一種直接檢測a+b型流感病毒的實時熒光rt-pcr方法
【專利摘要】本發明提供了一種直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包含有RT-PCR反應液，RT-PCR反應液為具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液。在本發明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反應液進行擴增，反應液直接將A型和B型流感病毒裂解之后使病毒RNA釋放出來，那么便可以直接進行RT-PCR過程；因此可以不需要在擴增之前提取RNA樣本后再進行PCR的過程大大縮減了時間，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，大大提升診斷的準確性。
【專利說明】—種直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于流感病毒定性檢測【技術領域】，具體涉及一種直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]流感是由流感病毒引起的一種急性傳染病。流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，為有囊膜的負鏈RNA病毒，其病毒基因組包括8個節段，為單鏈、負鏈RNA，分別編碼至少10種以上的蛋白。流感病毒包括A、B和C三種類型，造成呼吸道感染最常見的是A和B兩種流感病毒。其中，A型流感病毒又可以分為1-16種HA亞型和1_9種NA亞型；而引起感染的流感病毒的主要是A型中的Hl (NI)、H3 (N2)亞型和B型流感病毒。
[0003]而在現有在臨床化驗檢測的過程中，比較通用的有傳統方法和分子生物學方法兩大類。其中，傳統方法一般采用分離培養(如雞胚培養和MDCK培養)后通過血凝實驗、血凝抑制實驗、中和實驗、單放射擴散溶血技術等等進行類別確認。傳統方法，因為大量培養之后進行宏觀的實驗確認，整體操作周期產長、特異性差等。而相對傳統方法，分子生物學方法以實時PCR為基礎實驗過程對病毒核酸標樣進行擴增，然后對擴增產物分析得出靶病毒的檢測結果。實時PCR是利用不同的熒光物質來實現對擴增產物進行實時檢測的目的。其中，實時PCR最常用的兩種熒光探針是SYBR Green I和Taqman探針。SYBR Green I是一種熒光染料型探針，它是在實時熒光PCR反應的過程中，插入DNA雙鏈，來發射熒光信號，實現對整個反應過程的實時監測，其熒光信號的強度與DNA模板的增加量呈正相關。Taqman探針是在實時熒光PCR的反應過程中，通過與DNA模板熒光標記探針型可以采用不同熒光基團標記探針或者引物。
[0004]但是上述分子生物學方法中，首先第一個步驟是需要采用RNA試劑盒從待測的組織標樣(如咽拭子)提取RNA樣本，然后對RNA樣本進行實時PCR。由于RNA提取的步驟繁多，且RNA本身不穩定易于降解，因此采用現有的實時熒光PCR的方法耗時長，且熒光信號結果的不利于準確分析。
【發明內容】
[0005]本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種不需要RNA提取便可以直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法和試劑盒。
[0006]本發明的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，包含有RT-PCR反應液，其中所述RT-PCR反應液為具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液。
[0007] 在本發明中，RT-PCR中所采用的RT-PCR反應液具有流感病毒裂解活性；立意于A型和B型流感病毒的結構非常簡單，由外層蛋白質組成的細胞膜、衣殼、以及包覆于內部核酸分子形成，而且在侵入病體后會復制和擴散的活化狀態下，本身病毒結構中簡單的結構會更加容易裂解釋放核酸。因此在本發明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反應液進行擴增，那么便可以直接進行RT-PCR過程；相比現有的先提取RNA樣本后再進行PCR的過程大大縮減了時間，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，那么便可以大大提升檢測的準確性。
[0008]本發明進一步還提出直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，在方法實施過程中采用上述具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液進行。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中:
[0010]圖1為本發明實施例陽性對照中A、B型流感病毒雙重熒光RT-PCR檢測結果；
[0011]圖2為本發明實施例臨床樣本A型流感病毒的熒光RT-PCR檢測結果；
[0012]圖3為本發明實施例臨床樣本B型流感病毒的熒光RT-PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0013]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0014]本發明實例提供了一種直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，本發明的方法仍然基于實時熒光PCR的手段進行，但是相比現有熒光PCR的做法，直接采用RT-PCR步驟進行。
