鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法

鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，包括：鐵碳納米粒的制備，鐵碳納米粒搭載順鉑，鐵碳納米粒順鉑對喉癌Hep-2細胞微觀結夠、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表達的影響。本發明首次采用磁性納米材料搭載順鉑，提供具有較強磁性及靶向性的化療藥物，應用于臨床后，能夠提高喉癌術前化療效果，為功能性喉癌根治提供必要的、高效的化療藥物，同時能夠應用于術后化療，減少化療藥物的毒副作用，鐵碳納米材料良好的載藥量、穩定的釋放率及較強的靶向性也預示其能夠在喉癌的臨床推廣應用后發揮重要的作用。
【專利說明】鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于臨床醫學【技術領域】，尤其涉及一種鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株 化療敏感性影響的方法。

【背景技術】
[0002] 喉癌是耳鼻喉外科常見惡性腫瘤之一，盡管近年來惡性腫瘤的治療取得了重大的 進展，但喉癌患者的術后復發問題及術后喉部功能下降仍然是喉癌的治療瓶頸，以手術為 主的綜合治療是喉癌主要治療模式。近年來伴隨功能性喉癌外科手術概念的提出，喉癌的 手術切除范圍有縮小趨勢，術前術后的放化療對于減少手術切除范圍及預防術后復發的作 用越來越突出，放射治療對局部組織及周圍器官損傷較大，術前應用常引起局部的組織粘 連、纖維化及瘢痕化等，造成組織層次不清，加大手術難度，術前化療能夠有效的減少局部 腫瘤的浸潤程度，對微轉移灶起到良好的殺傷作用，對局部的組織結構影響較小，而研宄顯 示，術后的規律化療也能明顯延長患者的生存期。順鉑是臨床常用的化療藥物，在喉癌化療 中可以單獨用藥或者聯合用藥，雖然多數喉癌對順鉑敏感，但是全身化療的嚴重的副作用 不可避免，同手術常構成對患者的雙重打擊，甚至部分體質較差的患者難以耐受足夠療程 的化療，進而影響術后的生存時間，因此，減少化療藥物的毒副作用而增強化療效果已經成 為喉癌綜合治療中亟待解決的問題。
[0003] 伴隨納米技術的發展，納米材料在醫療領域的應用取得了快速發展，納米材料荷 載藥物對疾病進行治療取得了重大進展。納米材料荷載藥物后，能夠在靶器官持續釋放，維 持靶器官部位足夠的藥物濃度，能夠取得優于傳統藥物的治療效果，鐵碳納米微粒是納米 材料的一種，鐵碳納米粒中納米鐵具有較強的磁性及靶向性，碳納米晶的比表面積大，具 有極好的活性吸附作用，能以足夠小的粒子吸附大量藥物，是一種較為理想的磁性納米材 料藥物載體。可以搭載各種化療藥物，并獲得理想的載藥率。Rudge等制備出的鐵碳復合納 米微粒可吸附包括阿霉素在內的多種化療藥物，其對載藥率可達到120 y g/mg，3h解吸附 率約為25%，能夠在短時間能釋放足夠的藥物濃度。黃廣建等采用活性炭與納米四氧化三 鐵制成鐵碳復合磁性材料磁性載體搭載阿霉素，最大載藥量可233. 8mg/g，并且具有良好的 釋放效能及磁祀向性。Cao H等對包碳和包娃的兩種磁性載體與鐵碳復合納米微粒對阿霉 素的吸附率和飽和磁強度對比發現，鐵碳復合磁性載體粒徑較均勻、飽和磁化強度較大、最 大載藥量也較高。眾多的研宄結果都表明，同其它納米粒相比，鐵碳納米顆粒的磁響應性更 高，載藥量更大，其搭載藥物更為穩定，在荷載阿霉素、卡鉑等化療藥物對體外培養的肝癌 細胞等惡性腫瘤細胞的干預試驗表明，其對腫瘤細胞的殺傷及抑制效果優于其所荷載的單 藥，能夠取得更好的效果。而且，鐵碳納米材料獨特的熱效應，也為其對惡性腫瘤的治療提 供的更為優良的特性。
[0004] 目前納米材料介導化療藥物對喉癌細胞的殺傷作用國內外尚未見研宄，磁性的鐵 碳納米材料搭載順鉑的工藝國內外也未見報道。
