一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法及其相應重組細胞和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法及其相應重組細胞和應用，本發明旨在通過對傳統甲羥戊酸途徑進行改造，通過表達外源的乙酰輔酶A合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶和異戊二烯合成酶，最終在細胞體內建立一條可以利用乙酸為原料合成異戊二烯的新代謝途徑。
【專利說明】一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法及其相應重組細胞和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，涉及利用生物法制備異戊二烯化合物的方法，具體涉及一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法及其相應重組細胞和應用。
【背景技術】
[0002]異戊二烯是一種重要的化工平臺化合物，其95%用于合成橡膠。另外，異戊二烯還可用在醫藥農藥中間體、合成潤滑油添加劑、橡膠硫化劑和航空燃料等方面，其開發利用前景十分廣闊。
[0003]目前，異戊二烯的來源主要是通過石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學合成法(包括異丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5餾分萃取蒸餾法。然而，隨著化石資源的日益枯竭，原料來源是利用石油基原料制備異戊二烯的重要瓶頸問題。
[0004]生物體中主要存在兩種天然的代謝途徑進行異戊二烯的生物合成，即甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑。MVA途徑主要存在于真核生物、古細菌和高等植物的細胞液中，而MEP途徑存在于植物的質體，細菌，藻類。這兩類代謝途徑的最終產物都是形成異戍二烯的前體物質二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)，之后經過異戊二烯合成酶催化DMAPP至異戊二烯。
[0005]微生物具有生長速度快、發酵周期短、遺傳背景清楚、易于工程化操作、可利用廉價的可再生資源等特點，因此微生物作為生物催化劑已成為近年來生產生物基化學品的有效手段。
【發明內容】
[0006]本發明的發明目的是提供了一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法及其相應重組細胞和應用，本發明對利用傳統甲羥戊酸途徑的異戊二烯生物合成途徑進行改造，建立一條合成可以利用乙酸為原料的異戊二烯新代謝途徑的方法，在重組細胞體內，通過基因工程的手段過表達乙酰輔酶A合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶，將乙酸合成乙酰輔酶A，再將其轉化為乙酰乙酰輔酶A后利用傳統MVA部分途徑將其轉化為目標產物異戊二烯，從而構建一條新的利用乙酸為碳源的異戊二烯生物合成途徑。
[0007]為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現:
一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，它包括以下步驟:
(1)依次構建分別含有acs基因、aces基因的載體pGH-acs、pGH-aacs；
(2)構建含有Jsa?基因的載體*CY-1spSPa;構建含有ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和基因的載體 ；
擴增acc基因的accAD片段，將pC0LADuet_l載體與accAD片段分別用Pst I和Hind///進行雙酶切，酶切后的載體與兩端帶有相應酶切位點的acdi?基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pCOL-acdi?； 擴增acc基因的accBC片段，將pCOL_acc仙與accBC片段分別用Bgl II和Xho I進行雙酶切，酶切后的載體與acMC基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為含有accADBC基因的重組質粒pCOL-ac^^1 ；
所述pGH-acs與所述載體分別用Nde I和Bgl II進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段aa按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒ViChccADBC-acs ；
所述pGH-aacs與所述載體pCOL-accylflZC-acs分別用ZSo J和Pac J進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段aaa按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒vOdL_3CCJWBCy3CS_33CS ;
(3)擴增HMGS基因，將所述pkCY-1spSPa與基因HMGS分別用FseI和PvuI進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段mi?按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒V似_ispSPa-HMGS ；
擴增HMGR基因，將pkC1-HMGS-1spSPa與基因HMGR分別用Nco I和BatnH I進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段嫌從按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒xAC1-HMGR-1spSPa-HMGS ；
