的復制子RNA的復制，證實復制子RNA中標記基因的表達， 或證實HCV蛋白質(例如核心)的表達。通過使針對待由引入的復制子RNA表達的HCV蛋白 質的抗體與從細胞克隆中提取的蛋白質反應，可以證實HCV蛋白質的表達。這種方法可以 通過本領域技術人員已知的任何蛋白質檢測方法執行。具體地，例如，該方法可以通過下述 執行：將從細胞克隆中提取的蛋白質樣品點在硝酸纖維素膜上，使抗HCV蛋白質抗體(例如 抗核心特異性抗體或從丙型肝炎患者中收集的抗血清)與膜反應，并且隨后檢測抗HCV蛋白 質抗體。如果從細胞克隆中提取的蛋白質中檢測到HCV蛋白質，那么可以得出結論HCV衍 生的復制子RNA自我復制，并且HCV蛋白質在細胞克隆中表達。如此建立且優選證實的細 胞克隆是通過引入根據本發明的復制子RNA獲得的轉化細胞。
[0084] 作為用于評估復制子RNA在轉化細胞中的復制能力的方法，可以測量連接到HCV 亞基因組復制子RNA或HCV全基因組復制子RNA內的外源基因的功能。當外源基因是藥物 抗性基因時，評估可以通過測定在包含藥物的選擇培養基中生長的細胞數目或細胞集落數 目來進行。此外，當外源基因是酶基因時，復制能力可以通過測量酶活性進行評估。作為另 一種方法，復制能力可以通過經由定量PCR定量測定復制的RNA量進行評估。
[0085] 已證實HCV基因組的有效復制需要在HCV基因組的核苷酸序列中突變的出現 (Lohmann，V.等人，J. Virol.，75:1437-1449,2001)。改善復制的突變被稱為適應性突變。 根據本發明的突變型HCV復制子RNA是具有顯著增強的自我復制的復制子RNA。通過培養 的繼續，適應性突變在HCV復制子RNA中發生，并且復制可以得到顯著改善。如使用作為參 考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的氨基酸置換A(2218)S導 致復制能力方面的此類顯著增強。
[0086] (4)感染性HCV顆粒的產生 在本發明中，對通過引入根據本發明的HCV復制子RNA獲得的轉化細胞進行傳代培養， 從而使得感染性HCV顆粒可以產生且優選釋放到培養基內。此處，根據本發明的HCV復制 子RNA是這樣的復制子RNA，其除丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區，分別編碼NS3蛋白 質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質和NS5B蛋白質的序列，和3'非翻譯區外，還包 括HCV結構區。具體地，HCV復制子RNA是： 除丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區，分別編碼NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白 質、NS5A蛋白質和NS5B蛋白質的序列，和3'非翻譯區外，進一步包括丙型肝炎病毒基因組 的核心蛋白質編碼區、El蛋白質編碼區、E2蛋白質編碼區和p7蛋白質編碼區的核酸； 除丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區，分別編碼NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白 質、NS5A蛋白質和NS5B蛋白質的序列，和3'非翻譯區外，進一步包括核心蛋白質編碼區、 El蛋白質編碼區、E2蛋白質編碼區、p7蛋白質編碼區和NS2蛋白質編碼區的核酸（HCV全 基因組復制子RNA);或 包括在序列表中的SEQ ID NO : 12或13中所示的核苷酸序列的核酸，或 包括編碼在序列表中的SEQ ID N0:5或6中所示的氨基酸序列中具有選自下述的一個 或多個氨基酸置換的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸：M (1205) K、F (1548) L、C (1615) W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N 和 G (2374) S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義。
[0087] 能夠產生感染性HCV顆粒的根據本發明的轉化細胞的一般例子包括全長嵌合復 制子RNA和此類全長嵌合復制子RNA已引入其內的轉化細胞，其中所述全長嵌合復制子RNA 包括JFH-I毒株衍生的5'非翻譯區J6CF毒株衍生的核心蛋白質編碼區、El蛋白質編碼 區、E2蛋白質編碼區和p7蛋白質編碼區JFH-I毒株衍生的NS2蛋白質編碼區；和此外，編 碼氨基酸序列的核苷酸序列，其中一個或多個且優選任何一個上述氨基酸置換已引入HCV JFH-2. 1毒株或HCV JFH-2. 3毒株衍生的NS3蛋白質編碼區、NS4A蛋白質編碼區、NS4B蛋 白質編碼區、NS5A蛋白質編碼區、NS5B蛋白質編碼區、和3'非翻譯區。
[0088] 此類轉化細胞的病毒顆粒生產能力也可以使用針對HCV蛋白質(例如核心蛋白 質、El蛋白質或E2蛋白質)的抗體進行檢測，所述HCV蛋白質組成釋放到培養基(培養溶液） 內的HCV病毒顆粒。此外，HCV病毒顆粒的存在也可以通過下述進行間接檢測：使用特異性 引物通過RT-PCR擴增且檢測在培養溶液中的HCV病毒顆粒中包含的HCV復制子RNA。
[0089] 通過上述轉化細胞產生的HCV顆粒對細胞(優選地，HCV敏感細胞)是感染性的。在 本發明中，術語"HCV敏感細胞"指由HCV感染的細胞。此類HCV敏感細胞優選肝細胞或淋巴 譜系細胞，但例子并不限于這些。肝細胞的具體例子包括原代肝細胞、Huh7細胞、HepG2細 胞、頂Y-N9細胞、HeLa細胞和293細胞。淋巴譜系細胞的具體例子包括Molt4細胞、HPB-Ma 細胞和Daudi細胞。然而,例子并不限于這些細胞。
[0090] 制備的HCV顆粒是否是感染性的可以通過下述進行測定：使用通過培養上述轉化 細胞（HCV復制子RNA已引入其內）獲得的培養上清液處理HCV容許細胞(例如Huh-7)，在 給定時間段后(例如在48小時后)用抗核心抗體免疫染色細胞，并且隨后測定受感染細胞的 數目。可替代地，測定可以通過下述進行：使細胞提取物接受在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的 電泳，通過蛋白質印跡檢測核心蛋白質，并且從而檢測受感染細胞。
[0091] 本發明還涉及用于制備HCV顆粒的方法，通過下述進行：培養能夠產生感染性HCV 顆粒的上述轉化細胞，并且隨后優選獲得(例如收集培養上清液）釋放到培養基(優選地，培 養溶液）內的HCV顆粒。本發明提供了通過該方法獲得的HCV顆粒和優選地感染性HCV顆 粒。HCV顆粒還感染HCV敏感動物例如黑猩猩，以便能夠誘導HCV衍生的肝炎。
[0092] (5)亞基因組復制子RNA的用途 根據本發明的HCV亞基因組復制子RNA已引入其內的轉化細胞可以用于篩選抑制HCV 亞基因組復制子RNA復制的化合物。
[0093] 更具體而言，例如，將其中在5'到3'方向，5' UTR、范圍從核心編碼區的5'末端 到核苷酸36的序列、螢光素酶基因(標記基因）、腦心肌炎病毒IRES序列、NS3區、NS4A區、 NS4B區、NS5A區、和NS5B區和3' UTR以這個次序連接的RNA引入Huh7細胞內。隨后，用 待篩選的化合物處理細胞。在48 - 72小時后，測量螢光素酶活性。與未用化合物處理的 組比較抑制螢光素酶活性的化合物被視為具有抑制HCV亞基因組復制子RNA復制的作用。 相應地，還可以測定哪種化合物可以具有抑制HCV復制的活性，所述HCV具有與復制子RNA 或特別地NS3至NS5B區由其衍生的HCV毒株的基因型相同的基因型，或在相關HCV毒株已 從其中分離的具有HCV相關疾病的患者等中觀察到。
[0094] (6) HCV顆粒的用途 本發明的HCV顆粒也可以用于篩選抑制HCV感染的抗體或化合物。
[0095] 根據本發明的HCV顆粒也優選用作疫苗或抗原用于制備抗HCV抗體。
[0096] 具體地，根據本發明的HCV顆粒可以不作修飾地用作疫苗。HCV顆粒還可以進行 經由本領域已知的方法減毒或滅活且隨后使用。通過加入滅活劑且使滅活劑與例如病毒 懸浮液混合，并且允許滅活劑與病毒反應，可以滅活病毒，所述滅活劑例如福爾馬林、β -丙 酸內酯或戊二醒（glutardialdehyde) (Appaiahgari，Μ. Β. & Vrati，S.，Vaccine，22 : 3669-3675,2004)。
[0097] 可以將疫苗配制成可以施用的劑型，例如溶液或懸浮液。疫苗可以以適合于將其 溶解或懸浮于溶液中的固態進行制備。可替代地，此類制劑可以在脂質體中進行乳化或包 封。活性免疫原性成分例如HCV顆粒通常與賦形劑混合，所述賦形劑是藥學上可接受的且 與待在本文中使用的活性成分相容。合適賦形劑的例子包括水、生理鹽水、右旋糖、甘油、乙 醇及其混合物。進一步地，疫苗可以包含微量輔助劑(例如濕潤劑或乳化劑)、pH緩沖劑和/ 或增強疫苗功效的佐劑。有效佐劑的例子包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇 氨酰-D-異谷氨酰胺（thr-MDP)、N-乙酰基-去甲（nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰 胺(被稱為CGP11637、去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨 酸-2- (1' -2' -二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(被稱為CGP19835A、MTP-PE) 和RIBI。RIBI包括在2%角鯊烯/Tween (κ)80乳狀液中的從細菌中提取的3種組分；即單 磷酰脂質Α、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架（HPL+TDM+CWS)。佐劑的作用可以通過測量得 自包括HCV顆粒的疫苗施用的抗體量進行測定。
[0098] 疫苗一般例如通過注射例如皮下注射或肌內注射腸胃外施用。作為其他劑量形式 合適的其他制劑的例子包括栓劑和口服制劑。
[0099] 具有佐劑活性的一種或多種化合物可以加入HCV疫苗中。佐劑是對于免疫系統的 非特異性刺激劑。此類物質增強宿主針對HCV疫苗的免疫應答。本領域已知的佐劑的具 體例子包括弗氏完全和不完全佐劑、維生素 Ε、非離子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物 油、植物油和卡波普（Carbopol)。特別適合于經粘膜施用的佐劑的例子包括大腸桿菌(凡 co7i)不耐熱毒素（LT)和霍亂毒素（CT)。其他合適佐劑的例子包括氫氧化錯、磷酸錯或氧 化鋁、油乳劑(例如Bayol %或Marcol 5?)、皂苷和維生素 E加溶物。相應地，本發明的優 選實施方案的疫苗包括佐劑。
[0100] 關于用于皮下、皮內、肌內或靜脈內施用的可注射溶液，在可注射溶液中用于與本 發明的HCV疫苗組合施用的藥學上可接受的載體或稀釋劑的其他具體例子包括穩定劑、碳 水化合物(例如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白質(例如白蛋白或酪 蛋白）、含蛋白質物質(例如牛血清或脫脂乳）和緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)。
[0101] 用于栓劑的常規粘合劑和載體的例子可以包括聚亞烷基二醇和甘油三酯。此類栓 劑可以由包括0.5%- 50%且優選1%- 20%活性成分的混合物進行制備。口服制劑包括 一般使用的賦形劑。賦形劑的例子包括藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素和碳酸鎂。
[0102] 本發明的疫苗可以是溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放制劑或粉末的形 式，并且它的活性成分(病毒顆粒或其部分）占其10% - 95 %且優選25 % - 70%。
[0103] 本發明的疫苗以適合于劑型的方式和可以發揮預防和/或治療作用的量施用。待 施用的量一般范圍為0.01 ug - 100,000 Ug抗原/劑量。該量依賴于待治療的患者、患 者在免疫系統中抗體合成的能力和期望的保護程度而改變。此外，該量依賴于施用途徑而 改變，所述施用途徑例如口服、皮下、皮內、肌內或靜脈內施用。
[0104] 本發明的疫苗可以根據單一施用方案且優選根據多次施用方案進行施用。在多次 施用方案的情況下，在疫苗接種起始時執行1 - 10次分開施用，并且隨后可以用維持或增 強免疫應答所需的時間間隔執行另一次施用。例如，第二次施用可以在第一次后1 - 4個 月執行。需要時，施用可以隨后在第一次后數月執行。施用方案至少部分根據個別患者的 需要來決定，并且方案取決于由醫生做出的判斷。
[0105] 進一步地，包括本發明的HCV顆粒的疫苗可以與另一種免疫學試劑(例如免疫球 蛋白）一起施用。
[0106] 進一步地，本發明的HCV顆粒疫苗可以針對可能的新HCV感染預防性地使用，其經 由施用于健康個體以誘導針對HCV的免疫應答而實施。本發明的HCV顆粒疫苗也可以用作 治療疫苗，以在體內誘導針對HCV的強免疫應答以消除HCV，其經由施用于由HCV感染的患 者，經由施用于由HCV感染的患者而實施。
[0107] 本發明的HCV顆粒還用作待用于制備抗HCV抗體的抗原。待用作抗原的HCV顆粒 期望地具有較高純度。通過離心和/或使用濾器等從包含HCV顆粒的培養溶液中去除細胞 或細胞碎片。細胞碎片已從其中去除的此類溶液還可以使用超濾膜濃縮約10 - 100倍，所 述超濾膜具有范圍為100, 〇〇〇 - 500, 000的分子量截止。細胞碎片已從其中去除的包含 HCV顆粒的此類溶液可以通過以任何次序組合或單獨的層析(例如凝膠過濾層析、離子交換 層析和親和層析）和密度梯度離心進行純化。
[0108] (7 )針對HCV顆粒的抗體 本發明還提供了針對上文（4)中獲得的HCV顆粒的抗體。此類抗體的優選例子特別地 包括針對HCV顆粒的抗體，所述HCV顆粒具有JFH-2. 1或JFH-2. 3毒株的結構蛋白質(核 心、El、E2和p7)。更具體而言，針對具有JFH-2. 3毒株的結構蛋白質(核心、El、E2和p7) 的HCV顆粒的抗體例子是針對通過轉化細胞產生的HCV顆粒的抗體,所述轉化細胞通過引 入編碼下述的HCV復制子RNA獲得：作為核心蛋白質范圍從序列表中SEQ ID NO :6的氨基 酸位置1到191的氨基酸序列；作為El蛋白質范圍從其氨基酸位置192到384的氨基酸序 列；作為E2蛋白質范圍從其氨基酸位置385到751的氨基酸序列；和作為p7蛋白質范圍從 氨基酸位置752到814的氨基酸序列。
[0109] 抗體可以通過給哺乳動物或鳥類施用本發明的HCV顆粒進行制備。哺乳動物的例 子包括小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、馬、牛、豚鼠、單峰駱駝、雙峰駱駝和美洲駝（lamas)。單 峰駱駝、雙峰駱駝和美洲駝適合于制備單獨由H鏈組成的抗體。鳥類的例子包括雞、鵝和鴕 鳥。可以從本發明的HCV顆粒已施用于其的動物獲得血清，并且隨后可以通過眾所周知的 方法由其獲得抗體。
[0110] 產生單克隆抗體生產細胞的雜交瘤可以應用用本發明的HCV顆粒免疫的動物 的細胞進行制備。用于產生雜交瘤的方法是本領域眾所周知的，并且可以采用在例如 Antibodies ：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)中描述的方 法。
[0111] 單克隆抗體生產細胞可以經由細胞融合或經由其他方法進行制備，所述其他方法 涉及引入癌基因的DNA或用EB病毒感染用于B淋巴細胞的永生化。
