一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法與流程

本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法。

背景技術：

伴隨著基因分子診斷技術的迅猛發展，PCR、RT-PCR、Real-Time PCR、LAMP等新技術正以其高特異性、敏感性和時效性慢慢地在取代傳統的病原體分離培養和生化鑒定等敏感性低、費時費力的檢測方法。同時由于臨床診斷技術的不斷提高，其對檢測技術的敏感性要求也越來越高，這里就包括檢測敏感性AS(analytical sensitivity)和臨床敏感性CS(clinical sensitivity)。例如呼吸道感染、腹瀉病原體感染、腦炎腦膜炎病原體感染等疾病常常是由多個混合病原體感染引起，如果僅僅檢測一個指標，臨床敏感性及其臨床的指導意義也會大大降低。

目前為了提高檢測敏感性多采用熒光定量PCR技術，熒光定量PCR技術是在普通PCR的基礎上在PCR反應體系中加入熒光基團，在靶序列擴增過程中，隨著PCR反應產物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加，并逐漸累積形成一條擴增曲線，通過熒光擴增曲線實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定性及定量分析的方法。

如今體外診斷行業依靠單重熒光定量PCR技術作為分子診斷工具已有二十多年，單重PCR檢測具有檢測通量低、檢測成本高、檢測時間長等缺點。

技術實現要素：

本發明的發明目的在于提供一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法，以解決單重PCR檢測通量低、檢測成本高、檢測時間長的問題。

本發明示出一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法，包括：

PCR體系中引入了與核酸模板互補的探針和特異性引物，設定PCR擴增程序，進行PCR擴增循環，所述PCR擴增循環的過程中，每個循環均在延伸步驟中進行實時的熒光信號強度采集，并通過對實時的熒光信號強度變化對目標靶序列一進行定性分析；所述探針的5’端標記熒光報告基團，所述探針的3’端標記猝滅基團；所述特異性引物標記引物猝滅基團和引物熒光報告基團；

所述PCR擴增循環結束后，通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。

進一步，所述通過實時的熒光信號強度變化對檢測的目標靶序列一進行定性分析的步驟包括：

通過酶水解所述探針產生熒光強度變化對檢測的目標靶序列一進行定性分析。

進一步，所述通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析的步驟包括：

采集所述特異性引物的擴增產物的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。

進一步，所述特異性引物的5’端修飾標記引物猝滅基團，所述特異性引物中間位置標記引物熒光報告基團。

進一步，所述引物猝滅基團與所述引物熒光報告基團之間的間距為15-25nt。

進一步，所述探針的Tm值高于所述特異性引物的Tm值5℃-10℃。

進一步，所述PCR擴增程序包括；

預變性和酶激活溫度為95℃，時間為1min；

逆轉錄溫度為60℃，時間為30min；

cDNA預變性溫度為95℃，時間為1min；

變性溫度為95℃，時間為15s；

退火溫度為60℃，時間為30s；

延伸及熒光采集的溫度為72℃，時間為30s；

熔解曲線分析的溫度為55℃-95℃。

進一步，所述特異性引物包括：目標靶序列一特異性引物和目標靶序列二特異性熒光引物；

所述目標靶序列一特異性引物的核酸序列為：SEQ ID NO:1AAGAACACAGATCTCGAGGCTCTC和SEQ ID NO:2GTCTCCATTTCCATTTAGGGCATTC；

所述目標靶序列二特異性引物的核酸序列為：SEQ ID NO:4[BHQ1]-TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]CC和SEQ ID NO:5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG。