(4)將載體 vWX-HMGR-1spSPa-HMGS、pTrc-ERG12~ERG8~ERG19-1DIl 和\>COL-accADBC-acs-aacs共同轉化大腸桿菌,涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨節青霉素抗生素的LB固體平板，獲得陽性克隆YJM57工程大腸桿菌；
(5)將活化后的YJM57工程大腸桿菌接種到含有卡那霉素、氯霉素或氨芐霉素的LB液體培養液中培養，當OD6tltol為0.6-0.8時，在菌液中加入誘導劑至終濃度0.5 mmol.L—1，然后轉入在30°C下繼續誘導培養24h，發酵獲得異戊二烯。
[0008]本發明還提供了一種合成異戊二烯的重組細胞，所述重組細胞包含對應編碼產生乙酰輔酶A合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶的基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、異戊二烯合成酶，該重組細胞能夠從乙酸合成異戊二烯。
[0009]所述的重組細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母或微藻。
[0010]本發明還提供了所述的重組細胞在制備化合物或組合物中的應用，所述化合物和組合物包括:異戊二烯、聚異戊二烯、異戊橡膠、丁基橡膠、苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物彈性體、集成橡膠、光盤膠、粘合劑、農藥、香料、潤滑油添加劑、橡膠硫化劑和催化劑。
[0011]本發明中利用乙酸為碳源的新異戊二烯生物合成途徑與傳統MVA途徑相比其優點在于:(1)傳統的MVA途徑只能以葡萄糖為碳源合成目標產物異戊二烯，不能以乙酸為原料合成異戊二烯；而本發明通過基因工程手段過表達乙酰輔酶A合成酶后，可以利用乙酸為原料合成異戊二烯；(2)本發明利用基因工程過表達乙酰輔酶A羧化酶和乙酰乙酰輔酶A合成酶后，與傳統的MVA途徑相比，新途徑使碳源向異戊二烯合成代謝途徑通量增大，同時乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A轉化途徑發生改變:傳統的MVA途徑中是由乙酰輔酶A酰基轉移酶催化乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A，是一步反應；而新途徑是由兩步反應組成:首先，乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰輔酶A合成丙二酸單酰輔酶A，其次，乙酰乙酰輔酶A合成酶催化丙二酸單酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A。
[0012]本發明主要通過基因工程的手段，在細胞中過表達乙酰輔酶A合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶的基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、異戊二烯合成酶獲得的重組細胞含有表達上述酶的基因，該重組細胞能夠從乙酸合成異戊二烯。最終在大腸桿菌細胞中成功建立一種高效的能夠利用乙酸為原料的新異戊二烯生物合成代謝途徑，獲得了可以高效合成異戊二烯的重組細胞，從而建立一條新的利用乙酸為原料的生物催化劑生產異戊二烯的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明中利用乙酸合成異戊二烯新合成途徑的示意圖。
[0014]圖2是本發明中pYJM52 (fiCQL-accAD)的質粒圖譜。
[0015]圖3是本發明中pYJM53 (x>C0L-accADBC)的質粒圖譜。
[0016]圖4是本發明中pYJM54的質粒圖譜。
[0017]圖5 是本發明中 pYJM55的質粒圖譜。
[0018]圖6是本發明中pYJM56 (pACY~ispSF~MGS)的質粒圖譜。
[0019]圖7 是本發明中 pYJM57 ^kC1-HMGR-1spSp-HMGS)的質粒圖譜。
[0020]圖8表明本發明中工程菌YJM57產異戊二烯的時間曲線。
【具體實施方式】
[0021]下面參照具體的實施例進一步描述本發明，但是本領域技術人員應該理解，本發明并不限于下述的具體實施例。
[0022]實施例1
如圖1所示，本發明通過在大腸桿菌中共同過量表達來源于鼠傷寒沙門氏菌{Salmonell aenterica)的乙酰輔酶A合成酶(ACS);來源于大腸桿菌{Escherichiaco7i)乙酰輔酶A羧化酶(ACC);來源于鏈霉菌sp.CL190)的乙酰乙酰輔酶A合酶(AACS),來源于屎腸球菌faecium) 3_輕-3-甲基戍二酰輔酶A合酶(HMGS)和輕甲基戍二酰輔酶A還原酶(HMGR);來源于釀酒酵母cerevisiae)的甲輕戍酸激酶(ERG12)、甲輕戍酸_5_磷酸激酶(ERG8)、甲輕戍酸_5_ 二磷酸脫羧酶(ERG19)、異戊烯焦磷酸異構酶(IDIl)和異戊二烯合成酶(IspS);利用乙酸為原料合成中間產物乙酰輔酶A生物合成異戊二烯。
[0023]所述乙酰輔酶A合成酶基因iacs基因)來源于:I)大腸桿菌{Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655)(GenBank:AAC43163)，或2)來源于其它細菌，優選鼠傷寒沙門氏菌{Salmonell typhimurium LT2) (GenBank: 16767525),或 3)粗糖脈抱菌