[0112] 更具體而言，通過給小鼠施用HCV顆粒用于制備抗HCV單克隆抗體的程序如下所 述。一般地，4 - 10周齡的小鼠用HCV顆粒作為抗原進行免疫，但在需要時可以省略純 化步驟。免疫接種一般通過與佐劑一起皮下或腹膜內施用抗原數次來執行。此類佐劑的 例子包括但不限于弗氏完全和不完全佐劑、氫氧化鋁凝膠、百日咳嗜血桿菌（Hemophilus pertussis)疫苗、Titer Max Gold (Vaxel)和 GERBU 佐劑（GERBU Biotechnik)。最后的 免疫接種通過靜脈內或腹膜內施用HCV顆粒執行，而不施用任何佐劑。在用HCV顆粒最后 免疫接種后第3到10天時且優選在第4天時，根據已知方法從免疫接種的小鼠中切除脾 (Antibodies ：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
[0113] 本文采用的方法涉及制備來自脾的脾細胞和脾細胞與骨髓瘤細胞融合，以便制備 產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。作為待用于細胞融合的骨髓瘤細胞，可以使用任何骨髓瘤 細胞，只要它們可在體外復制。此類骨髓瘤細胞的例子包括小鼠衍生的建立的細胞系，例 如8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠（BALB/c-衍生的）骨髓瘤細胞系(例如P3-X63Ag8-Ul (P3-U1 )、 SP2/0-Agl4 (SP2/0)、P3-X63-Ag8653 (653)、P3-X63-Ag8 (X63)和 P3/NSl/l-Ag4-l (NS1))。 這些細胞系可從RIKEN BioResource Center、ATCC(美國典型培養物保藏中心)或ECACC(歐 洲細胞培養物保藏中心European Collection of Cell Cultures)獲得。培養和傳代培養 根據已知方法執行（Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Selected Methods in Cellular Immunology ff. H. Freeman and Company,1980)。
[0114] 洗滌因而獲得的脾細胞和骨髓瘤細胞，并且隨后以I (骨髓瘤細胞）：1-10 (脾細 胞）的比率混合，隨后為細胞融合反應。作為融合加速劑，可以使用具有平均分子量范圍為 1000 - 6000的聚乙二醇、聚乙烯醇等。此外，細胞還可以使用商購可得的細胞融合儀器使 用電刺激(例如電穿孔）進行融合。
[0115] 在細胞融合后，使細胞懸浮于培養基中，并且隨后洗滌。細胞使用用于培養骨髓瘤 細胞的培養基進行洗滌，例如Dulbecco改良Eagle培養基或RPMI-1640培養基。用于培養 融合細胞的培養基補充有HAT補充物，以便僅選擇性獲得靶融合細胞。通過集落形成方法 在甲基纖維素培養基中執行有限稀釋(在稀釋至IO 3 - IO7細胞/毫升（ml)后，將細胞以IO2 -IO6細胞/孔種植到96孔細胞培養微量板內）或克隆。
[0116] 雜交瘤可以通過一般方法進行篩選，并且方法并無特別限制。例如，收集培養上清 液的部分，將上清液加入固定的HCV蛋白質中，并且隨后加入標記的二次抗體用于溫育。結 合能力可以通過酶聯免疫吸附測定（ELISA)或放射免疫測定（RIA)進行測量，或接受斑點 印跡分析或蛋白質印跡分析。選擇證實產生與靶抗原反應的抗體的雜交瘤系作為產生單克 隆抗體的雜交瘤系。
[0117] 此外，產生具有抑制HCV感染活性的抗HCV單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用感 染性HCV顆粒用于測量抑制HCV感染的活性的方法進行選擇，如下述例子中所述。
[0118] 首先，使感染性HCV顆粒(用于制備HCV顆粒的方法如上所述)和抗體樣品混合，并 且隨后允許在37°C反應1小時。將樣品（50 μ 1)加入在混合前那天以5 X IO3細胞/孔 在96孔板中培養的Huh7細胞中，并且隨后使細胞在37°C培養2. 5小時。在培養后，去除樣 品，用PBS洗滌細胞，加入新鮮培養基，并且隨后連續培養細胞。在48小時后，去除培養上 清液，將生成物用PBS洗滌1次，加入100 μ I ISOGEN (Nippon Gene)，并且隨后由細胞制 備RNA。在RNA定量后，測量HCV基因組RNA的量。通過定量RT-PCR的HCV RNA檢測根據 Takeuchi等人的方法通過檢測HCV RNA的5'非翻譯區的RNA來進行（Takeuchi T.等人， Gastroenterology, 116 :636-642,1999)。
[0119] 用于評估抑制HCV感染的活性的另一種方法如下。首先，使抗體樣品和感染性HCV 顆粒混合，并且隨后允許在37°C反應1小時。接下來，將50微升（μ 1)上述樣品加入在混 合前那天以I X IO4細胞/孔在96孔板中培養的Huh-7細胞中，并且隨后使細胞在37°C 培養2. 5小時。在培養后，去除樣品，用PBS洗滌細胞，加入新鮮培養基，并且隨后連續培 養細胞。在72小時后，去除培養上清液，并且隨后將板置于冰冷的甲醇中，從而將細胞固 定。隨后，通過風干去除甲醇，并且隨后使用包含0.3% Triton(K)-X 100 (GE Healthcare) 的BlockAce (K) (Dainippon Pharmaceutical)溶解細胞。HCV感染的細胞在熒光顯微鏡檢 查（Olympus Corporation, IX-70)下進行計數，其使用克隆2H9抗HCV核心抗體(參見Nat Med. (2005) 11:第 791-6 頁·）和山羊抗小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probes)。其中 HCV感染已被抑制的孔中的樣品證實為陽性克隆，從而可以選擇靶雜交瘤。如上所述選擇的 雜交瘤產生的單克隆抗體是本發明的抗體的優選實施方案。
[0120] 通過此類技術獲得的單克隆或多克隆抗體用于HCV的診斷、治療和預防。如果抗 體來自動物，那么可以制備與人抗體形成的嵌合抗體。特別優選的嵌合抗體是通過將小鼠 抗體的高變位點的序列移植到人抗體內制備的人源化抗體(人型抗體)等。此類人源化抗體 對于HCV的治療或預防是特別有用的。
[0121] 應用本發明的HCV顆粒制備的抗體可以與藥學上可接受的增溶劑、添加劑、穩定 齊IJ、緩沖劑等一起施用。此類抗體可以經由任何途徑進行施用。皮下、皮內或靜脈內施用是 優選的，并且靜脈內施用是更優選的。
[0122] 本發明可以使用在相關領域的一般技術范圍內的分子生物學和免疫學技術進行。 此類技術在各種文獻包括已知實驗方案等中充分說明。例如，此類技術在Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual(第3 卷，2001)，編輯 Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual (1988)中詳細描述。
[0123] (8)使用突變型HCV RNA復制細胞的HCV病毒顆粒的短時間產生 根據本發明的核酸例如突變型HCV復制子RNA或編碼該突變型RNA的DNA，和優選地核 酸例如衍生自2種或更多種HCV毒株的嵌合突變型HCV復制子RNAs或編碼該RNAs的DNAs 可以進一步包括引起氨基酸置換的核苷酸置換。
[0124] 在一個實施方案中，核酸例如突變型HCV復制子RNA (其為HCV J6毒株和HCV JFH-2. 1毒株的嵌合體）或編碼該RNA的DNA，和優選地J6/JFH-2. I A2217S RNA (其為具 有SEQ ID NO : 12中所示的核苷酸序列的嵌合突變型HCV復制子RNA)或編碼該RNA的DNA 可以包括核苷酸置換，其引起1或2個或更多個氨基酸和特別優選地7個或更多個氨基酸 的置換。氨基酸置換可以是但不限于選自下述的至少1個、優選2個或更多個、進一步優 選地3或4個或更多個、和特別優選地7或8個氨基酸置換：在位置148上的A - T (核心 區)，在位置356上的M - V(E1區)，在位置405上的M - K、在位置417上的N - T和在位 置626上的V - G (Ε2區），在位置868上的M - T (NS2區），在位置1642上的T - A (NS3 區），在位置1687上的I - V(NS4A區），在位置1722上的I - V和在位置1767上的K -R (NS4B區），在位置2204上的S - G和在位置2219上的C - S(NS5A區），在位置2695上的 T - I和在位置3016上的L - P (NS5B區)，如使用作為參考序列的由J6/JFH-2. I A2217S RNA編碼的前體蛋白質的氨基酸序列（SEQ ID NO:88)定義的。例如，J6/JFH-2. I A2217S RNA或編碼該RNA的DNA可以具有這樣的核苷酸置換，其引起選自下述的例如2個或更多 個(優選地3或4個或更多個)、或所有7個氨基酸置換：在位置405上的M - K、在位置417 上的N - T、在位置868上的M - T、在位置1642上的T - A、在位置1722上的I - V、在位 置2204上的S - G和在位置2695上的T - I。可替代地，J6/JFH-2. I A2217S RNA或編碼 該RNA的DNA可以具有這樣的核苷酸置換，其引起選自下述的2個或更多個(優選地3或4 個或更多個)，例如所有8個氨基酸置換：在位置148上的A - T、在位置356上的M - V、在 位置626上的V - G、在位置1687上的I - V、在位置1767上的K - R、在位置2219上的 C - S、在位置2695上的T - I和在位置3016上的L - P。具有引起此類另外氨基酸置換的 核苷酸置換的多突變型復制子(例如為HCV J6毒株與HCV JFH-2. 1毒株或JFH-2. 3毒株的 嵌合體的突變型HCV復制子)的RNA或編碼該RNA的DNA已引入其內的細胞，在復制起始后 相對立即地起始病毒顆粒的產生，并且隨后可以以大量穩定產生病毒顆粒數十天(例如40 天)。因此，如果使用此類突變型復制子，那么病毒顆粒可以在復制起始后的短時間段內以 大量產生。本發明還提供了此類有利的多突變型HCV復制子RNA或編碼該RNA的DNA。本 發明還提供了包括編碼多突變型HCV復制子RNA的DNA的表達載體和載體已引入其內的重 組細胞。本發明還提供了多突變型復制子RNA已引入其內的細胞。作為此類多突變型復制 子引入其內的根據本發明的細胞，可以使用例如肝細胞衍生的細胞或淋巴樣譜系細胞。肝 細胞衍生的細胞的例子包括但不限于Huh7細胞、Huh7細胞、!fepG2細胞、頂Y-N9細胞、HeLa 細胞和293細胞。淋巴樣譜系細胞的例子包括但不限于Molt4細胞、HPB-Ma細胞和Daudi 細胞。
[0125] 將多突變型復制子已引入其內的細胞培養相對短的時間段，從而使得病毒顆粒可 以以大量有效產生。培養期可以是例如從培養開始起1天或更多天、更優選地2天或更多 天、甚至更加優選地3天或更多天、進一步優選地5天或更多天、和特別優選地10天或更多 天。培養期可以是從培養開始起60天或更少天、更優選地50天或更少天、甚至更加優選地 40天或更少天、進一步優選地30天或更少天、和特別優選地20天或更少天。雖然HCV復制 子已引入其內的細胞一般已知在復制起始后從早期到中期其病毒顆粒生產量趨于急劇降 低一次，但多突變型HCV復制子已引入其內的根據本發明的細胞是非常有利的，因為它們 可以在短時間段內以大量穩定產生病毒顆粒。本發明還提供了使用多突變型復制子RNA或 編碼該RNA的DNA已引入其內的根據本發明的細胞用于產生HCV病毒顆粒的方法。
[0126] (9)序列概括 此外，在本申請中由SEQ ID NOS :指定的序列如下概括。
[0127] SEQ ID NO :1 :包含在重組質粒pSGR-JFH-2. 1中范圍從T7啟動子到3' UTR的部 分的核苷酸序列 SEQ ID NO :2 :包含在重組質粒pSGR-JFH-2. 3中范圍從T7啟動子到3' UTR的部分的 核苷酸序列 SEQ ID NO :3 :HCV JFH-2. 1毒株的全長基因組序列（編碼全長基因組RNA的核苷酸序 列） SEQ ID NO :4 :HCV JFH-2. 3毒株的全長基因組序列（編碼全長基因組RNA的核苷酸序 列） SEQ ID NO :5 :HCV JFH-2. 1毒株的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :6 :HCV JFH-2. 3毒株的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :7 :HCV J6CF毒株的結構區(包含核心、E1、E2和p7)的核苷酸序列 SEQ ID NO :8 :HCV JFH-I毒株的5' UTR的核苷酸序列 SEQ ID NO :9 :HCV JFH-I毒株的NS2區的核苷酸序列 SEQ ID NO :10 :HCV JFH-2. 1 毒株的范圍從 NS3 區到 3' UTR (包含 NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B區和3' UTR)的序列 SEQ ID NO :11 :嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. 1的核苷酸序列 SEQ ID NO :12 :嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S的核苷酸序列 SEQ ID NO :13 :突變型HCV基因組序列JFH-2. I A2218S的核苷酸序列 SEQ ID NO :14 :HCV JFH-2. 1毒株的前體蛋白質的NS3至NS5B區的氨基酸序列 SEQ ID NO :15 :HCV JFH-2. 3毒株的前體蛋白質的NS3至NS5B區的氨基酸序列 SEQ ID NOS :16-77 :引物 SEQ ID NO :78 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS)的核苷酸序列 SEQ ID NO :79 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (LP)的核苷酸序列 SEQ ID NO :80 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI)的核苷酸序列 SEQ ID NO :81 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)的核苷酸序 列 SEQ ID NO :82 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI)的核苷酸序 列 SEQ ID NO :83 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP)的核苷酸序 列 SEQ ID N0:84:突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S(CS/TI/LP)的核苷酸 序列 SEQ ID NO :85 :突變型嵌合 HCV 基因組序列 J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)的核 苷酸序列 SEQ ID NO :86 :突變型嵌合HCV基因組序列 J6/JFH-2. I A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/ TA)的核苷酸序列 SEQ ID N0:87:突變型嵌合 HCV 基因組序列 J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/ IV/KR)的核苷酸序列 SEQ ID NO :88 :由J6/JFH-2. I A2217S編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :89 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :90 :由J6/JFH-2. I A2217S (LP)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :91 :由J6/JFH-2. I A2217S (TI)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :92 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :93 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :94 :由J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :95 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/LP)編碼的前體蛋白質的氨基酸序列 SEQ ID NO :96 :由J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)編碼的前體蛋白質的氨基酸序 列 SEQ ID NO :97 :由 J6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)編碼的前體蛋白質的 氨基酸序列 SEQ ID NO :98 :由 J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)編碼的前體蛋白 質的氨基酸序列 本文引用的所有出版物、專利和專利申請整體引入本文作為參考。
