熒光定量pcr反應液及試劑盒和熒光定量pcr方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種熒光定量PCR反應液及試劑盒和熒光定量PCR方法。所述熒光定量PCR反應液，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10×SYBR熒光染料，10×PCR buffer，溶質體積百分數為30％的甘油溶液和Ex-Taq酶。本發明優化了PCR實驗的熒光定量PCR反應液，特別是加入一定比例的甘油溶液，以保證Ex-Taq酶的活性，加入BSA與DMSO的組合保證了Tag酶的穩定性及活性并減少引物二聚體的形成，減少熒光定量PCR反應液配置時間，所得PCR反應液可以長期保存在-20℃中，使用方便。
【專利說明】熒光定量PCR反應液及試劑盒和熒光定量PCR方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種熒光定量PCR反應液及試劑盒和熒光定 量PCR方法。
【背景技術】
[0002] 突光定量 PCR(realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是 1996 年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過突光染料或突光 標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件 可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。
[0003] SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。 在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000 倍。所以，一個反應發出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量成比例，且會隨擴增產物的增 加而增加。
[0004] 雙鏈DNA結合染料的優點：實驗設計簡單，僅需要2個引物，不需要設計探針，無需 設計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進行熔點曲線分析，檢驗擴增反應的特異 性，低的初始成本，通用性好，因此國內外在科研中使用比較普遍。
[0005] 常規的熒光定量PCR擴增體系配置，往往是將DNTP、Buffer、Ex_Taq酶等試劑單獨 保存，待要進行PCR擴增時，將樣品分別加到同一 PCR管中，在操作過程中除了經常忘記加 入個別試劑的缺點外，多次的取用會對試劑造成污染，影響后續使用。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是：提供一種減少熒光定量PCR反應液配置時間的熒 光定量PCR反應液及試劑盒和熒光定量PCR方法。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：提供一種熒光定量PCR反應 液，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10XSYBR熒光染料，10XPCR buffer，溶質體積百分數為30 %的甘油溶液和Ex-Taq酶。
[0008] 本發明的另一技術方案為提供一種突光定量PCR試劑盒，其包含上述的突光定量 PCR反應液。
[0009] 本發明的又一技術方案為提供一種突光定量PCR方法，包含使用上述的突光定量 PCR反應液的步驟。
[0010] 本發明的有益效果在于：本發明優化了 PCR實驗的熒光定量PCR反應液，特別是 加入一定比例的甘油溶液，以保證Ex-Taq酶的活性，加入BSA與DMSO的組合保證了 Tag酶 的穩定性及活性并減少引物二聚體的形成，減少熒光定量PCR反應液配置時間，所得PCR反 應液可以在_20°C下，保存時間可長達2年，現有的配置方法是將PCR反應液所需要的藥品 如二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，Ex-Taq酶等各自保存在其最適溫度中，等要配置熒光定量 PCR體系時在將其混合，每次配置體系時都是現配現用，相對麻煩。本發明通過研發一種可 以一次性配置熒光定量PCR反應液的又不影響其擴增效率的試劑盒。便于商業生產。實現 一次配置，隨時取用，大大減輕了熒光定量PCR的準備時間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為AK109848基因擴增曲線圖；
[0012] 圖2為AK109848基因擴增溶解曲圖；