erassa ) (66111^111^:1^】83612)、釀酒酵母(5^<^<3/'0焊<^(95.cerevisiae YJM789) (GenBank:EDN59693)、釀酒酵母(feccAaro焊cm cerevisiae S288c) (GenBank:NP_009347)、擬南芥^Arabidopsis thaliana) (GenBank:AED94121)，或 4)來源于其它生物體,和乙酸輔酶 A合成酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0024]所述乙酰輔酶A羧化酶基因(acc基因，即acc燦見'基因)是來源于:1)來源于細菌，優選大腸桿菌 CfocAericAia coli str.K-12 substr.MG1655) (GenBank:accA: 110590387; accB: 110590390; accC: 110590391; accD 110590392)，或 2)谷氨酸棒桿菌 iCorynebacterium glutamicum ATCC 14067) (GenBank:KEI22444);乙酸隹丐不動桿菌況ter sp.ADPI) (GenBank: accA: 50086048; accB: 50084890;accC: 50086323; accD: 50083297);或3)來源于其它生物體，和乙酰輔酶A羧化酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0025]所述乙酰乙酰輔酶A合酶基因iaacs基因)是來源于:I)鏈霉菌iStreptomycessp.CL190)(GenBank:AB272317.1);或 2)煙曲霉fumigatus var.RP-2014)(GenBank: KEY79579);或 3)蘇云金芽抱桿菌thuringiensis IBL 4222 )(GenBank:EEN03006);或4)來源于其它生物體，和乙酰乙酰輔酶A合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0026]所述3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因OWM基因)可以來源于:I)釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: YM4987.09C);或 2)來源于其它細菌，優選屎腸球菌 iBnterococcus faecium) (GenBank: AAG02443.1)，類腸球菌faecal is)(GenBank: ESU74184.1)，金黃色釀胺葡萄球菌aureus) (GenBank:YP—501316.1)，魏氏利斯特菌{Listeria welshimeri) (GenBank: YP—849629.1)，釀胺鏈球菌pyogenes) (GenBank: AAL97584.1);或 3)來源于其它生物體，和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0027]所述羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因OWft?基因)來源于:1)釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: YLR450W);或 2)來源于其它細菌，優選屎腸球菌(Bnterococcus faecium) (GenBank: YP—QQ5354442.1)，類腸球菌
faecal is) (GenBank: AAG02438.2)，金黃色釀胺葡萄球菌{Staphylococcus aureus )(GenBank: AAG02423.1)，釀胺鏈球菌pyogenes) (GenBank:WP—030125991.1);或3)來源于其它生物體，和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0028]所述甲輕戊酸激酶基因QERG12基因)來源于:I)釀酒酵母i^acclmromycescerevisiae) (GenBank: NP—013935.1)，優選釀酒酵母，或2)來源于其它細菌，糞腸球 HEnterococcus faecal is) (GenBank: EPI38248.1)，金黃色釀胺葡萄球菌{Staphylococcus aureus) (GenBank: ABR51486.1)，尿腸球菌 i^nterococcus faecium)(GenBank: EFS06266.1)，釀胺鏈球菌pyogenes)(GenBank: AFV37808.1)；或3)來源于其它生物體，和甲羥戊酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0029]所述甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因iBRGS基因)來源于:1)釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: NP—013947.1 )，優選釀酒酵母，或 2)來源于其它細菌，類腸球菌faecaliS^) (GenBank: WP—016626966.1)，金黃色釀胺葡萄球菌aureus) (GenBank: AIA27148.1),屎腸球菌、Enterococcusfaecium) (GenBank: WP—016629841.1)，釀胺鏈球菌pyogenes)(GenBank:WP—023613167.1);或3)來源于其它生物體，和甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0030]所述甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因(說價^基因)來源于:1)釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: AY757921.1),優選釀酒酵母，或 2)來源于其它細菌，幾腸球 ^iEnterococcus