一種提高植物纖維原料酶水解得率的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高植物纖維原料酶水解得率的方法，包括植物纖維原料堿性預處理和纖維素、木聚糖酶水解制備單糖步驟，其特征在于：在添加纖維素酶和木聚糖酶水解堿性預處理后的植物纖維原料時，額外添加10-50U/g纖維素的β-葡萄糖苷酶。與現有技術相比，本發明的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，突出的優點是通過在堿性預處理植物纖維原料酶水解體系中過量添加β-葡萄糖苷酶，降低酶水解初期水解液中的纖維二糖濃度，緩解酶水解初期纖維二糖對內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用，從而提高酶反應速率和酶水解得率，降低堿性預處理植物纖維原料生產生物質糖的生產成本。
【專利說明】一種提高植物纖維原料酶水解得率的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物纖維原料酶水解【技術領域】，具體涉及一種提高植物纖維原料酶水 解得率的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著人類社會對以石油資源為代表的化石資源需求的日益增長和過度開采，使石 油資源不可避免地面臨枯竭的命運；同時大量化石資源的使用引發的溫室效應有可能演變 成為人類的一場生態災難。人類如何應對未來資源能源短缺、環境污染和全球氣候變暖的 趨勢？走可持續發展的道路已成為國際共識。利用可再生的植物纖維資源生產生物能源、 生物基化學品和生物基材料是可持續發展戰略的重要組成部分。我國有豐富的農林生物質 資源，包括農林廢棄物、木（竹）材加工廢棄物、富含纖維的糧食加工廢棄物、城市纖維垃圾 等。利用這些廉價的植物纖維資源生產生物質糖（葡萄糖、木糖），并以此為原料生產人類 所需的能源、化學品和材料，能夠很好地解決未來生物能源、生物基化學品及生物基材料生 產的原料問題。植物纖維原料生產生物能源、生物基化學品及生物基材料的技術體系中，高 酶水解得率、低成本的生物質糖生產技術是決定植物纖維原料生物煉制技術大規模工業化 的iu提和關鍵。
[0003] 植物纖維原料生產生物質糖的方法主要包括酸水解法和酶水解法兩種，其中酶水 解法具有反應條件溫和、無抑制物質生成、對設備要求低等特點而具有潛在的工業應用前 景。植物纖維原料中的纖維素是在纖維素酶的催化作用下降解成葡萄糖的，纖維素酶是一 個復合酶系，主要由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。纖維素完全水解 是在纖維素酶系中各組分的協同作用下完成的，纖維素酶協同水解纖維素的機理尚不完全 清楚，普遍公認的觀點是內切葡聚糖酶首先隨機切斷纖維素鏈的β -1，4-糖苷鍵，產生 新的短鏈纖維素和纖維低聚糖；隨后外切葡聚糖酶從短鏈纖維素和纖維低聚糖的還原或非 還原末端以纖維二糖為單位依次水解；最后β_葡萄糖苷酶將生成的纖維二糖和纖維低聚 糖徹底水解成葡萄糖。纖維素是在纖維素酶系中內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄 糖苷酶的協同作用下水解成單糖葡萄糖的，纖維素酶系中某一種組分的含量不足均將影響 纖維素的酶水解效率。木霉屬中的里氏木霉是公認的纖維素酶優良生產菌株，但里氏木霉 纖維素酶系中的內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶的比例不協調，葡萄糖 苷酶含量相對較低，因此，里氏木霉纖維素酶系降解植物纖維原料中的纖維素時水解產物 中纖維二糖含量較高，而在目前發現的具有工業應用價值的生物能源、生物基化學品微生 物發酵菌株中，絕大多數微生物不能利用纖維二糖，因此在纖維素水解產物中，要求纖維二 糖的含量盡可能低。圍繞植物纖維原料纖維素酶水解過程中纖維素酶系中β_葡萄糖苷酶 含量不足導致的水解產物中纖維二糖含量高的問題，以提高纖維素水解產物中可發酵性單 糖比例為目標，國內外開展了大量的研究，解決這個問題的辦法主要是添加 β_葡萄糖苷 酶以降低纖維素水解產物中纖維二糖的含量，研究表明，在里氏木霉纖維素酶水解植物纖 維原料的水解體系中一般添加 l_5U/g纖維素用量的β-葡萄糖苷酶即可實現水解糖液中 纖維二糖含量低于lg/L，通常添加低于3U/g纖維素用量的β-葡萄糖苷酶即可實現上述效 果。在已有的文獻報道中，在纖維素酶水解體系中添加 β-葡萄糖苷酶的目的均為降低水 解糖液中纖維二糖的濃度，從而提高水解產物中可發酵性糖的比例。