[0015]其中，在本發明的方法中，RT-PCR中所采用的RT-PCR反應液具有流感病毒裂解活性；這一技術手段的立意是基于本身A型和B型流感病毒非常簡單的結構，由細胞膜、衣殼的外層結構、以及包覆于內部核酸分子形成，而且在侵入病體后會復制和擴散的活化狀態下，本身病毒結構會更加容易裂解釋放核酸。因此在本發明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反應液進行擴增，病毒被裂解之后將RNA釋放出來，那么便可以直接進行RT-PCR過程。相比現有的先提取RNA樣本后再進行PCR的過程大大縮減了時間，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，那么便可以大大提升檢測的準確性。本發明中采用美國VitaNavi Technology 公司生產的產品號為 VND780RTK 的 Direct S/P qRT-PCR TaqProbeKits即可良好地實現該RT-PCR反應液病毒裂解。
[0016]其中在上述過程中，這一病毒裂解可以通過RT-PCR反應液中添加表面活性劑即可實現，這些表面活性劑成分具有較多的親水基團和疏水基團，疏水基團非常容易與病毒表面結合，從而破壞進而使病毒裂解，比如十二烷基磺酸鈉等等。
[0017]進一步在現有實時熒光PCR是先提取RNA后，經過反轉錄后再進行PCR過程，RNA樣本一般提取后比較純，因此在擴增的過程中引物和探針的識別和結合的特異性采用一般的引物和探針即可達到較好的效果；其中引物序列見下表1:(這一段不太合適，我們的引物和探針的重點是覆蓋全面，即能夠識別A、B型的所有亞型，而不是更優的結合性)
[0018]
【權利要求】
1.一種直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包含有RT-PCR反應液，其特征在于，所述RT-PCR反應液為具有A型、B型流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液。
2.如權利要求1所述的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應液為包含有表面活性劑的RT-PCR反應液。
3.如權利要求1或2所述的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含有擴增A型流感病毒的上游引物、下游引物，以及A型流感病毒熒光探針； 所述A型流感病毒上游引物具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列； 所述A型流感病毒下游引物具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列； 所述A型流感病毒熒光探針具有序列表SEQ.1D.N0.5的堿基序列，且所述A型流感病毒熒光探針的5’端標記有熒光報告基團、3’端標記有熒光淬滅基團。
4.如權利要求1或2所述的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含有擴增B型流感病毒的上游引物、下游引物，以及B型流感病毒熒光探針； 所述B型流感病毒上游引物具有序列表SEQ.1D.N0.3的堿基序列； 所述B型流感病毒下游引物具有序列表SEQ.1D.N0.4的堿基序列； 所述B型流感病毒熒光探針具有序列表SEQ.1D.N0.6的堿基序列，且所述B型流感病毒熒光探針的5’端標記有熒光報告基團、3’端標記有熒光淬滅基團。
5.如權利要求1或2所述的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括有陽性對照，所述陽性對照為連有A型流感病毒基因片段的載體、和/或連有B型流感病毒基因片段的載體。
6.一種直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，其特征在于，在RT-PCR過程中的RT-PCR反應液為具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液。
7.如權利要求6所述的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，其特征在于，RT-PCR過程中采用擴增所述A型流感病毒上游引物為具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，下游引物為具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列； 以及，RT-PCR過程中采用A型流感病毒熒光探針為具有序列表SEQ.1D.N0.5的堿基序列，且所述A型流感病毒熒光探針的5 ’端標記有熒光報告基團、3 ’端標記有熒光淬滅基團。
8.如權利要求6所述的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，其特征在于，RT-PCR過程中采用擴增B型流感病毒的上游引物為具有序列表SEQ.1D.N0.3的堿基序列，下游引物為具有序列表SEQ.1D.N0.4的堿基序列； 以及，RT-PCR過程中采用B型流感病毒熒光探針具有序列表SEQ.1D.N0.6的堿基序列，且所述B型流感病毒熒光探針的5’端標記有熒光報告基團、3’端標記有熒光淬滅基團。
【文檔編號】C12Q1/70GK104164518SQ201410438234
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】于洪波, 陳善光, 歐陽輝, 吳清華 申請人:深圳市梓健生物科技有限公司