[0005] 喉癌是臨床常見惡性腫瘤，臨床多采用以手術為主的綜合治療手段，但喉癌術后 的并發癥較多，如：咽瘺，言語障礙（嚴重聲撕或失聲），呼吸困難，喉狹窄致長期戴管或氣 管造瘺等等，嚴重影響患者生活質量，且術后復發率較高；放療和化療不破壞喉部的解剖結 構，可避免一些并發癥。但喉癌放療及化療敏感性較差。


【發明內容】

[0006] 本發明實施例的目的在于提供一種鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感 性影響的方法，旨在解決目前納米材料介導化療藥物對喉癌細胞的殺傷作用國內外尚未見 研宄，磁性的鐵碳納米材料搭載順鉑的工藝國內外也未見報道的問題。
[0007] 本發明實施例是這樣實現的，一種鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性 影響的方法，該鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法實現鐵碳納米粒 順鉬對喉癌Hep-2細胞微觀結夠、增殖活性及SurvivinmRNA、caspase3mRNA表達的影響， 具體包括：
[0008] 步驟一，喉癌Hep-2細胞培養及傳代：
[0009] 細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min，佩戴護目鏡及防凍手套，從液氮保存 罐中取出快速取出凍存管，放入4°C無菌蒸餾水中水浴，快速搖晃，直至凍存液完全融化后 置入4°C 10%二甲基亞砜；應用移液器將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入10ml培養 液，離心機l〇〇〇r/min離心5min，分離喉癌細胞，0. 25%胰蛋白酶恒溫水浴箱預熱20min，保 持37°C，培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，培養于含100ml/L胎牛血清、青霉素及 鏈霉素各100u/L的1640培養液中，37°C、體積分數為5%的0) 2培養箱傳代培養，次日更換 培養液；記錄復蘇日期，觀察細胞生長情況；
[0010] 步驟二，培養喉癌細胞分為藥物組、微粒藥物組、空白組和空白微球組，各組加入 相應的處理液；藥物組的處理液為順鉑0. 9%生理鹽水溶液，微粒藥物組為鐵碳納米粒順 鉑0. 9%生理鹽水分散液，空白組是0. 9%生理鹽水，空白微球組是鐵碳納米微粒0. 9%生 理鹽水分散液；
[0011] 步驟三，喉癌細胞生長抑制率檢測：
[0012] 細胞傳代至10-16代，選取對數生長期的喉癌Hep-2細胞，制成細胞濃度為 4 X 103/ml的細胞懸液，接種于24孔培養板中，每孔lml，37°C、5 % C02培養，培養24h待細胞 貼壁、進入對數生長期后，用無血清的RPMI-1640培養液清洗兩次，換液；每孔加入90 y ml 培養液和100 uml處理液；藥物組及微粒組最終濃度梯度為10、20、40、80、16011^/1，每亞組 設5個平行孔；37°C、飽和濕度、5% C02孵箱培養，24、48、72h后，吸除各孔原液，每孔加入 100 y 1MTT液（5g/L)和900 y 1培養液，繼續37°C、飽和濕度、5% C02培養4h，吸除各孔原 液900 y 1，每孔加入900 y 1二甲基亞研^，振蕩混勾30min，自動酶標讀數儀測定570nm各 孔A值；抑制率（fa) = (1-實驗組平均A值/空白組平均A值）X 100% ;
[0013] 步驟四，鐵碳納米粒順鉑抑制喉癌細胞形態學觀察：
[0014] 將各組培養細胞濃度調整為透射電鏡觀察細胞在加藥后的內在結構變化；掃描電 鏡觀察細胞在加藥后的表面形態變化及內部結構變化，重點在細胞膜形態及細胞核形態；
[0015] 步驟五，鐵碳納米粒順鉬對喉癌細胞caspase3mRNA、SurvivinmRNA表達影響，具 體包括以下步驟：
[0016] 第一步，總RNA提取：