[0004] 纖維素酶屬于反饋抑制的水解酶類，在纖維素酶系水解纖維素成葡萄糖的過程 中，終產物葡萄糖的生成對β-葡萄糖苷酶的活力產生抑制作用，β-葡萄糖苷酶活力受到 抑制后導致水解過程中纖維二糖的累積，纖維二糖的累積對內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶 產生抑制作用，從而導致纖維素酶水解反應速度和水解得率不高。
[0005] 申請人:在研究里氏木霉纖維素酶水解堿性預處理植物纖維原料過程中的酶反應 速率時發現，盡管在植物纖維原料纖維素酶水解體系中輔助添加3U/g纖維素的β -葡萄糖 苷酶可以保證水解產物中纖維二糖濃度在lg/L以下，但水解初期水解液中纖維二糖濃度 較高是導致纖維素酶反應速率下降的關鍵因素，在此基礎上，提出了過量輔助添加 β_葡 萄糖苷酶，以降低植物纖維原料纖維素酶水解初期水解液中纖維二糖濃度過高的問題，緩 解水解初期纖維二糖對內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的抑制作用，從而達到提高酶反應速 率和水解得率的目的，同時，隨著纖維素水解得率的提高，也提高了木聚糖的水解得率。
【發明內容】
[0006] 發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種提高植物纖維 原料酶水解得率的方法，通過在堿性預處理植物纖維原料酶水解過程中過量添加 β -葡萄 糖苷酶，降低酶水解初期水解液中的纖維二糖濃度，緩解酶水解初期纖維二糖對內切葡聚 糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用，從而提高酶反應速率和酶水解得率，降低堿性預處理植 物纖維原料生產生物質糖的生產成本。
[0007] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：
[0008] -種提高植物纖維原料酶水解得率的方法，包括植物纖維原料堿性預處理和纖維 素、木聚糖酶水解制備單糖步驟，在添加纖維素酶和木聚糖酶水解堿性預處理后的植物纖 維原料時，額外添加10_50U/g纖維素的β -葡萄糖苷酶。
[0009] 所述的纖維素、木聚糖酶水解制備單糖，底物w/v濃度5-20%。
[0010] 所述的纖維素、木聚糖酶水解制備單糖，底物w/v濃度15-20%，采用分批補料的 方法添加底物。
[0011] 所述的纖維素、木聚糖酶水解制備單糖，纖維素酶用量不高于25FPU/g纖維素，木 聚糖酶用量不高于120U/g纖維素。
[0012] 所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，包括如下步驟：
[0013] (1)用綠液對風干植物纖維原料進行堿處理，堿用量2-8%，處理溫度100-140°C， 保溫時間lh，硫化度30-40%，經綠液預處理的植物纖維原料用水洗滌、磨漿、過濾；
[0014] (2)將綠液預處理的植物纖維原料與纖維素酶和木聚糖酶混合，加入水，pH緩沖 液，混合至底物w/v濃度5-20 %，控制pH值在4. 0-6. 0,反應體系中按10-50U/g纖維素的 量添加 β -葡萄糖苷酶，于45-55°C條件下酶解反應48h。
[0015] 步驟（2)中，當酶解底物w/v濃度為15-20%時，酶解優選采用分批補料的方法。 [0016] 所述的纖維素酶是以里氏木霉產生的一種或多種酶的復合物。