faecalis、(GenBank: YP_005707688.1)，屎腸球菌(Bnterococcus faecium) (GenBank: EPI24610.1),釀胺鏈球菌(Sirep1coccWspyogenes) (GenBank: AAL97580.1);或3)來源于其它生物體,和甲輕戍酸-5-二磷酸脫羧酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0031]所述異戍烯焦磷酸異構酶基因iIDIl基因)來源于:1)釀酒酵母iSeicclmromycGScerevisiae) (GenBank:ΝΡ_015208.1)，優選釀酒酵母，或2)來源于其它細菌，糞腸球菌iEnterococcus faecalis、(GenBank: NP_814639.1),金黃色釀胺葡萄球舊{Staphylococcus aureus) (GenBank: YP_501084.1),屎腸球菌{Enterococcusfaecium) (GenBank: ERK34722.1),釀胺鏈球菌(Sirep1coccWs pyogenes) (GenBank:YP_001128672.1)或3)來源于其它生物體，和異戊烯焦磷酸異構酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0032]所述異戍二烯合成酶基因(JspS基因)來源于:1)銀白楊iPopulus alba )(GenBank: AB198180),優選銀白楊，或 2)黑楊nigra ) (GenBank: AM410988),或3)白楊 X 歐洲山楊alba x Populus tremula ) (GenBank: AJ294819)或 4)和異戊二烯合成酶基因同源性超過70%的核酸序列，或3)來源于其它生物體，和異戊二烯合成酶基因沒有明顯的同源性，但和異戊二烯合成酶基因具有相同或相似功能的核酸序列。
[0033]1.外源基因的克隆 1.1外源基因的克隆
1.1.1鼠傷寒沙門氏菌乙酰輔酶A合成酶基因的克隆
選取來自鼠傷寒沙門氏菌{Salmonella typhimurium LT2)的乙酰輔酶A合成酶基因(.acs), GenBank: 16767525，由上海捷瑞公司通過化學合成方法獲得，之后與載體pGH(上海捷瑞生物工程有限公司)連接得到pGH-a^。
[0034]1.1.2大腸桿菌乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆
提取疋coli的基因組DNA，根據GenBank序列設計引物，PCR擴增乙酰輔酶A合成酶基因，GenBank:accA 110590387 ; accB 110590390; accC 110590391; accD110590392。再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。
[0035]擴增引物序列為:
accAD-L:5， -AAAACTGCAGAGTCTGAATTTCCTTGATTTTG-3，
accAD-R:5， -CCCAAGCTTTCAGGCCTCAGGTTCCTGA-3，
accBC-L: 5’ -GGAAGATCTATGGATATTCGTAAGATTAAAAAACT-3>
accBC-R: 5’ -CCGCTCGAGTTATTTTTCCTGAAGACCGAG-3，。
[0036]1.1.3鏈霉菌乙酰乙酰輔酶A合酶基因的克隆
來自鏈霉菌sp.CL190)的乙酰乙酰輔酶A合酶基因Caac1S^GeneID: 325302226，由上海捷瑞公司通過化學合成方法獲得。之后與所述載體pGH連接得到pGH~aacs。
[0037]1.1.4屎腸球菌3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因的克隆提取屎腸球菌的基因組DNA，根據GenBank序列設計引物，PCR擴增3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因(GenBank: AAG02443.1)，再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。
[0038]擴增引物序列為:
HMGS-F: 5’ -ATGCGGCCGGCCATGAAAATAGGGATTGATCGTCTTT-3> ；
HMGS-R: 5’ -ATCGGCGATCGCTTATATTTTGTAGTAACGA-3，。
[0039]1.1.5屎腸球菌羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的克隆
提取屎腸球菌的基因組DNA，根據GenBank序列設計引物，PCR擴增羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(GenBank: YP_005354442.1)，再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。
[0040]擴增引物序列為:
HMGR-F: 5’ -ATGCCCATGGATGAAAGAAGTCGTTATGATAG-3> ；
HMGR-R: 5’ -ATTGGGATCCTTATTTTTCCCGGATTTTTTCCA-3，。
[0041]1.1.6釀酒酵母MVA下游代謝途徑基因的克隆
釀酒酵母MVA下游代謝途徑基因包括四個基因'ERG12，ERG8, ERG19和IDIl。四個基因的克隆參照文獻獲得(Jianming Yang, Guang Zhao, Yuanzhang Sun, Yanning Zheng,Xinglin Jiang, Wei Liuj Mo Xian*.B1—isoprene product1n using exogenousMVA pathway and isoprene synthase in E.col1.B1resource Technology, 2012，104:642 - 647.)