進一步，所述探針的核酸序列為：SEQ ID NO:3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC

根據本發明的實施例示出一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法，包括：PCR體系中引入了與核酸模板互補的探針和特異性引物，設定PCR擴增程序，進行PCR擴增循環，所述PCR擴增循環的過程中，每個循環均在延伸步驟中進行實時的熒光信號強度采集，并通過對實時的熒光信號強度變化對目標靶序列一進行定性分析；所述探針的5’端標記熒光報告基團，所述探針的3’端標記猝滅基團；所述特異性引物標記引物猝滅基團和引物熒光報告基團；所述PCR擴增循環結束后，通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。本發明是基于酶水解探針產生熒光信號及特異性引物擴增后，產物雜交產生熒光信號兩種技術原理，針對單色熒光通道中目標靶序列一核酸的檢測采用酶水解探針的方式，目標靶序列二的核酸的檢測使用采用熔解曲線的方式，進而實現在單色熒光通道中同時進行兩個靶點的檢測和分析，本發明解決了傳統PCR檢測方法無法用一支反應管里有限數量的檢測通道提高靶點檢測通量的問題，極大的提升了單管PCR反應檢測的通量，為科研及臨床復雜的混合病原體感染檢測及多基因遺傳的檢測提供了強大的技術支持。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為根據一優選實施例示出的一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法的流程圖；

圖2為引物熒光基團和猝滅基團之間的標記位置做了不同間距的處理測得熒光強度圖；

圖3為檢測模板中只有甲型流感InfA時的熔解曲線；

圖4檢測模板中只有甲型流感InfA時的擴增曲線；

圖5為檢測模板中只有甲型流感InfB時的熔解曲線；

圖6檢測模板中只有甲型流感InfB時的擴增曲線；

圖7為檢測模板中既有InfA也有InfB時的熔解曲線；

圖8為檢測模板中既有InfA也有InfB時的擴增曲線。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明實施例示出一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法，如圖1所示，所述方法包括：

S101，PCR體系中引入了與核酸模板互補的探針和特異性引物，設定PCR擴增程序，進行PCR擴增循環，所述PCR擴增循環的過程中，每個循環均在延伸步驟中進行實時的熒光信號強度采集，并通過對實時的熒光信號強度變化對目標靶序列一進行定性分析；

其中，所述探針的5’端標記熒光報告基團，所述探針的3’端標記猝滅基團；所述特異性引物標記引物猝滅基團和引物熒光報告基團；

S102，所述PCR擴增循環結束后，通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。

進一步，所述特異性引物的5’端修飾標記引物猝滅基團，所述特異性引物中間位置標記引物熒光報告基團。

進一步，所述通過對實時的熒光信號強度變化對檢測的目標靶序列一進行定性分析的步驟包括：

通過酶水解所述探針產生熒光強度變化對檢測的目標靶序列一進行定性分析。

進一步，所述引物猝滅基團于所述引物熒光報告基團之間的間距為15-25nt。

在特異性引物設計中對引物熒光基團和猝滅基團之間的標記位置做了不同間距的處理，結果如圖2，其中1為引物熒光基團和猝滅基團之間間距大于25nt，2為引物熒光基團和猝滅基團之間間距為15-25nt，3為引物熒光基團和猝滅基團之間間距小于15nt。

其中以這兩個基團標記位置相距15-25nt為最佳實驗效果，當間距大于25nt或者小于15nt實驗結果均不理想，其中以小于15nt效果最不好，分析可以發現當寡聚核苷酸長度太短時，其標記的熒光基團和猝滅基團在單鏈和雜合雙鏈時熒光產生效率均不高，這應該是由熒光基團的熒光一直被猝滅基團所猝滅所導致。

本發明中所提供的方法為一種在單色熒光通道中進行雙靶點檢測的多重熒光PCR技術，更具體地說為一種實時熒光PCR擴增結合終點熔解曲線分析的多重PCR檢測技術，PCR體系中熒光的產生方式為酶水解探針產生熒光和特異性引物雜交產生熒光，兩種發生方式相結合。