[0017] 有益效果：與現有技術相比，本發明的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，突出 的優點是通過在堿性預處理植物纖維原料酶水解體系中過量添加 β-葡萄糖苷酶，降低酶 水解初期水解液中的纖維二糖濃度，緩解酶水解初期纖維二糖對內切葡聚糖酶和外切葡聚 糖酶的抑制作用，從而提高酶反應速率和酶水解得率，降低堿性預處理植物纖維原料生產 生物質糖的生產成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1是添加低β -葡萄糖苷酶和添加過量β -葡萄糖苷酶對酶反應過程中纖維二 糖濃度的影響結果圖；
[0019] 圖2是添加低β -葡萄糖苷酶和添加過量β -葡萄糖苷酶對平均酶反應速率和纖 維素酶水解得率的影響結果圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。
[0021] 以下實施例中，葡萄糖濃度、木糖濃度和纖維二糖濃度均采用高效液相色譜法 (HPLC)測定。色譜條件如下：色譜儀：AgillentllOO高效液相色譜儀；色譜柱：Bi〇-Rad Aminex HPX-87H ;流動相：0. 005mol/L硫酸、流速：0. 6mL/min ;柱溫：55°C ;檢測器：示差折 光檢測器；進樣量：1〇 μ L。外標法測定。
[0022] β -葡萄糖苷酶活力測定方法：采用對硝基苯酚-β -D-葡萄糖苷（pNPG)為底物 測定。一個β-葡萄糖苷酶活力單位定義為在標準反應條件下，每分鐘水解生成Iymol對 硝基苯酚所需要的酶量。
[0023] 測定方法如下：0. ImL適當稀釋的酶液與0. 9mL 5mmol/L、pH 4. 80的pNPG溶液混 合后，于50°C下保溫lOmin。立即加入2mL lmol/L Na2C03溶液終止反應，加入IOmL的蒸 餾水，搖勻。在400nm下測定吸光度，以蒸餾水代替酶液作空白對照。按下式計算β-葡萄 糖苷酶活力：
[0024]
【權利要求】
1. 一種提高植物纖維原料酶水解得率的方法，包括植物纖維原料堿性預處理和纖維 素、木聚糖酶水解制備單糖步驟，其特征在于：在添加纖維素酶和木聚糖酶水解堿性預處理 后的植物纖維原料時，額外添加10-50U/g纖維素的β-葡萄糖苷酶。
2. 根據權利要求1所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，其特征在于：所述的 纖維素、木聚糖酶水解制備單糖，底物w/v濃度5-20%。
3. 根據權利要求1或2所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，其特征在于：所 述的纖維素、木聚糖酶水解制備單糖，底物w/v濃度15-20%，采用分批補料的方法添加底 物。
4. 根據權利要求1所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，其特征在于：所述的 纖維素、木聚糖酶水解制備單糖，纖維素酶用量不高于25FPU/g纖維素，木聚糖酶用量不高 于120U/g纖維素。
5. 根據權利要求1所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，其特征在于，包括如 下步驟： (1) 用綠液對風干植物纖維原料進行堿處理，堿用量2-8%，處理溫度100-140°C，保溫 時間lh，硫化度30-40%，經綠液預處理的植物纖維原料用水洗滌、磨漿、過濾； (2) 將綠液預處理的植物纖維原料與纖維素酶和木聚糖酶混合，加入水，pH緩沖液，混 合至底物w/v濃度5-20%，控制pH值在4. 0-6. 0,反應體系中按10-50U/g纖維素的量添加 β -葡萄糖苷酶，于45-55°C條件下酶解反應48h。
6. 根據權利要求5所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，其特征在于，步驟（2) 中，當酶解底物w/v濃度為15-20%時，酶解采用分批補料的方法。
7. 根據權利要求1、2、4、5或6所述的提高植物纖維原料酶水解得率的方法，其特征在 于，所述的纖維素酶是以里氏木霉產生的一種或多種酶的復合物。
【文檔編號】C12P19/14GK104278065SQ201410472711
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】勇強, 儲秋露, 余世袁, 李鑫, 徐勇, 歐陽嘉 申請人:南京林業大學