[0013] 圖3為AK070626基因熒光定量標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0014] 為詳細說明本發明的技術內容、所實現目的及效果，以下結合實施方式并配合附 圖予以說明。
[0015] 本發明最關鍵的構思在于：本發明在熒光定量PCR反應液中加入甘油、BSA與DMSO 保證Ex-Taq酶及其他組分的穩定性及活性，使其可以長期保存在-20° C中，可隨時取用提 高PCR的擴增效率。
[0016] 實施例1
[0017] -種突光定量PCR反應液，包括如下的原料制備而成：5_10 μ 1二甲亞砜，5_10 μ 1 質量體積百分數為0.1%牛血清蛋白溶液，5-2(^11011110階13溶液，10-3(^110\5￥81? 熒光染料，10-30 μ I 10XPCR buffer，10-50 μ 1溶質體積百分數為30 %甘油溶液和3-6 μ 1 Ex-Taq 酶。
[0018] -種突光定量PCR反應液，包括如下的原料混和而成：5_10μ 1二甲亞砜，5_10μ 1 質量體積百分數為0.1%牛血清蛋白溶液，5-2(^11011110階13溶液，10-3(^110\5￥81? 熒光染料，10-30 μ I 10XPCR buffer，10-50 μ 1溶質體積百分數為30 %甘油溶液和3-6 μ 1 Ex-Taq 酶。
[0019] -種突光定量PCR反應液，包括如下的原料混合而成：5_10μ 1二甲亞砜，5_10μ 1 質量體積百分數為0.1%牛血清蛋白溶液，5-2(^11011110階13溶液，10-3(^110\5￥81? 熒光染料，10_30μ I 10XPCR buffer，10-50y 1溶質體積百分數為30%甘油溶液和3-6μ 1 Ex-Taq 酶。
[0020] 實施例2
[0021] -種突光定量PCR反應液，由如下的原料混合而成：7. 5μ 1二甲亞砜，7. 5μ 1質量 體積百分數為〇.1%牛血清蛋白溶液，1(^11〇禮〇階？溶液，2(^110\5￥81?熒光染料， 20μ1 10XPCR buffer，30yl溶質體積百分數為30%甘油溶液和5μ1 Ex-Taq酶。將配 置好的溶液混勻后離心，存放于_20°C冰箱中。
[0022] 進一步的，上述的熒光定量PCR反應液中，所述10XPCR buffer包含50-200mM的 PH 為 8. 3 的 Tris-Hcl 緩沖液，200-800mM Kcl 和 10-20mM Mgcl2。
[0023] 實施例3本發明熒光定量PCR反應液的使用
[0024] 熒光定量PCR標準曲線的制作：以水稻AK070626基因為模板制作標準曲線，按以 下表1對AK070626基因進行樣品稀釋。
[0025] 表 1
[0026]
【權利要求】
1. 一種熒光定量PCR反應液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血 清蛋白，DNTP，10 X SYBR熒光染料，10 X PCR buffer，溶質體積百分數為30 %的甘油溶液和 Ex-Taq 酶。
2. 根據權利要求1所述的熒光定量PCR反應液，其特征在于，包括如下的原料制備而 成：5-10iil二甲亞砜，5-10iil質量體積百分數為0. 1%的牛血清蛋白溶液，5-20iill0mM DNTP 溶液，10-30 ii 110 X SYBR 熒光染料，10-30 ii 110 XPCR buffer，10-50 ii 1 溶質體積百 分數為30 %甘油溶液和3-6 ill Ex-Taq酶。
3. 根據權利要求1所述的熒光定量PCR反應液，其特征在于，包括如下的原料制備而 成：7. 5iil二甲亞砜，7. 5iil質量體積百分數為0. 1%牛血清蛋白溶液，IOiillOmM DNTP溶 液，20iill0XSYBR熒光染料，20iill0XPCR buffer，30iil溶質體積百分數為30%甘油溶 液和 5 ii I Ex-Taq 酶。
4. 根據權利要求1所述的熒光定量PCR反應液，其特征在于，所述10XPCR buffer包 含 50-200mM 的 PH 為 8. 3 的 Tris-Hcl 緩沖液，200-800mM Kcl 和 10-20mM Mgcl2。
5. -種突光定量PCR試劑盒，其特征在于，其包含權利要求1-4任一項所述的突光定量 PCR反應液。
6. -種突光定量PCR方法，其特征在于，包含使用權利要求1-4任一項所述的突光定量 PCR反應液的步驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313152SQ201410578009
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】王清水, 余彥 申請人:福建師范大學