[0128] [實施例] 本發明參考下述實施例進一步舉例說明。然而，這些實施例并不限制本發明的技術范 圍。
[0129] (實施例I) JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株衍生的HCV亞基因組復制子RNA表達載 體的構建 使用從暴發性肝炎患者中分離的基因型2a的HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的 全長基因組克隆DNA的非結構區，如下分開構建HCV亞基因組復制子RNA表達載體質粒 pSGR-JFH-2. 1 和 pSGR-JFH-2. 3(圖 1)。圖 IA 顯示了 HCV JFH-2. 1 毒株和 JFH-2. 3 毒株的 全長基因組結構。
[0130] 質粒 pSGR-JFH-2. 1 和 pSGR-JFH-2. 3 根據 Kato 等人的文獻（Gastroenterology， 125 :1808-1817,2003)和W005028652A1中所述的程序進行構建。具體地，首先，提供重組 質粒pJFH-2. 1和pJFH-2. 3,其中將編碼HCV JFH-2. 1毒株或JFH-2. 3毒株的全長基因組 的cDNA插入質粒載體pUC19中的T7啟動子的控制下。隨后，用新霉素抗性基因 （neo ;也 稱為新霉素磷酸轉移酶基因）和EMCV-IRES (腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點）置換 重組質粒pJFH-2. 1和pJFH-2. 3中的結構區和非結構區的部分。用限制酶執行切割，以 切除插入的片段，并且隨后將片段克隆到重組載體內，以分開構建質粒pSGR-JFH-2. 1和 pSGR-JFH-2. 3〇
[0131] 圖IB和圖IC顯示了質粒載體pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3的結構。在圖IB 和圖IC中，"T7"指示T7啟動子。T7啟動子是使用來自每種質粒載體的T7 RNA聚合酶的 HCV亞基因組復制子RNA表達所需的序列元件。在質粒載體pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3 中，5' UTR、NS3-NS5B編碼區和3' UTR是來自HCV JFH-2. 1或JFH-2. 3毒株的序列。此處， "neo"指示新霉素抗性基因，并且"EMCV IRES"指示腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點。 由這些載體表達的HCV亞基因組復制子RNA是由T7啟動子下游的區域轉錄的RNA，如圖ID 中所示。
[0132] 在pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3中由T7啟動子及其下游連接的HCV亞基因組 復制子RNA編碼區組成的核苷酸序列分別顯示于SEQ ID NOS :1和2中。
[0133] 此外，本文使用的HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的全長基因組序列分別顯示 于SEQ ID NOS :3和4中。由HCV JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的全長基因組序列編碼的病毒前 體蛋白質（多聚蛋白質）的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NOS :5和6中。SEQ ID NO :5中 所示的氨基酸序列由SEQ ID NO :3的核苷酸序列的核苷酸位置341 - 9445(包括終止密碼 子)編碼。在SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列由SEQ ID NO :4的核苷酸序列的核苷酸位 置341 - 9445 (包括終止密碼子)編碼。此外，HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的前體蛋 白質中的NS3至NS5B區的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID N0:14和15中。SEQ ID N0:14 的氨基酸序列（NS3-NS5B區）對應于SEQ ID NO :5的氨基酸位置1032 - 3034。此外，SEQ ID NO :15的氨基酸序列（NS3-NS5B區）對應于SEQ ID NO :5的氨基酸位置1032 - 3034。 此處，如圖IB和圖IC中所示，雖然HCV JFH-2. 1毒株的前體蛋白質（SEQ ID NO :5)的氨基 酸位置1205 - 1206 (在NS3區中）的序列是丙氨酸（A)-異亮氨酸（I)，但HCV JFH-2. 3毒 株的前體蛋白質（SEQ ID NO :6)的氨基酸位置1205 - 1206 (在NS3區中）的序列是甲硫 氨酸(M)-亮氨酸（L)。
[0134] (實施例2) HCV亞基因組復制子RNA的制備 對于HCV亞基因組復制子RNA的制備，將如實施例1中所述構建的表達載體 pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3各自用限制酶油<3 I進行切割，從而制備模板DNA用于PCR。 隨后，在將綠豆核酸酶（Mung Bean Nuclease)20 U (反應溶液總體積：50 μ 1)加入10 μ g -20 yg模板DNA中用于酶處理后，將這些油a I切割片段各自在30°C溫育30分鐘。綠豆 核酸酶是催化使雙鏈DNA的單鏈部分選擇性地降解和成為平端的反應的酶。一般而言，當 通過直接使用上述油a I切割片段作為模板用RNA聚合酶進行RNA轉錄時，其中已在3'末 端加入對應于I識別序列的部分的額外CUGAU個核苷酸)的復制子RNA得以合成。此 處，在本實施例中，用綠豆核酸酶處理油a I切割片段，從而從油a I切割片段中去除CUGA 的4個核苷酸。
[0135] 接下來，對包含油a I切割片段用綠豆核酸酶處理的溶液實施根據常規方法的蛋 白質去除處理，以純化CUGA的4個核苷酸已從其中去除的油a I切割片段用于在接下來的 反應中用作模板DNA。根據該模板DNA，使用MEGAscript (Ambion)通過基于T7啟動子的 轉錄反應在體外合成RNA。具體地，根據制造商的說明書，制備包含0.5 yg- 1.0 yg模 板DNA的20 μ 1反應溶液，隨后在37°C反應3 - 16小時。
[0136] 在RNA合成完成后，將DNA酶（2U)加入反應溶液中用于在37°C反應15分鐘， 以去除模板DNA。使用酸性苯酚進一步執行RNA提取，從而獲得由pSGR-JFH-2. 1和 pSGR-JFH-2. 3轉錄的HCV亞基因組復制子RNAs。
[0137] (實施例3) HCV亞基因組復制子復制細胞克隆的建立 通過常規方法，使來自實施例2中制備的JFH-2. 1毒株或JFH-2. 3毒株的各（1 μ g)合 成HCV亞基因組復制子RNA與從Huh7細胞中提取的總細胞RNA混合，以將RNA總量調整至 10 μ g。隨后，通過電穿孔將混合RNA引入Huh7細胞內。將電穿孔的Huh7細胞種植在培 養皿上，并且培養16 - 24小時，并且隨后將G418(新霉素）加入培養皿中。隨后，繼續培 養，同時每周替換培養基2次。在種植后培養21天后，用結晶紫染色活細胞。作為結果，如 圖2中所示，對于來自JFH-2. 1或JFH-2. 3毒株的復制子RNA已引入其內的細胞，可以證實 集落形成。集落形成指示HCV亞基因組復制子RNA已在細胞中復制。
[0138] 關于對于其證實集落形成的上述復制子RNA轉染的細胞，將活細胞的集落在培養 21天后由上述培養皿進一步克隆，并且隨后繼續培養。通過此類集落克隆可以建立多個細 胞克隆品系。將所得到的這些細胞克隆指定為JFH-2. 1亞基因組復制子細胞和JFH-2. 3亞 基因組復制子細胞。認為所引入的JFH-2. 1毒株衍生的亞基因組復制子RNA或JFH-2. 3毒 株衍生的亞基因組復制子RNA在如此建立的細胞克隆中自我復制。
[0139] (實施例4)在JFH-2. 3亞基因組復制子細胞中的復制子RNA的序列分析 對于實施例3中建立的JFH-2. 3亞基因組復制子細胞中存在的亞基因組復制子 RNA進行序列分析。首先，從建立的JFH-2. 3亞基因組復制子細胞的10個克隆中提取 總RNA，并且隨后通過RT-PCR擴增其中包含的HCV亞基因組復制子RNA。對于擴增， 5'-TAATACGACTCACTATAG-3'（SEQIDN0 :16)和5'-GCGGCTCACGGACCTTTCAC-3'（SEQID NO :17)用作引物。將所得到的擴增產物克隆到測序克隆載體內，并且隨后通過常規方法實 施序列分析。
[0140] 作為結果，在從細胞內獲得的亞基因組復制子RNA中，發現引起在NS3區中的4 個位置(在位置1205上的M - K、在位置1548上的F - L、在位置1615上的C - W和在位 置1652上的T - N)、在NS5A區中的5個位置(在位置2196上的A - T、在位置2218上的 A - S、在位置2223上的H - Q、在位置2281上的Q - R和在位置2373上的G - S)、在NS5B 區中的1個位置(在位置2519上的K - N)(這在非結構區中）的氨基酸置換的核苷酸置換 (圖3)。這些氨基酸置換中的大多數存在于NS3區或NS5A區內，如上所述。這些氨基酸置 換的位置基于JFH-2. 3毒株的前體蛋白質的全長氨基酸序列（SEQ ID NO :6)進行描述。此 夕卜，在克隆2的位置2218上和在克隆3的位置2223上的氨基酸置換在ISDR區（干擾素敏 感性決定區）內發生（圖3)。在JFH-2. 1/2. 3毒株的前體蛋白質的氨基酸序列（SEQ ID NO: 6)中，ISDR區對應于位置2214 - 2249。
[0141] (實施例5)在JFH-2. 3亞基因組復制子細胞中的HCV亞基因組的突變分析 為了檢查在實施例4中發現的核苷酸突變是否影響亞基因組復制子RNA在細胞中的復 制，將引起在NS3區內的3個位置(在位置1548上的F - L、在位置1615上的C - W和在位 置1652上的T - N)和在NS5A區內的3個位置(在位置2218上的A - S、在位置2223上的 H - Q和在位置2281上的Q - R)上的氨基酸置換的核苷酸置換各自引入在實施例1中制 備的HCV JFH-2. 1毒株衍生的亞基因組復制子RNA表達質粒載體內（圖4A)。
[0142] 具體地，首先，將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2毫摩爾（mM) dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 微摩爾（μ M)引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3' (SEQIDN0:18))和 1548FL-R(5，-GGGCGTGTTGAGATACGCTCTAAGCCTGAC-3，（SEQIDN0: 19))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環 由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號1。 接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5563-R (5，-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3,（SEQ ID NO :20))和 1548FL-F (5， -TTAGAGCGTATCTCAACACGCCCGGCCTAC-3'（SEQ ID NO :21))，并且隨后加入去離子水以使總量 最終達到49.5 μ 1。其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、1分 30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號2。
[0143] 使這些PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號1和PCR產物 編號2的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQ ID NO :18)) 和 5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3，（SEQ ID N0:20))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)， 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號3。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0144] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號3用限制酶feoR I和feoT22 I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置1548上的氨基酸置換F - L的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 F1548L。
[0145] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各lμl的10μM引物EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQIDN0 :18))和 1615CW-R (5'-AGTCGGGCCAGCCACTTCCACATGGCGTCC-3，（SEQ ID N0:22))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號4。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3'（SEQIDN0:20))和1615CW-F(5'-ATGTGGAAGTGGCTGGCC CGACTCAAGCCT-3'（SEQIDN0 :23))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執 行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產物指定為PCR產物編號5。
