一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速、靈敏的黃熱病毒微流體基因芯片檢測方法。本發明的檢測方法整合了逆轉錄聚合酶鏈式反應RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強大的分子生物學技術，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應腔整合到一張芯片上，PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中。檢測方法包括如下步驟：樣本處理，RNA核酸提取，RT-PCR擴增反應，雜交，清洗，結果判定。通過本發明可大幅度提高出入境口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止重大蟲媒傳染病的輸入。
【專利說明】一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及體外診斷試劑【技術領域】，具體涉及一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢 測方法。
[0002] 背景介紹
[0003] 隨著全球經濟一體化和貿易自由化，國外的醫學媒介生物通過先進的交通工具和 國際貿易，可以迅速把傳染病從一個國家或地區傳向全球，造成國際間傳播。近年來，新發 病毒性傳染病在世界各國頻頻暴發流行，對人類健康帶來嚴重威脅，給社會造成巨大經濟 損失。這些新發病毒性傳染病的頻發給我們敲響了警鐘，加強對其的研宄和監測以及早預 防控制是至關重要的。
[0004] 蟲媒病毒是一類通過吸血節肢動物叮咬敏感脊椎動物宿主而在人畜之間進行傳 播的病毒，其中100多種可以導致人畜疾病，嚴重者會導致死亡。黃熱病毒屬于蟲媒病毒，B 組，為RNA病毒、呈球形、長約20?60納米。在一70°C下保存10年仍有活力，在室溫下容 易滅活，(TC下經48小時失去活性。主要由庫蚊和伊蚊傳播。雖未在我國出現，但是庫蚊和 伊蚊在我國分布廣泛，為其傳入提供了方便。黃熱病毒引起的急性傳染病黃熱病，主要流行 于非洲和中、南美洲，3-4月份的病例較多。黃熱病是黃熱病毒引起的急性傳染病。臨床以 發熱、黃疽、蛋白尿、相對緩脈和出血等為特征。1907年黃熱病被《國際衛生公約》列為國際 檢疫傳染病。近十年來，在非洲和拉丁美洲的十幾個國家先后發生了數次黃熱病散發流行， 而在我國尚無發病。對這些病原的快速檢測技術的研宄目前尚屬空白。隨著我國商貿、旅 游業的快速發展，境內外人員交往日益密切，以及動物的進口等影響，黃熱病毒輸入的危 險性日益增高。因此，盡快建立快速簡便、特異敏感的檢測方法對防范黃熱病毒的輸入具 有重要意義。
[0005] 基因芯片采用微加工和微電子技術將大量的人工設計好的基因片段有序地、高密 度地排列在纖維膜等載體上。基因芯片可以同時固定大量的探針分子，可以在一次實驗中 檢出多種病原體；同時檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在病原體分析檢測 中有很好的應用前景。
[0006] 本發明整合了逆轉錄聚合酶鏈式反應RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強大的 分子生物學技術，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應腔整合到一張芯片上，PCR雜交的探針 直接固定在微陣列中的雜交艙中。操作簡單，節省時間，靈敏度高，特異性好。為黃熱病毒 的檢測提供了快速，簡便，靈敏的微流體基因芯片檢測方法。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏的黃熱病毒微流體基因芯片檢 測方法。通過本發明可大幅度提高進出口 口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工 作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止 外來輸入性傳染病的發生。
[0008] 本發明所提供的黃熱病毒微流體基因芯片檢測方法，包括如下檢測步驟：
[0009] (1)樣本混勻處理；
[0010] (2) RNA 核酸提取；
[0011] (3) RT-PCR 擴增反應：
[0012] a. RT-PCR反應體系包括：RT-PCR反應液，特異性正、反向引物混合液，逆轉錄酶/ DNA聚合酶，DEPC水，RT-PCR質控品，樣本RNA核酸；
[0013] b.將RT-PCR反應液加入已固化特異性探針的芯片內，將芯片放入反應室內進行 擴增反應；
[0014] 所述的特異性引物和探針是根據YFVgpl基因特異性引物擴增區內設計，能夠區 別其他病毒株，特異性引物和探針為：
[0015] YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ ID NO 1)
[0016] YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ ID NO 2)
[0017] YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ ID NO 3)
[0018] (4)雜交：RT-PCR擴增完后，加入雜交反應液，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙 內進行雜交反應；
[0019] (5)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；
[0020] (6)結果判定：根據雜交結果，判定感染情況。
[0021] 步驟（2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取試劑盒提取。取HOul血液樣本， 裂解后，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
[0022] 步驟（3)中所述的RT-PCR反應體系為：2X RT-PCR反應液12. 5ul，引物混合液 2.5111，1411111%5042.5111，？0?6四(16!120 1111，逆轉錄酶/1)嫩聚合酶1111，？0?質控2111，樣 本 3. 5ul。
[0023] 步驟（3)中所述的RT-PCR擴增的反應條件是：50°C逆轉錄20min ;95°C預變性 2!1^11;95°0變性1〇8,60°0退火4〇8,72°0延伸5〇8;11個循環，每個循環退火溫度降低1°〇， 直至退火溫度變成50°0。95°0變性158,56°0退火4〇8,72°0延伸5〇8,40個循環。
[0024] 步驟（4)中所述的雜交反應條件是：95°C預變性3min ;58°C雜交30min。
[0025] 步驟（5)中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。
[0026] 步驟（3)所述的PCR擴增與步驟（4)所述的雜交在芯片儀上完成。
[0027] 本發明與現有檢測方法相比，將RT-PCR的擴增過程和分子雜交檢測過程濃縮到 一張基因芯片上檢測，整個檢測在3個小時內完成，大大縮減了檢測的時間和復雜性，檢測 設備簡單也易于攜帶。本發明的檢測方法簡單快速，靈敏度高，特異性好，為黃熱病毒的檢 測提供了快速，簡便，靈敏的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1實施例1黃熱病毒陽性樣本微流體基因芯片檢測結果。