1.1.7銀白楊異戊二烯合成酶基因的克隆
選取來自于alba 的基因{ispSPi0 GenBank N0.AB198180)基因序列進行稀有密石馬子分析(http://www.genscript.com/ cg1-bin/tools/ rare_ codon_analysis),并將其稀有密碼子優化為疋coli偏好的密碼子(http://www.jcat.de/)。優化后的異戊二烯合成酶基因、ispSj送上海捷瑞公司進行化學合成，連入pGH載體上分別形成pGH-1spSPa載體。
[0042]2.表達載體的構建
2.1 pYJM8載體的構建
pYJM8載體(即載體pACY-15775>3),其構建參照文獻獲得(Jianming Yang, Guang Zhao,Yuanzhang Sun, Yanning Zheng, Xinglin Jiang, Wei Liu, Mo Xian*.B1-1sopreneproduct1n using exogenous MVA pathway and isoprene synthase in E.col1.B1resource Technology, 2012, 104:642 - 647.)?
[0043]2.2 pYJM14載體的構建
PYJM14載體(即載體pTrc-汾)，其構建參照文獻獲得(JianmingYang, Guang Zhao, Yuanzhang Sun, Yanning Zheng, Xinglin Jiang, Wei Liu, MoXian*.B1-1soprene product1n using exogenous MVA pathway and isoprenesynthase in E.col1.B1resource Technology, 2012, 104:642 - 647.)
2.3 pYJM52載體的構建
利用下列引物 accAD-L (5，-AAAACTGCAGAGTCTGAATTTCCTTGATTT TG-3’)和 accAD-R (5，-CCCAAGCTTTCAGGCCTCAGGTTCCTGA-3，)和大腸桿菌基因組為模板擴增acc基因的accAD片段(兩端帶有與載體連接的相應酶切位點)。
[0044]將pCOLADuet-1 載體(Novagen 公司)與基因 accAD 分別用 Pst I 和 Hind III 進行雙酶切，酶切后的載體與兩端帶有相應酶切位點的acdi?基因按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6 h，連接產物轉化疋coli DH5 α，然后涂布加有卡那霉素的LB固體平板，PCR擴增篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pYJM52(pC0L-acc仙)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。質粒構建圖譜如圖2所示。
[0045]2.4 pYJM53載體的構建
利用下列引物 accBC-L (5，-GGAAGATCTATGGATATTCGTAAGATTAA AAAACT-3’)和 accBC-R(5’ -CCGCTCGAGTTATTTTTCCTGAAGACCGAG -3’ )和大腸桿菌基因組為模板擴增acc基因的片段(兩端帶有與載體連接的相應酶切位點)。
[0046]將pYJM52載體與accl片段分別用奴7 JJ和通ο /進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段acMC按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6 h，連接產物轉化疋coli DH5 α，然后涂布加有卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pYJMSSbCOL-acdi^C)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。質粒構建圖譜如圖3所示。
[0047]2.5 pYJM54載體的構建
如圖4所示，將所述載體pGH-aa與所述載體pYJM53分別用Nde I和Bgl II進行雙酶切，酶切后的載體PYJM53與外源基因片段aa按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6 h，連接產物轉化疋coli DH5a，然后涂布加有卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pYJMSMpCOL-acdi^C-aa)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。質粒構建圖譜如圖4所示。
[0048]2.6 pYJM55載體的構建