[0146] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號4和PCR產物編 號5的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQ ID NO :18)) 和 5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3，（SEQ ID N0:20))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號6。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0147] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號6用限制酶feoR I和feoT22 I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置1615上的氨基酸置換C - W的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 C1615W。
[0148] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各lμl的10μM引物EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQIDN0 :18))和 1652TN-R (5'-CTTGCATGCAATTGGCGATGTACTTCGTCC-3，（SEQ ID N0:24))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號7。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3'（SEQIDN0:20))和 1652TN-F(5'-GTACATCGCCAATTGCAT GCAAGCTGACCT-3'（SEQIDN0:25))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執 行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產物指定為PCR產物編號8。
[0149] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號7和PCR產物編 號8的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQ ID NO :18)) 和 5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3，（SEQ ID N0:20))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號9。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0150] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號9用限制酶feoR I和feoT22 I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置1652上的氨基酸置換T - N的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 T1652N。
[0151] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2196AT-R (5'-TGATCCCCGTGTCAAGCGCCGCGCCGCAGT-3，（SEQ ID N0:27))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號10。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5，-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和2196AT-F(5，-CGCGGCGCTTGACACGGG GATCACCTCCAT-3'（SEQIDN0 :29))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執 行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產物指定為PCR產物編號11。
[0152] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號10和PCR產物編 號11的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F(5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號12。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0153] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號12用限制酶feoT22 I和/?/ I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2196上的氨基酸置換A - T的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 A2196T。
[0154] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2218AS-R (5'-GGTGCAGGTGGACCGCAGCGACGGTGCTGA-3，（SEQ ID N0:30))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號13。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5，-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和2218AS-F(5，-CCGTCGCTGCGGTCCACC TGCACCACCCAC-3'（SEQIDN0 :31))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執 行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產物指定為PCR產物編號14。
[0155] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號13和PCR產物編 號14的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F (5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3,（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)， 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號15。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0156] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號15用限制酶feoT22 I和/?/ I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2218上的氨基酸置換A - S的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 A2218S。
[0157] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2223HQ-R (5'-TAGGTGTTGCTTTGGGTGGTGCAGGTGGCC-3，（SEQ ID N0:32))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號16。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和 2223HQ-F(5'-CTGCACCACCCAAAGCAA CACCTATGACGT-3'（SEQIDN0:33))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執 行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產物指定為PCR產物編號17。
[0158] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號16和PCR產物編 號17的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F(5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號18。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0159] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號18用限制酶feoT22 I和/?/ I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2223上的氨基酸置換H - Q的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 H2223Q。
[0160] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ? 的 10 μΜ 引物 5162-F (5，-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3，（SEQ ID NO:26)) 和 2281QR-R (5, -TGGGAATTGTTTCTCGGGG-3'（SEQ ID NO :35))，并且隨后加入去離子 水以使總量最終達到49.5 μ 1。其后，向其中加入0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、 15秒和72 °C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號X。接下來， 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1 的 10 μΜ 引物 7827-R (5, -AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID NO :28))和 2281QR-F (5'-TACTTGATCCCCGAGAAAC-3，（SEQ ID N0:34))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達 到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執 行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組 成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號Y。
[0161] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號X和PCR產物編 號Y的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F(5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號Z。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0162] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產物編號Z用限制酶feoT22 I和/?/ I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2281上的氨基酸置換Q - R的核苷酸置換的重組表達載體指定為pSGR-JFH-2. 1 Q2281R。
[0163] 將這些質粒用油a I進行切割，并且隨后實施酚氯仿提取和乙醇沉淀。使用因而 切割的質粒作為模板和MEGAscript T7試劑盒（Ambion)合成每種HCV RNA。
[0164] 通過電穿孔將如上所述獲得的突變型JFH-2. 1衍生的亞基因組復制子RNA (3 μ g)引入Huh7細胞內。將電穿孔的Huh7細胞種植在培養皿上，并且培養16 - 24小時， 并且隨后將G418 (新霉素）加入培養皿中。隨后，繼續培養，同時每周替換培養基2次。在 種植后培養21天后，用結晶紫染色活細胞（圖4B)。作為結果，雖然在不含突變的JFH-2. 1 衍生的亞基因組復制子RNA已引入其內的細胞（圖4B，上）中無法觀察到集落形成，但在引 入突變的亞基因組復制子RNA已引入其內的細胞中明確觀察到集落形成。特別地，在位置 2218上具有A - S突變的亞基因組復制子RNA發揮顯著增加的集落形成能力，指示高復制 子復制能力的獲得。因此，證實如上所述在HCV前體蛋白質中發現的這些氨基酸突變，特別 是在位置2218上的A - S氨基酸突變(在下文中也稱為A (2218)S)，增強HCV亞基因組復 制子RNA的復制。
[0165] (實施例 6)表達載體 pJ6/JFH-2. 1 和 pJ6/JFH-2. I A2218S 的構建 為了評估通過使用如上文實施例中獲得的基于JFH-2. 1毒株衍生的突變型HCV基因組 序列的復制子RNA是否可以在培養細胞中產生HCV顆粒，構建表達具有全長HCV基因組序 列的復制子RNA (HCV全基因組復制子RNA)的質粒載體。
[0166] 具體地，參考J6/JFH-1嵌合HCV基因組能夠有效產生HCV顆粒的報道 (Lindenbach 等人，Science (2005) 309,第 623-626 頁)，使用另一種 HCV 毒株，JFH-I 毒株 (基因型2a)衍生的5'UTR序列（SEQIDN0:8)、J6CF毒株(基因型2a)衍生的結構區的序 列（包含核心、E1、E2和p7區的序列；SEQ ID NO :7)、JFH-1毒株衍生的NS2區（SEQ ID NO : 9)、和范圍為NS3區到3' UTR的JFH-2. 1毒株衍生的序列（包含NS3、NS4A、NS4B、NS5A和 NS5B區和3' UTR ;SEQ ID NO : 10)以這個次序進行連接，以形成嵌合HCV基因組序列J6/ JFH-2. I (SEQ ID N0:11)(圖5B)。隨后，將嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. 1摻入質粒 PUC19中的T7啟動子的控制下，從而構建重組表達載體pJ6/JFH-2. 1，如下所述。通過將在 實施例5中證實增加復制子復制效率的NS5A區內的A (2218) S突變引入到J6/JFH-2. 1 內，制備表達突變型復制子J6/JFH-2. I A2217S的載體pJ6/JFH-2. I A2217S (圖5B)。J6/ JFH-2. I A2217S的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :12中。在SEQ ID NO :12的序列中，在 J6/JFH-2. I (SEQ ID NO :11)的核苷酸位置6989上的G變成T，從而引入在位置2217上從 A到S的氨基酸突變。通過根據先前報道的程序執行構建（Wakita，T等人，Nat Med.，11 : 791-796,2005)。由J6/JFH-2.1 A2217S的全長基因組序列編碼的前體蛋白質的氨基酸序 列顯示于SEQ ID NO :88中。在SEQ ID NO :5中所示的JFH-2. 1全長氨基酸序列中在位置 2218上的氨基酸是丙氨酸（A)，并且定位于這個位置上的丙氨酸與嵌合HCV J6/JFH2. 1的 全長氨基酸序列中在位置2217上的丙氨酸比對。即，在由J6/JFH-2. I A2217S的全長基因 組核苷酸序列（SEQ ID NO :12)編碼的蛋白質中，在位置2217上的丙氨酸由絲氨酸（S)置 換。在這種情況下，這個置換也對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6中所示的氨基 酸序列定義的氨基酸置換A (2218) S。僅因為方便的原因，突變型復制子的名稱已從先前 名稱J6/JFH-2. I A2218S變成J6/JFH-2. I A2117S，并且因此它們指的是相同復制子。編碼 突變型復制子的表達載體的名稱也類似地變成PJ6/JFH-2. I A2117S。