[0029] 本實施例中測檢測結果顯示本樣本在黃熱病毒屬和黃熱病毒毒株均顯示為陽性。
[0030] 圖2實施例1陰性對照樣本微流體基因芯片檢測結果。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0032] 實施例1黃熱病毒樣本微流體基因芯片檢測
[0033] -、實驗步驟
[0034] 1.樣本準備
[0035] 本實施例中，陽性樣本為減毒的黃熱病毒17D毒株，陰性對照樣本為健康人的血 液。
[0036] 2. RNA 的提取
[0037] 使用病毒RNA提取試劑盒（離心柱型）提取樣本RNA。取HOul樣本，按照試劑盒 說明書中的操作步驟提取RNA，最后用60ul洗脫液洗脫RNA。
[0038] 3.靶基因的擴增
[0039] 3.1引物和探針的設計
[0040] 根據YFVgpl基因設計的特異性引物和探針為：
[0041] YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ ID NO 1)
[0042] YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ ID NO 2)
[0043] YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ ID NO 3)
[0044] 特異性探針按照實驗設計方案，分別點入芯片上各自孔中。
[0045] 3. 2RT-PCR 反應平臺
[0046] 在溫度控制儀上進行RT-PCR擴增與雜交反應。為防止引物間的互相干擾，RT-PCR 反應同時在兩個反應室中進行，兩個反應室都可以聯通到雜交室，RT-PCR后的擴增液可以 通過注射推送方式使其流入雜交室進行雜交反應。
[0047] RT-PCR反應體系為：2X RT-PCR反應液12. 5ul，引物混合液2. 5ul，14mM MgS042.5ul，PCR Grade H20 lul,逆轉錄酶/DNA 聚合酶 lul，PCR 質控 2ul,樣本 3.5ul。
[0048] 反應條件為：50°C逆轉錄20min ;95°C預變性2min ;95°C變性10s，60°C退火40s， 72°C延伸50s ; 11個循環，每個循環退火溫度降低1°C，直至退火溫度變成50°C。95°C變性 15s，56°C 退火 40s，72°C延伸 50s，40 個循環。
[0049] 4.雜交反應
[0050] 分別向兩個RT-PCR反應室中加入14. 5ul雜交液，使雜交液和擴增液都進入到雜 交反應艙內。雜交反應條件是95°C預變性3min，58°C雜交30min。雜交后的芯片用洗液離 心（3000rpm，2min)洗絳，在芯片掃描儀上進行信號檢測。
[0051] 二、實驗結果
[0052] 從圖1和圖2的檢測信號圖來看，RT-PCR質控點信號正常，陰性對照點信號正常， 雜交對照點信號正常，說明從RT-PCR到雜交的整個反應過程均正常，從而說明整個反應有 效。根據每個點的熒光信號值（詳見表1和表2)，對照整個反應艙的探針設計，陽性樣本 在黃熱病毒探針位置有明顯的雜交信號，而在陰性對照樣本的相應黃熱病毒探針位置處未 發現有雜交信號。通過軟件分析，判定樣本為黃熱病毒感染陽性，而陰性對照樣本判定為陰 性。跟預期的樣本感染情況一致。這表明本發明的微流體基因芯片的檢測性能良好，能準 確地區分陰性及陽性樣本，特異性良好，沒有出現錯判現象。
[0053] 表1陽性樣本的檢測信號數值
[0054]
【權利要求】
1. 一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：包括如下檢測步驟： (1) 樣本混勻處理； (2) RNA核酸提取； (3) RT-PCR擴增反應： a. RT-PCR反應體系包括：RT-PCR反應液，特異性正、反向引物混合液，逆轉錄酶/DNA 聚合酶，DEPC水，RT-PCR質控品，樣本RNA核酸； b. 將RT-PCR反應液加入已固化特異性探針的芯片內，將芯片放入反應室內進行擴增 反應； 所述的特異性引物和探針是根據YFVgpl基因特異性引物擴增區內設計，能夠區別其 他病毒株，特異性引物和探針為： YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ ID NO 1) YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ ID NO 2) YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ ID NO 3) (4) 雜交：RT-PCR擴增完后，加入雜交反應液，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內進 行雜交反應； (5) 清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測； (6) 結果判定：根據雜交結果，判定感染情況。
2. 根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟（2) 中所述的RNA提取使用病毒RNA提取試劑盒提取；所述的RNA提取步驟為：取140ul血液 樣本，裂解后，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
3. 根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟（3) 中所述的PCR反應體系為：2X RT-PCR反應液12. 5ul，引物混合液2. 5ul，14mM MgS042. 5ul， PCR Grade H20 lul,逆轉錄酶/DNA 聚合酶 lul，PCR Control 2ul, Sample 3. 5ul〇
4. 根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟（3) 中所述的RT-PCR擴增的反應條件是：50°C逆轉錄20min ;95°C預變性2min ;95°C變性10s， 60°C退火40s，72°C延伸50s ; 11個循環，每個循環退火溫度降低1°C，直至退火溫度變成 50°〇；951：變性158,561：退火4〇8,721：延伸5〇8,40個循環。
5. 根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟（4) 中所述的雜交反應條件是：95°C預變性3min ;58°C雜交30min。
6. 根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟（5) 中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。
7. 根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟（3) 所述的PCR擴增與步驟（4)所述的雜交在芯片儀上完成。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498621SQ201410654941
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】田楨干, 李深偉, 張子龍, 周璇, 章琪, 李平 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局