如圖5所示，將所述載體pGH-aaa與所述載體pYJM54分別用Xho I和Pac /進行雙酶切，酶切后的載體PYJM54與外源基因片段aaa按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6 h，連接產物轉化疋coli DH5 a，然后涂布加有卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pYJM55 (vCOL-accADBC-acs-aacs)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。質粒構建圖譜如圖5所示。
[0049]2.7 pYJM56載體的構建
利用下列引物 HMGS-F: (5，-ATGCGGCCGGCCATGAAAATAGGGATTGAT CGTCTTT-3’)和HMGS-R: (5’ -ATCGGCGATCGCTTATATTTTGTAGTAACGA -3’)和屎腸球菌基因組為模板擴增邏51?基因(兩端帶有與載體連接的相應酶切位點)。
[0050]將PYJM8載體與基因mi?分別用/和/^ra /進行雙酶切，酶切后的載體PYJM8與外源基因片段mi?按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6 h，連接產物轉化疋coli DH5a，然后涂布加有氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pYJM56 (pACY-1sA^-mS)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。質粒構建圖譜如圖6所示。
[0051]2.8 pYJM57載體的構建
利用下列引物 HMGR-F (5，-ATGCCCATGGATGAAAGAAGTCGTTATGA TAG-3，)和 HMGR-R (5 ’ -ATTGGGATCCTTATTTTTCCCGGATTTTTTCCA-3> )和屎腸球菌基因組為模板擴增邏況基因(兩端帶有與載體連接的相應酶切位點)。
[0052]將pYJM56載體與基因HMGR分別用Nco I和BernH I進行雙酶切，酶切后的載體PYJM56與外源基因片段趟--按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6 h，連接產物轉化疋coli DH5 α，然后涂布加有氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒PYJM57 ^kC1-HMGR -1spSP~HMGS)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。質粒構建圖譜如圖7所示。
[0053]3.E.co7i重組菌株的構建
將載體 PYJM57 {vkC1-HMGR-1spSP-HMGS)、pYJM14 i^\rc-ERG12-ERG8- ERG19-1DI1)和pYJ155 (pCOL-accADBC-acs-aacs)重組質粒共同熱擊轉化萬.coli BL21(DE3)感受態細胞，涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素抗生素的LB固體平板，通過PCR篩選獲得陽性克隆，由此獲得YJM57工程大腸桿菌。
[0054]本發明獲得的重組細胞包含下述基因片段:乙酰輔酶A合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、異戊二烯合成酶，該重組大腸桿菌能夠從乙酸合成異戊二烯。
[0055]所述的重組細胞為細菌細胞，如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌或真菌細胞(如釀酒酵母)，或微藻等通過基因工程技術構建而成的。
[0056]所述的重組細胞可以用于制備化合物或組合物，所述化合物和組合物包括:異戊二烯、聚異戊二烯、異戊橡膠、丁基橡膠、苯乙烯一異戊二烯一苯乙烯嵌段共聚物彈性體、集成橡膠、光盤膠、粘合劑、農藥、香料、潤滑油添加劑、橡膠硫化劑和催化劑。
[0057]4.工程菌發酵實驗
將構建好的重組質粒轉化到感受態細胞中，通過發酵罐發酵對重組菌進行發酵培養，利用氣象色譜技術對發酵產物進行定性和定量的檢測。
[0058]挑取單克隆到50ml含有醋酸鈉的M9種子培養基(I L M9 salts:5 g NaAc, 6 gNa2HPO4, 3 g KH2PO4,1 g NH4Cl, 0.5 g NaCl, 0.24 g MgSO4,121° C 高壓蒸汽滅菌 15min。)中，37°C，180rpm活化過夜(18-24h)。將種子按10%的接種量接種至含有2L發酵培養基(14.6 g/L K2HPO4, 4 g/L KH2PO4, 10 g/L (NH4)2SO4, 2 g/L 檸檬酸鈉，2.05 g/L 醋酸鈉，0.117 g/L甜菜堿，0.011 g/L氯化鈣，0.72 g/L硫酸鎂，IX維生素(Sigma)和IX微量元素溶液.1000X微量元素溶液(每升)含有鑰酸銨0.123mg;硫酸鋅0.097mg;硼酸 0.823mg;硫酸銅 0.083mg;氯化錳 0.527mg ,4ml IM 硫酸鎂，1900ml 蒸餾水)的5L小型發酵罐中，通氣量1.3 VVM，轉速400rpm，37° C培養至OD6tltl約為12時，0.25mM IPTG，30°C誘導表達，以純醋酸調pH，控制pH在7.0，每隔8h補加一次IPTG。得到的異戊二烯產物通過GC對其進行定性和定量分析。每4h取發酵液5ml，測定細胞0D_、葡萄糖濃度；每15min取尾氣1ml，利用氣相色譜檢測產物異戊二烯濃度。直到OD不再變化，產物不再產生為止。