[0167] 具體地，將pJ6/JFH_2. 1 用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ?的10 X緩沖液和4 μ?的2mMdNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2218AS-R (5'-GGTGCAGGTGGACCGCAGCGACGGTGCTGA-3，（SEQ ID N0:30))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號19。接下來，將pJ6/JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5，-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和2218AS-F(5，-CCGTCGCTGCGGTCCACC TGCACCACCCAC-3'（SEQIDN0 :31))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執 行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產物指定為PCR產物編號20。
[0168] 使這些PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號19和PCR產 物編號20的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩沖液和 4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F (5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3,（SEQ ID NO : 26))和 7827-R(5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQ ID NO :28))，并且加入去離子水以使總 量最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號21。使PCR產物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0169] PJ6/JFH-2. 1和純化的PCR產物編號21用限制酶feoT22 I和/?/ I進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有 引起在位置2218上的氨基酸置換A - S的核苷酸置換的重組表達載體指定為pJ6/JFH-2. 1 A2217S。
[0170] (實施例7)J6/JFH-2. 1和J6/JFH-2. I A2217S RNA已引入其內的細胞中的HCV復 制子復制能力的評估 使用實施例6中構建的表達載體pJ6/JFH-2. 1和pJ6/JFH-2. I A2217S，通過類似于實 施例2中那些的程序制備HCV復制子RNA (嵌合HCV全基因組復制子RNA)。將因而獲得的 HCV 復制子 RNAs，J6/JFH-2. I HCV RNA 和 J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA 各自通過電穿孔引 入Huh7細胞內。在引入后，在電穿孔后4、12、24、48、72和96小時時收集細胞，并且隨后使 用HCV抗原ELISA測試試劑盒（Ortho Clinical Diagnostics)定量細胞中包含的HCV核 心蛋白質，并且從而評估細胞中的HCV復制子復制能力（圖6)。
[0171] 作為結果，發現J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內的細胞中的核心蛋白質 的量在引入后48小時時和其后增加，指示細胞中的HCV復制子的有效復制。相比之下，即使 在引入后96小時時也未發現J6/JFH-2.1 HCV RNA已引入其內的細胞中的核心蛋白質的量 增加。上述結果證實在NS5A區中在位置2218上的A - S突變對于細胞中嵌合HCV復制子 RNA的有效復制也是重要的。此處，"位置2218"意指如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6 中所示的氨基酸序列定義的突變位置，并且突變的嵌合HCV的全長氨基酸序列中的相應突 變是在位置2217上的A - S突變。
[0172] (實施例8) J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內的細胞中的HCV顆粒生產能 力的評估 在培養基（Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM) -10 %胎牛血清）中以類似于實施例7 中那種的方式傳代培養J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內的Huh7細胞時，使用HCV 抗原ELISA測試試劑盒（Ortho Clinical Diagnostics)隨著時間過去定量培養上清液中 包含的HCV核心蛋白質，以證實HCV顆粒的產生（圖7)。
[0173] 作為結果，雖然在HCV復制子RNA引入后60天在培養上清液中幾乎未證實核心蛋 白質，但發現核心蛋白質的量在引入后60天-80天時增加。在80天后，核心蛋白質以幾 乎恒定的水平檢測到。這些結果證實當細胞在向其中引入RNA后傳代培養時，J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA使得產生能夠細胞外釋放的病毒顆粒。
[0174] (實施例9) J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒的感染性的評估 檢查 J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA衍生的HCV顆粒(在下文中，稱為 J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒）是否具有感染性，所述HCV顆粒的產生在實施例8中加以證實。首先，類似于上 述實施例，通過電穿孔將J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA引入Huh7細胞內，并且隨后執行傳 代培養。將在引入細胞內后第88天時的培養上清液加入首次用于實驗的（naive) Huh7細 胞內。在72小時后，通過病灶（focus)形成測定來測定HCV感染細胞的數目，并且計算感 染效價（圖8)。
[0175] 作為結果，發現感染效價是5. 21 X IO3集落形成單位（ffu)/ml。將該值除以培 養上清液中的HCV核心的量（3. 96 X IO3飛摩爾/升（fmol/L))。因此，感染效價/單位 HCV蛋白質計算為1. 32 (感染效價/核心值)。
[0176] 結果證實經由J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA引入細胞內產生的HCV顆粒具有感染 性。
[0177] (實施例10) JFH-2. 1和JFH-2. I A2218S HCV全基因組復制子RNA表達載體的構 建 構建表達具有JFH-2. 1毒株的全長基因組序列的復制子RNA(HCV全基因組復制子RNA (圖9A))的質粒載體pJFH-2. 1，所述復制子RNA包括5' UTR區、結構區(核心、E1、E2和p7 區）、非結構區（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B區）和3' UTR區，以便評估使用JFH-2. 1 毒株的HCV基因組RNA在培養細胞中是否可以產生HCV顆粒，其基于證實嵌合HCV全基因 組復制子J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA使得能夠產生感染性HCV顆粒的實施例6-9的結果 進行。
[0178] 此外，將在實施例7-9中證實對于J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV復制子RNA的細 胞內復制或由其產生感染性HCV顆粒重要的在NS5A區中在位置2218上的A - S突變以類 似于實施例6中那種的方式引入JFH-2. 1基因組序列內。構建表達突變型全基因組復制 子JFH-2. I A2218S的載體pJFH-2. I A2218S (圖9B)。通過根據先前報道的程序執行構建 (Wakita，T 等人，Nat Med，（2005))。JFH-2. I A2218S 的核苷酸序列顯示于 SEQ ID NO : 13中。在SEQ ID N0:13的序列中，A2218S氨基酸突變已通過在JFH-2. I (SEQ ID N0:3) 的核苷酸位置6992上的G至T的改變引入。
[0179] (實施例11) JFH-2. I A2218S HCV RNA已引入其內的細胞中的HCV顆粒生產能力 的評估 使用實施例10中構建的表達載體pJFH-2. I A2218S，通過類似于實施例2中那些的技 術制備HCV復制子RNA(突變型HCV全基因組復制子RNA)。將因而獲得的HCV復制子RNA， JFH-2. I A2218S HCV RNA，通過電穿孔引入Huh7細胞內。其后，在培養基(含10%胎牛血清 的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM))中傳代培養細胞時，使用HCV抗原ELISA測試試劑 盒（Ortho Clinical Diagnostics)隨著時間過去定量培養上清液中包含的HCV核心蛋白 質，以證實HCV顆粒的產生（圖10)。
[0180] 作為結果，在HCV復制子RNA引入后40天在培養上清液中幾乎未證實核心蛋白 質。然而，發現核心蛋白質的量在引入后40 - 60天后增加。在60天時和其后，核心蛋白 質以幾乎恒定的水平檢測到。這些結果證實在RNA引入細胞內后傳代培養細胞時，JFH-2. 1 A2218S HCV RNA使得產生能夠細胞外釋放的病毒顆粒。
[0181] (實施例12) JFH-2. I A2218S HCV顆粒的感染性的評估 檢查 JFH-2. I A2218S HCV RNA 衍生的 HCV 顆粒(在下文中，稱為 JFH-2. I A2218S HCV 顆粒)是否具有感染性，所述HCV顆粒的產生在實施例11中加以證實。首先，類似于上述實 施例，通過電穿孔將JFH-2. I A2218S HCV RNA引入Huh7細胞內，并且隨后執行傳代培養。 將在引入細胞內后第63天時的培養上清液加入首次用于實驗的Huh7細胞內。在72小時 后，通過病灶形成方法來測定HCV感染細胞的數目，并且計算感染效價（圖11 )。
[0182] 作為結果，感染效價是4. 32 X IO4 ffu/ml。將該值除以培養上清液中的HCV核 心的量（1.17 X IO4 fmol/L)。因此，感染效價/單位HCV蛋白質計算為3.69 (感染效價 /核心值)。結果證實通過JFH-2. I A2218S HCV RNA引入細胞內產生的HCV顆粒具有感染 性，并且發現感染效價/單位蛋白質高于J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒。
[0183] (實施例13)關于得自J6/JFH-2. I A2217S RNA復制細胞的傳代培養的核苷酸序 列的突變分析 以0. 03的moi (感染復數）用Huh-7細胞（J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內 的Huh-7細胞，其包含在實施例8中獲得的具有高感染效價的J6/JFH-2. I A2217S HCV顆 粒）的培養上清液感染新鮮的未感染的Huh-7細胞。對受感染細胞進行傳代培養，直至培 養上清液中核心蛋白質的量和感染效價分別達到1，〇〇〇 fmol/L和1，000 ffu/ml或更多。 用包含病毒的培養上清液的感染并使受感染細胞的傳代培養重復3 - 4次，并且隨后對于 培養上清液中包含的HCV RNA進行序列分析。采用2個感染系，并且將其分別指定為4A和 4B。首先，從感染系4A和4B的包含J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒的Huh-7細胞的每種培 養上清液中提取RNA，并且隨后通過RT-PCR擴增其中包含的HCV RNA。將隨機引物（6聚體 (6 mer)，Takara Bio Inc.)用于擴增。將擴增產物克隆到測序克隆載體內，并且隨后通過 常規方法實施序列分析。
[0184] 作為結果，在感染系4A的情況下，發現引起在7個位置上的氨基酸置換的核苷酸 置換：在處于結構區中的E2區中的2個位置(在位置405上的M - K和在位置417上的 N - T);以及在處于非結構區中的NS2區中的1個位置(在位置868上的M - T)、NS3區中 的1個位置(在位置1642上的T -A)、NS4B區中的1個位置（在位置1722上的I - V)、 NS5A區中的1個位置(在位置2204上的S - G)、和NS5B區中的1個位置(在位置2695上 的T - I)。此外，在感染系4B的情況下，發現引起在8個位置上的氨基酸置換的核苷酸置 換：在處于結構區中的核心區中的1個位置(在位置148上的A - T)、El區中的1個位置 (在位置356上的M - V)、E2區中的1個位置(在位置626上的V - G);以及在處于非結構 區中的NS4A區中的1個位置(在位置1687上的I - V)、NS4B區中的1個位置(在位置1767 上的K - R)、NS5A區中的1個位置(在位置2219上的C - S)、和NS5B區中的2個位置(在 位置2695上的T - I和在位置3016上的L - P)。此外，在本實施例和下述實施例中所示 的氨基酸突變的位置指示在相關突變型氨基酸序列中的位置。