本發明中提到的熔解曲線法實現方式為，在靶點的特異性引物的5’端標記引物猝滅基團，在特異性引物中間位置標記報告基團，引物猝滅基團和引物熒光報告基團之間的間距最后優選為15-25nt，隨著PCR不斷的擴增，PCR體系內將會積累大量帶有熒光的擴增靶序列片段，PCR擴增結束后，進行熔解曲線法分析，當溫度低于擴增產物設計的Tm值時，帶熒光的擴增產物在體系中為相互雜交的DNA雙鏈狀態,此時由于熒光報告基團和猝滅基團的物理位置較遠，故而熒光報告基團產生的熒光不能被猝滅基團猝滅，體系可以檢測到熒光信號；當溫度高于擴增產物設計的Tm值時，帶熒光的擴增產物在體系中以DNA單鏈的形式存在，這時由于寡聚核苷酸的分子柔性，導致熒光報告基團與猝滅基團的物理位置較近，進而熒光報告基團發出的熒光被猝滅基團所猝滅，體系檢測不到熒光信號。

靶核苷酸序列特異性引物和探針的設計：

本發明中靶核酸序列特異性引物和探針設計，除了要考慮保證序列的保守性和特異性外，還需對選擇為熔解曲線法的靶點的引物作特殊修飾處理，即在特異性引物的5’端修飾標記猝滅基團，同時在特異性引物的中間修飾標記熒光報告基團，其中猝滅基團和熒光報告基團的間距優選為15-25nt。

PCR反應體系的配比：

多重反應體系中，靶點Real time PCR反應體系組成至少含有如下組份：PCR buffer、DNA聚合酶、dNTPs、引物、探針以及催化DNA聚合酶所需要的金屬陽離子。

本發明的優選方案為：

SEQ ID NO:1AAGAACACAGATCTCGAGGCTCTC；

SEQ ID NO:2GTCTCCATTTCCATTTAGGGCATTC；

SEQ ID NO:3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC；

其中熒光報告基團與猝滅基團標記的位置為：[熒光報告基團]-CTGCAGTCCTCGC[T-猝滅基團]CACTGGGCAC-[猝滅基團]；

SEQ ID NO:4[BHQ1]-TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]CC；

SEQ ID NO:5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG；

本發明實施例示出的一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法，根據靶核酸序列的保守性，選取保守性較好的區域，進行擴增的特異性引物和探針的設計，其中探針的Tm設計要高于特異性引物5-10℃，同時在探針的5’端標記熒光報告基團，在探針的3’端標記猝滅基團。在擴增開始時，探針與模板結合，隨后，DAN聚合酶的5’端→3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光報告基團和猝滅基團分離，從而熒光定量PCR擴增儀可接收到熒光信號。隨著反應的進行，擴增產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化監測產物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖。熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，指數期時，產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，因此可以在反應處于指數期的某一點上來檢測產物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。

進一步，所述PCR擴增程序為：

預變性和酶激活溫度為95℃，時間為1min；

逆轉錄溫度為60℃，時間為30min；

cDNA預變性溫度為95℃，時間為1min；

變性溫度為95℃，時間為15s；

退火溫度為60℃，時間為30s；

延伸及熒光采集的溫度為72℃，時間為30s；

熔解曲線分析的溫度為55℃-95℃。

進一步，所述在擴增結束后繪制熔解曲線的步驟包括：

擴增結束后每上升0.5℃采集一次熒光信號，繪制熔解曲線。

本發明的檢測方法為Real time RT-PCR，將RNA逆轉錄和DNA擴增結合起來，同時在PCR擴增結束后進行溶解曲線分析。Real time RT-PCR反應過程為：

1)cDNA合成；

2)cDNA預變性，時間和長度取決于靶核苷酸長度及堿基組成，預變性的溫度一般為90℃-105℃，時間一般為1-10min，預變性的目的為使雙鏈核苷酸序列徹底分離為單鏈；