[0059]檢測條件:GC系統采用山東魯南瑞虹SP-6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP-1NNOffAX column(25 mX250 ymX0.2 μ m)，檢測器為FID檢測器；氣化室溫度200 °C，檢測器溫度230 °C，載氣流速:lml/min.柱升溫程序為:50°C保溫0.5min,
4 V Mn 升至 70 V，
25 0C /min 升至 250 °C，保溫 5min。
[0060]圖8表明，工程菌YJM57的異戊二烯產量(■)和細胞生長(▲)。當工程菌細胞生長12h開始進行誘導培養。
[0061]以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)依次構建分別含有acs基因、SCC1S基因的載體pGH-acs、pGH-aacs； (2)構建含有Jsa?基因的載體*CY-1spSPa;構建含有ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和 基因的載體 ； 擴增acc基因的accAD片段，將pCOLADuet_l載體與accAD片段分別用Pst I和Hind///進行雙酶切，酶切后的載體與兩端帶有相應酶切位點的acdi?基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pCOL-acdi?； 擴增acc基因的accBC片段，將pC0L_acc仙與accBC片段分別用Bgl II和Xho I進行雙酶切，酶切后的載體與acMC基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為含有accADBC基因的重組質粒pCOL-ac^^1 ； 所述pGH-acs與所述載體分別用Nde I和Bgl II進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段aa按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒ViChccADBC-acs ； 所述pGH-aacs與所述載體pCOL-accylflZC-acs分別用ZSo J和Pac J進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段aaa按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒vOdL_3CCJWBCy3CS_33CS ; (3)擴增HMGS基因，將所述pkCY-1spSPa與基因HMGS分別用FseI和PvuI進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段mi?按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒V似_ispSPa-HMGS ； 擴增HMGR基因，將pkC1-HMGS-1spSPa與基因HMGR分別用Nco I和BatnH I進行雙酶切，酶切后的載體與外源基因片段嫌從按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒xAC1-HMGR-1spSPa-HMGS ； (4)將載體 vWX-HMGR-1spSPa-HMGS、pTrc-ERG12~ERG8~ERG19-1DIl 和\>COL-accADBC-acs-aacs共同轉化大腸桿菌,涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨節青霉素抗生素的LB固體平板，獲得陽性克隆YJM57工程大腸桿菌； (5)將活化后的YJM57工程大腸桿菌接種到含有卡那霉素、氯霉素或氨芐霉素的LB液體培養液中培養，當OD6tltol為0.6-0.8時，在菌液中加入誘導劑至終濃度0.5 mmol.L—1，然后轉入在30°C下繼續誘導培養24h，發酵獲得異戊二烯。