[0185] (實施例14)J6/JFH-2. I A2217S衍生的突變型HCV全基因組RNA表達載體的構建 通過將實施例13中獲得的突變的各種組合引入質粒pJ6/JFH-2. I A2217S內來制備 質粒，以便證實在實施例13中發現的突變是否是適應性突變。具體地，將pJ6/JFH-2. 1 A2217S 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附 帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引 物 2219CS-S (5，-GCGTTCCACCAGTGCCACCCACGGCACGGC-3，（SEQ ID 勵：36))和 80351?-2& (5'-CCACACGGACTTGATGTGGT-3，（SEQ ID NO:37))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且 執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、30秒組 成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號22。接下來，將pJ6/JFH-2. 1用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩 沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物6586S-IH(5'-CAAGACCGC CATCTGGAGGGTGGCGGCCTC-3'（SEQ ID NO :38))和 2219CS-R(5'-GGTGGCACTGGTGGAACGCAGCG ACGGGGC-3'（SEQIDN0:39))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49.5μl。其后， 向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執行 25 個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的PCR 產物指定為PCR產物編號23。
[0186] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號22和PCR產物編 號23的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 6586S-IH(5'-CAAGACCGCCATCTGGAGGGTGGCGGCCTC-3'（SEQ IDN0:38))和 8035R-2a(5'-CCACACGGACTTGATGTGGT-3'（SEQIDN0:37))，并且加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行25個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、2分鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號24。使PCR產物純化且隨 后溶解于30 μ I H2O中。
[0187] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產物編號24用限制酶財/7 I和/?/ I進行消 化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片 段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得 的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S(對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO : 6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置2219上的C - S的核 苷酸置換的重組表達載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S(CS)。克隆到pJ6/JFH-2. I A2217S (CS)內的突變型HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :78中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :89 中。
[0188] 接下來，將 pJ6/JFH-2· I A2217S 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 9124S-IH(5'-TTCAGCCCTCAGAAAACTTGGGGCGCCACC-3'（SEQ IDN0:40))和3016LR-R(5，-GGAGTAGGCTAgGGAGTAACAAGCGGGGTC-3，（SEQIDN0 :41))， 并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行25個循環，其中每個循環由98°C、 10秒，55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號25。接 下來，將 PJ6/JFH-2.1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ I 的10μM引物3016LP-S(5，-TTGTTACTCCCTAGCCTACTCCTACTCTTT-3'（SEQIDN0:42))和 M13R (5'-AACAGCTATGACCATG-3，（SEQ ID NO:43))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且 執行PCR。PCR執行25個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒 組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號26。
[0189] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號25和PCR產物編 號26的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混 合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 9124S-IH (5, -TTCAGCCCTCAGAAAACTTGGGGCGCCACC-3' (SEQIDN0:40))和M13R(5'-AACAGCTATGACCATG-3'（SEQIDN0 :43))，并且加入去離 子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行25個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、2分鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號27。使PCR產物純化且隨 后溶解于30 μ I H2O中。
[0190] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產物編號27用限制酶feoR V和油a I進行消 化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片 段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得 的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S(對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO : 6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置3016上的L - P的核 苷酸置換的重組表達載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S(LP)。克隆到pJ6/JFH-2. I A2217S (LP)內的突變型HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (LP)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :79中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :90 中。
[0191] 接下來，將通過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4B的HCV RNA制備的cDNA 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7993S-IH (5'-CAGCTTGTCCGGGAGGGC-3'（SEQ ID NO :44))和8892R-2a(5'-AGCCATGAATTGATAGGGGA-3' (SEQ ID NO :45))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執行 30 個循環，其中 每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產 物編號28。
[0192] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產物編號28用限制酶fci/36 I和分/ I進行 消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA 片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲 得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對應于如使用用作參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置2695上的T - I 的核苷酸置換的重組表達載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S(TI)。克隆到pJ6/JFH-2. 1 A2217S (TI)內的突變型HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI)的核苷酸序列顯示 于SEQ ID NO :80中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :91 中。
[0193] 接下來，將 pJ6/JFH-2· I A2217S 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 450S-IH (5'-TGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGC-3,（SEQ IDN0:46))和148AT-S(5，-GAGAGCTCTGGtGACGCCGCCGAGCGGGGC-3，（SEQIDN0 :47))，并 且隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0. 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行25個循環，其中每個循環由98°C、10秒， 55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號29。接下來，將 PJ6/JFH-2.1 用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES) 附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引 物 148AT-R (5，-GGCGGCGTCaCCAGAGCTCTCGCGCATGGC-3， （SEQ ID Ν0:48))和 1440R-IH (5'-GCTCCCTGCATAGAGAAGTA-3，（SEQ ID Ν0:49))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且 執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒 組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號30。
[0194] 使PCR產物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產物編號29和PCR產物編 號30的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 450S-IH (5'-TGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGC-3,（SEQ IDN0:46))和 1440R-IH(5'-GCTCCCTGCATAGAGAAGTA-3'（SEQIDN0:49))，并且加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行25個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、2分鐘組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號31。使PCR產物純化且隨 后溶解于30 μ I H2O中。
[0195] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產物編號31用限制酶C/a I和fciw I進行消 化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片 段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得 的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S(對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO : 6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置148上的A - T的核 苷酸置換的重組表達載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S (AT)。
[0196] 類似地，構建重組表達載體 PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)、PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (CS/TI/LP)和 pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)。此外，通過將上述氨基酸突變以各種組合引入J6/JFH-2. I A2217S 的全長氨基酸序列內構建這些載體。克隆到PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)、pJ6/JFH-2. 1 A2217S (CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (CS/TI/LP)和 pJ6/ JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)載體內的突變型 HCV 全基因組序列 J6/JFH-2. I A2217S (CS/LP),J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI),J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP),J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/LP)和 J6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP)的核苷酸序列分別顯示于 SEQ ID NOS : 81、82、83、84和85中。由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質的氨基酸序列分別顯示 于 SEQ ID NO :92、93、94、95 和 96 中。