3)變性，溫度一般為90℃-105℃，時間一般為10s-30s；

4)退火，使各引物退火檢測核酸的靶序列上。退火的溫度通常為40℃-60℃，退火的時間可以是10s-60s；

5)延伸，引物與模板結合，開始合成新的雙鏈DNA，延伸溫度一般為40℃-80℃，延伸時間可以是10s-5min。本發明實施例的優選方案為：

結果分析：

當該檢測通道只有72℃的擴增曲線，且在溶解曲線分析時無熔解曲線峰時，該通道檢測結果為只檢測到設計為探針的目標靶序列一；

當該檢測通道沒有72℃的擴增曲線，但在溶解曲線分析時有熔解曲線峰時，該通道檢測結果為只檢測到設計為熔解曲線檢測的目標靶序列二；

當該檢測通道既有72℃的擴增曲線，且在溶解曲線分析時有熔解曲線峰，則該通道檢測結果為既檢測到設計為探針的目標靶序列一，又檢測到設計為熔解曲線的目標靶序列二；

當該檢測通道既沒有72℃的擴增曲線，且在溶解曲線分析時也沒有熔解曲線峰時，該通道檢測結果為既沒有檢測到設計為探針的目標靶序列一，又沒有檢測到設計為熔解曲線的目標靶序列二；

為證明該發明方法的可行性，進行了以呼吸道檢測為載體的研究：

其中1為甲型流感InfA；2為甲型流感InfB；3為甲型流感InfA和甲型流感InfB

其中在FAM通道中設計為探針檢測目標靶序列一為：甲型流感InfA，設計為熔解曲線分析目標靶序列二為InfB。測試結果為：

(1)當檢測模板中只有甲型流感InfA時，結果如圖3和圖4所示，檢測中只有擴增曲線而沒有熔解曲線峰；

(2)當檢測模板中只含有InfB時，結果如圖5和圖6所示，檢測中沒有擴增曲線而只有熔解曲線峰；

(3)當檢測模板中既有InfA也有InfB時，結果如圖7和圖8所示，檢測中既有擴增曲線也有熔解曲線峰；

可見，本發明是基于DNA聚合酶水解探針產生熒光信號及特異性引物擴增產物雜交產生熒光信號的兩種技術原理，針對單色熒光通道中一個目標靶序列一的檢測采用探針，目標靶序列二的檢測使用采用熔解曲線的方式，進而實現在單色的熒光通道中同時進行兩個靶點檢測和分析。

由以上技術方案可知，本發明的實施例示出一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法，包括：PCR體系中引入了與核酸模板互補的探針和特異性引物，設定PCR擴增程序，進行PCR擴增循環，所述PCR擴增循環的過程中，每個循環均在延伸步驟中進行實時的熒光信號強度采集，并通過對實時的熒光信號強度變化對目標靶序列一進行定性分析；所述探針的5’端標記熒光報告基團，所述探針的3’端標記猝滅基團；所述特異性引物標記引物猝滅基團和引物熒光報告基團；所述PCR擴增循環結束后，通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。本發明是基于酶水解探針產生熒光信號及特異性引物擴增后，產物雜交產生熒光信號兩種技術原理，針對單色熒光通道中目標靶序列一核酸的檢測采用酶水解探針的方式，目標靶序列二的核酸的檢測使用采用熔解曲線的方式，進而實現在單色熒光通道中同時進行兩個靶點的檢測和分析，本發明解決了傳統PCR檢測方法無法用一支反應管里有限數量的檢測通道提高靶點檢測通量的問題，極大的提升了單管PCR反應檢測的通量，為科研及臨床的復雜的混合病原體感染檢測及多基因遺傳的檢測提供了強大的技術支持。

本領域技術人員在考慮說明書及實踐這里公開的發明后，將容易想到本發明的其它實施方案。本申請旨在涵蓋本發明的任何變型、用途或者適應性變化，這些變型、用途或者適應性變化遵循本發明的一般性原理并包括本發明未公開的本技術領域中的公知常識或慣用技術手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發明的真正范圍和精神由下面的權利要求指出。

應當理解的是，本發明并不局限于上面已經描述并在附圖中示出的精確結構，并且可以在不脫離其范圍進行各種修改和改變。本發明的范圍僅由所附的權利要求來限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南圣湘生物科技有限公司

<120> 一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法

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<212> DNA

<213> Influenza virus type A

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gtctccattt ccatttaggg cattc 25

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<212> DNA

<213> Influenza virus type A

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ttcaaatatc agacaaaaac aaaaccaatc c 31

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<212> DNA

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tgtctatttt gttgctttaa taatcgag 28