2.根據權利要求1所述的以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于:所述基因來源于:鼠傷寒沙門氏菌中GenBank: 16767525、粗糙脈孢菌中GenBank:BAJ83612、釀酒酵母中GenBank: EDN59693、釀酒酵母中GenBank:NP_009347、擬南芥中GenBank:AED94121、大腸桿菌中 GenBank:AAC43163 ； 所述accylflZC基因來源于:谷氛酸棒桿菌中GenBank: KEI22444、大腸桿菌中GenBank:accA:110590387; accB: 110590390; accC: 110590391; accD 110590392、乙酸鈣不動桿菌中 GenBank: accA: 50086048; accB: 50084890; accC:50086323; accD:50083297。
3.根據權利要求1所述的以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于:所述aaa基因來源于:鏈霉菌中GenBank:AB272317.1、煙曲霉中GenBank: KEY79579、蘇云金芽孢桿菌中 GenBank:EEN03006 ； 所述HMGS基因來源于:釀酒酵母中GenBank: YM4987.09C、糞腸球菌中GenBank:ESU74184.1、金黃色釀胺葡萄球菌中GenBank: YP_501316.1、尿腸球菌中GenBank:AAG02443.1 或釀膿鏈球菌中 GenBank: AAL97584.1。
4.根據權利要求1所述的以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于?.臟HMGR基因來源于:釀酒酵母中GenBank: YLR450W、屎腸球菌中GenBank: ΥΡ_005354442.1、糞腸球菌中GenBank: AAG02438.2、金黃色釀膿葡萄球菌中GenBank: AAG02423.1、釀膿鏈球菌中 GenBank: WP_030125991.1 ； 所述汾基因來源于:釀酒酵母中GenBank: NP_013935.1、糞腸球菌中GenBank:EPI38248.1、金黃色釀胺葡萄球菌中GenBank: ABR51486.1、尿腸球菌中GenBank:EFS06266.1、釀膿鏈球菌中 GenBank: AFV37808.1。
5.根據權利要求1所述的以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于:所述基因來源于:釀酒酵母中GenBank: NP_013947.1、糞腸球菌中GenBank: WP_016626966.1、金黃色釀胺葡萄球菌中GenBank: AIA27148.1、尿腸球菌中GenBank: WP_016629841.1、釀膿鏈球菌中 GenBank: WP_023613167.1 ； 所述汾基因來源于:釀酒酵母中GenBank: AY757921.1、糞腸球菌中GenBank:YP_005707688.1、屎腸球菌中GenBank: ΕΡΙ24610.1、釀膿鏈球菌中GenBank: AAL97580.1。
6.根據權利要求1所述的以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于'驗皿1基因來源于:釀酒酵母中GenBank:ΝΡ_015208.1、糞腸球菌中GenBank: ΝΡ_814639.1、金黃色釀膿葡萄球菌中GenBank: ΥΡ_501084.1、屎腸球菌中GenBank: ERK34722.1、釀膿鏈球菌中 GenBank: ΥΡ_001128672.1 ； 所述/?sa?基因來源于:銀白楊中GenBank:AB198180、黑楊中GenBank:AM410988、白楊X 歐洲山楊中 GenBank:AJ294819。
7.根據權利要求1所述的以乙酸為原料合成異戊二烯的方法，其特征在于:所述步驟(5)中誘導劑為IPTG0
8.一種合成異戊二烯的重組細胞，其特征在于所述重組細胞包含對應編碼產生乙酰輔酶A合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶的基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、異戊二烯合成酶，該重組細胞能夠從乙酸合成異戊二烯。
9.根據權利要求8所述的重組細胞，其特征在于所述的重組細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母或微藻。
10.根據權利要求8所述的重組細胞在制備化合物或組合物中的應用，其特征在于所述化合物和組合物包括:異戊二烯、聚異戊二烯、異戊橡膠、丁基橡膠、苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物彈性體、集成橡膠、光盤膠、粘合劑、農藥、香料、潤滑油添加劑、橡膠硫化劑和催化劑。
【文檔編號】C12N1/21GK104372031SQ201410617430
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月6日 優先權日:2014年11月6日
【發明者】楊建明 申請人:青島農業大學