[0197] 如下制備感染系4A的所有突變已引入其內的病毒復制子。首先，將通 過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的cDNA用作模板，力口 入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 1〇\緩沖液和4 41的2禮（1階13混合物，以及各141的1〇4]\1引物20995-2& (5，-ACGGACTGTTTTAGGAAGCA-3，（SEQ ID NO :50))和3509R-2a(5，-TCTTGTCGCGCCCCGTCA-3' (SEQ ID NO :51))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中 加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行 PCR。PCR 執行 35 個 循環，其中每個循環由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、20秒組成。將所得到的PCR產 物用作模板，力口入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附 帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M 引物 2285S-2a (5, -AATTTCACTCGTGGGGATCG-3，（SEQ ID NO :52))和 3280R-IH (5'-TGACCTTCTTCTCCATCGGACTG-3，（SEQ ID N0:53))，并且隨后加入去離子水以使總量最 終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES)，并且 執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、20秒組成。 將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號32。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI)和純化的PCR產 物編號32用限制酶幻μ I和III進行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段 分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合， 并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸 置換A - S)、在位置2695上的T - I和在位置868上的M - T的核苷酸置換的重組表達載 體指定為 PJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/MT)。
[0198] 接下來，將通過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的 包含引起在位置405上的M - K突變和在位置417上的N - T突變的核苷酸置換的 cDNA 用作模板，力[]入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES) 附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μΜ 引物 2099S-2a (5, -ACGGACTGTTTTAGGAAGCA-3'（SEQ ID NO :50))和 3509R_2a (5'-TCTTGTCGCGCCCCGTCA-3，（SEQ ID N0:51))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達到49.5 μ 1。其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并 且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、20 秒組成。將PCR產物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1 的 10 μ M 引物 2285S-2a (5, -AATTTCACTCGTGGGGATCG-3'（SEQ ID NO :52))和 3280R-IH (5'-TGACCTTCTTCTCCATCGGACTG-3，（SEQ ID N0:53))，并且隨后加入去離子水以使總量最 終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并 且執行PCR。PCR執行40個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、20秒組 成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號33。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT)和純化 的PCR產物編號33用限制酶幻奶I進行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段 分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合， 并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸 置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置868上的M - T、在位置405上的M - K和在 位置417上的N - T的核苷酸置換的重組表達載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/ MK/NT)。
[0199] 接下來，將通過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的包含引起 在位置1722上的I - V突變的核苷酸置換的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物， 以及各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 4547S-2a (5, -AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3'（SEQ ID NO :54)) 和 7677R-IH (5'-TATGACATGGAGCAGCACAC-3，（SEQ ID N0:55))，并且隨后加入去離子水以 使總量最終達到49.5 μ 1。其后，向其中加入0.5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、30秒，60°C、30秒和 72°C、3分鐘組成。將PCR產物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μΜ 引物 4607S-IH (5，-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3，（SEQ ID 勵：56))和72141?-呢 (5'-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3，（SEQ ID N0:57))，并且隨后加入去離子水以 使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、30秒，60°C、30秒和 72°C、2分30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號34。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT)和純化的PCR產物編號34用限制酶通ο I和財/7 I進行消化。通過瓊脂糖 凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在 位置2217上的氨基酸置換A-S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸 序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置868上的 M - T、在位置405上的M - K、在位置417上的N - T和在位置1722上的I - V的核苷酸 置換的重組表達載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV)。
[0200] 接下來，將通過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的包含引起 在位置2204上的S -G突變的核苷酸置換的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合物，以 及各 1 μ? 的 10 μΜ 引物 6499S-NS (5'-TAAGACCTGCATGAACACCTGGCAGGGGAC-3，（SEQ ID N0:58))和3'X-8077R-IH(5'-ACATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGG-3'（SEQIDN0 :59))，并 且隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0. 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc·)，并且執行PCR15PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、 30秒，60°C、30秒和72°C、3分鐘組成。將PCR產物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合物，以 及各1 μ? 的 10 μΜ 引物 6698S-NS (5'-ATACCATCTCCAGAGTTCTTTTCCTGGGTA-3，（SEQ ID N0:60))和3'X-75R-2a(5'-TACGGCACCTCTCTGCAGTCA-3'（SEQIDN0 :61))，并且隨后加入 去離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)，并且執行PCR15PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、30秒，60°C、 30秒和72°C、2分30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號35。pJ6/JFH-2. 1 A2217S (TI/MT/MK/NT/IV)和純化的PCR產物編號35用限制酶財/7 I和/?/ 1進行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具 有引起在位置2217上的氨基酸置換A -S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6 的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置 868上的M - T、在位置405上的M - K、在位置417上的N - T、在位置1722上的I - V和 在位置2204上的S - G的核苷酸置換的重組表達載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/ MT/MK/NT/IV/SG)。
[0201] 接下來，將通過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的包含引起 在位置1642上的T - A突變的核苷酸置換的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合物，以 及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 4547S-2a (5,-AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3'（SEQ ID NO :62))和 7677R-IH(5'-TATGACATGGAGCAGCACAC-3'（SEQ ID NO :63))，并且隨后加入去離子水以使總 量最終達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES), 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、30秒，60°C、30秒和72°C、3分鐘 組成。將PCR產物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附 帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物 4607S-IH(5'-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3'（SEQIDN0:64)^P7214R-NS(5'-CAG GCCGCGCCCAGGCCGGCMGGCTGGTG-3'（SEQ ID NO :65))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)， 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、30秒，60°C、30秒和72°C、2分30 秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號36。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/ NT/IV/SG)和純化的PCR產物編號36用限制酶通〇 I進行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每 種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置2217上的 氨基酸置換A - S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位 置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置868上的M - T、在位置 405上的M - K、在位置417上的N - T、在位置1722上的I - V、在位置2204上的S - G 和在位置1642上的T - A的核苷酸置換的重組表達載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S(TI/ MT/MK/NT/IV/SG/TA)。克隆到 pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)內的突變型 HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :86中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :97中。因此，在感染系4A中發現的所有氨基酸突變都引入由J6/JFH-2. I A2217S(TI/ MT/MK/NT/IV/SG/TA)編碼的突變型前體蛋白質內。
[0202] 如下制備感染系4B的所有突變已引入其內的病毒。首先，將通過逆轉錄由實 施例13中獲得的感染系4B的HCV RNA制備的包含在位置356上的M - V和在位置626 上的V -G突變的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的 10 μΜ 引物 44S-IH (5, -CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3，（SEQ ID NO:66))和 3189R-IH (5'-CCAGTCCACCTGCCAAGG-3，（SEQ ID NO:67))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達 到 49.5 μ 1。其后，向其中加入 0.5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)， 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由95 °C、30秒，60°C、30秒和72 °C、 3分鐘組成。將PCR產物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的 10 μ M 引物 63S-Con. 1 (5, -TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3'（SEQ ID NO :68))和 2445R-2a (5'-TCCACGATGTTTTGGTGGAG-3，（SEQ ID N0:69))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)， 并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、30秒，60°C、30秒和72°C、2分 30秒組成。將所得到的PCR產物指定為PCR產物編號37。pJ6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/ TI/LP)和純化的PCR產物編號37用限制酶fciw I和5於I進行消化。通過瓊脂糖凝膠 電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置 2217上的氨基酸置換A - S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定 義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置148上的A - T、在位置2219上的C - S、 在位置2695上的T - I、在位置3016上的L - P、在位置356上的M - V和在位置626上 的V - G)的核苷酸置換的重組表達載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/ VG)。
[0203] 接下來，將通過逆轉錄由實施例13中獲得的感染系4B的HCV RNA制備的包含引起 在位置1687上的I - V突變和在位置1767上的K - R突變的核苷酸置換的cDNA用作模板， 加入Phusion DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩沖液和 4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 4593S-2a( 5 ' -CTGTGGCATACTACAGAGG-3 ' (SEQIDN0:70))和 5970R-2a(5，-TTCTCGCCAGACATGATCTT-3'（SEQIDN0:71))，并且 隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc·)，并且執行PCR15PCR執行35個循環，其中每個循環由98°C、 10秒，55°C、15秒和72°C、20秒組成。將PCR產物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩沖液和 4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各1 μ 1 的10 μΜ引物4607S-IH(5'-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3'（SEQ IDN0:72))和5970R-2a(5'-TTCTCGCCAGACATGATCTT-3'（SEQIDN0 :73))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、20秒組成。將所得到的PCR產物插入pGEM-T Easy載體內。隨后將質粒用作模板，加入 LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1 的10 X 緩沖液和4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 4547S-2a( 5 ' -AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3 ' (SEQIDN0:74))和 7677R-IH(5，-TATGACATGGAGCAGCACAC-3，（SEQIDN0:75))，并且 隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)，并且執行PCR。PCR執行30個循環，其中每個循環由98°C、 30秒，60°C、30秒和72°C、3分鐘組成。將PCR產物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物， 以及各lμl的10μM引物 4607S-IH(5'-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3'（SEQID N0:76))和7214R-NS(5'-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3'（SEQIDN0 :77))，并且 隨后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc·)，并且執行PCR15PCR執行30個循環，其中每個循環由95°C、 30秒，60°C、30秒和72°C、2分30秒組成。將因而獲得的PCR產物指定為PCR產物編號38。 PJ6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG)和純化的 PCR 產物編號 39 用限制酶通ο I 進 行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級分離，并且隨后純化。使這2種 DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因 而獲得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對應于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置148上的A - T、 在位置2219上的C - S、在位置2695上的T - I、在位置3016上的L - P、在位置356上 的M - V、在位置626上的V - G、在位置329上的T - S、在位置1687上的I - V和在位置 1767上的K - R的核苷酸置換的重組表達載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S(AT/CS/TI/LP/ MV/VG/IV/KR)。克隆到 pJ6/JFH-2. I A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)內的突變型 HCV 全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :87中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:98中。因此，在感染系4B中發現的所有氨基酸突變都引入由J6/JFH-2. I A2217S(AT/ CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)編碼的突變型前體蛋白質內。
[0204] (實施例15)關于得自JFH-2. I A2218S RNA復制細胞的傳代培養的核苷酸序列的 突變分析 以0. 03的moi (感染復數）用Huh-7細胞（JFH-2. I A2218S HCV RNA已引入其內的 Huh-7細胞，其包含在實施例8中獲得的具有高感染效價的JFH-2. I A2218S HCV顆粒）的 培養上清液感染新鮮的未感染的Huh-7細胞。對受感染細胞進行傳代培養，直至培養上清 液中核心蛋白質的量和感染效價分別達到1，〇〇〇 fm〇l/L和1,000 ffu/ml或更多。用包 含病毒的培養上清液的感染并使受感染細胞的傳代培養重復3 - 4次，并且隨后對于培養 上清液中包含的HCV RNA進行序列分析。采用2個感染系，并且將其分別指定為D3和D4。 首先，從感染系D3和D4的包含JFH-2. I A2218S HCV顆粒的Huh-7細胞的每種培養上清液 中提取RNA，并且隨后通過RT-PCR擴增其中包含的HCV RNA。將隨機引物（6聚體，Takara Bio Inc.)用于擴增。將擴增產物克隆到測序克隆載體內，并且隨后通過常規方法實施序列 分析。
[0205] 作為結果，在感染系D3的情況下，發現引起在7個位置上的氨基酸置換的核苷酸 置換：在處于結構區中的E2區中的1個位置(在位置414上的I - T);以及在處于非結構區 中的NS3區中的2個位置(在位置1510上的E - Q和在位置1617上的R - Q)、NS5A區中的 3個位置(在位置2006上的K - Q、在位置2233上的A - V和在位置2234上的N - S);和 NS5B區中的1個位置(在位置2695上的T - I)。此外，在感染系D4的情況下，發現引起在 9個位置上的氨基酸置換的核苷酸置換：在處于結構區中的E2區中的1個位置(在位置387 上的V - G);以及在處于非結構區中的NS2區中的1個位置(在位置828上的V - A)、NS3 區中的2個位置(在位置1225上的R - Q和在位置1283上的R - G)、NS4B區中的1個位 置(在位置1883上的V - A)、NS5A區中的3個位置(在位置2206上的S - A、在位置2279 上的K - N和在位置2441上的C - R)、和NS5B區中的2個位置(在位置2695上的T - I)。
[0206] (實施例16)突變型J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內的細胞的HCV顆粒 生產能力的評估 使用實施例 14 中構建的表達載體 pJ6/JFH-2. I A2217S、pJ6/JFH-2. I A2217S (CS)、 PJ6/JFH-2.1 A2217S (LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (AT)、pJ6/ JFH-2.1 A2217S (CS/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/LP)、 PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/LP)、pJ6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)、pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)和 pJ6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)， 通過類似于實施例2中那些的技術制備HCV全基因組RNA (突變型HCV全基因組RNA)。將 因而獲得的HCV全基因組RNAs各自通過電穿孔引入Huh7細胞內。其后，在培養基(含10% 胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM))中傳代培養細胞時，使用HCV抗原ELISA 測試試劑盒（Ortho Clinical Diagnostics)隨著時間過去定量培養上清液中包含的HCV核 心蛋白質，以證實HCV顆粒的產生（圖12)。
[0207] 作為結果，證實當將在7或8個位置上的上述氨基酸突變獨立地引入J6/JFH-2. 1 A2217S基因組序列內時，RNA在RNA引入其內的細胞中有效自我復制，并且病毒在復制起始 后的短時間段內分泌到培養上清液內。
[0208] 產業應用性 使用從暴發性丙型肝炎患者中分離的基因型2a的HCV基因組制備的根據本發明的HCV 復制子、HCV復制子引入其內的復制子復制細胞、使用HCV復制子用于在培養細胞系統中產 生感染性HCV顆粒的方法、和通過該方法獲得的感染性HCV顆粒作為用于評估抑制HCV復 制和HCV感染的分子的系統是有用的。本發明可以提供具有顯著高于迄今獲得的HCV亞基 因組復制子RNA的自我復制能力的HCV亞基因組復制子RNA和全基因組復制子RNA。這些 復制子RNAs可以特別方便地用于篩選抑制HCV復制的抗HCV藥劑或用于闡明HCV復制機制 的研究。此外，本發明的HCV全基因組復制子RNA具有高于迄今獲得的HCV全基因組復制 子RNA的HCV顆粒生產能力，從而使得它可以用于構建用于以高水平有效產生HCV顆粒的 系統，具有感染性的HCV顆粒可以由該系統在體外大量制備。此外，根據本發明的HCV復制 子和感染性HCV顆粒對于用作HCV疫苗或抗原用于制備抗HCV抗體也是有用的。使用根據 本發明的多突變型復制子用于產生HCV病毒顆粒的方法對于在短時間段內在體外產生HCV 病毒顆粒也是非常有用的。
[0209] 序列表單獨文本（free text) SEQ ID NOS :1、2、11-13 和 16-87 是合成 DNAs。
[0210] SEQ ID NOS :88-98 是合成多肽。
【權利要求】
1. 核酸，其包括在SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列中引起氨基酸置換的核苷酸置換， 并且其中所述氨基酸置換是： 土）]?4051(、財171'、]\18681'、1'14624、11722￥、522046和126951，如使用作為參考序列的5￡0 ID NO :88中所示的氨基酸序列定義的；或 ii) A148T、M356V、V626G、I1687V、K1767R、C2219S、T2695I 和 L3016P，如使用作為參考 序列的SEQ ID NO :88中所不的氣基酸序列定義的。
2. 根據權利要求1的核酸，其編碼SEQ ID NO :97或98中所示的氨基酸序列。
3. 根據權利要求1的核酸，其包含SEQ ID NO :86或87中所示的核苷酸序列。
4. 根據權利要求1-3中任一項的核酸，其為全基因組復制子RNA。
5. 表達載體，其中根據權利要求1-3中任一項的核酸在啟動子下游可操作地連接。
6. 轉化細胞，其通過向細胞中引入根據權利要求4的全基因組復制子RNA獲得。
7. 轉化細胞，其通過向細胞中引入根據權利要求5的表達載體獲得。
8. 丙型肝炎病毒顆粒，其通過培養根據權利要求6的轉化細胞獲得。
9. 丙型肝炎病毒顆粒，其通過培養根據權利要求7的轉化細胞獲得。
【文檔編號】C12N5/10GK104313038SQ201410405909
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2009年12月25日 優先權日:2008年12月26日
【發明者】脅田隆字, 伊達朋子, 高橋仁 申請人:東麗株式會社, 日本國立感染癥研究所, 公益財團法人東京都醫學綜合研究所