[0017] 取各組細胞培養液加入1.5mlEP管中，加入Trizol 1ml，使細胞濃度為1X107/ ml/Trizol，用玻璃棒研磨，充分振蕩混勾，加入氯仿0. 2ml，蓋緊蓋子，輕輕搖動15s， 15-30 °C孵育2_3min，低溫離心機4 °C 12000r/min離心15min，取上清液至新的1. 5mL Eppendorf管，加與上清液等體積的異丙醇，15-30°C孵育樣品10min，4°C 12000r/min離 心lOmin，棄去上清液，保留總RNA在管底的白色沉淀，沉淀采用75%乙醇1. 0ml洗滌洗 絳三次，lml 75%乙醇/ml Trizol，4°C 7500r/min離心5min，棄去上清液，沉淀真空干燥 5-10min，保持適當濕度，以增加溶解度，加DEPC處理水溶解RNA，加入2. 5倍體積75 %乙 醇，-80 °C保存備用；
[0018] 第二步，mRNA提取：總RNA標本解融后，取上述提取的總RNA到一個新的無RNase 的EP管中，用無RNase的水定容到250ul，使RNA處于過飽和狀態，加入Buffer OBB 250ul， Oligotex Suspension 15ul，用手彈勾，70°C水浴3分鐘，RNA退火，裂解RNA二級結構，室 溫條件下，靜置10分鐘，4°C 12000r/min離心2分鐘，小心吸走上清，A液，用Buffer 0W2 400ul重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉淀，然后將這些加到套有1. 5ml EP管的SPIN柱子 上，高速離心1分鐘后將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer 0W2 400ul到柱子，高 速離心1分鐘，丟掉濾過液；將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100ul熱的（70°C ) Buffer 0EB到柱子上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鐘后轉入新的無RNase的EP 管中，加入等體積異丙醇，4°C 12000r/min離心2分鐘，棄去上清，沉淀加入75%乙醇，室溫 干燥，融于250ul無RNase的EP管中，備用；
[0019] 第三步，mRNA引物合成：
[0020] 在GenBank上查找目的基因mRNA序列，米用Primerexpress2. 0軟件在CDS區 設計特異性引物，采用ABI3900臺式高通量DNA合成儀合成引物，序列如下：
[0021] Survivin 序列（擴增片段 AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，長度 129bp)
[0022] Forward primer :5, -AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3'
[0023] Reverse primer ：5, -GAC AAC TGC GTC TCTG-3
[0024] Caspase3序列（擴增片段，長度lOlbp)
[0025] Forward Primer :5, -AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3'
[0026] Reverse Primer :5, -TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3'
[0027] 第四步，逆轉錄：
[0028] 取4yl RNA模板做逆轉錄反應，儀器為ABI 9700儀，反應體系[5X逆轉錄 buffer 4 yl，下游引物（10pmol/y 1)0.4 yl，dNTPs(lOmM) 0.5 yl，MMLV(200U/y 1)1 yl， DEPC 水 10. 1 y 1，RNA 模板；
[0029] 4 y 1，總體積 20 y 1，逆轉錄 buffer 成分（50mM Tris-HCl (pH8. 0)，50mM KC1，4mM MgCl2, lOmM DTT)；
[0030] 第五步，熒光定量PCR反應：
[0031] 采用標準曲線定量法制備陽性標準品，PCR擴增的陽性產物經過2%低熔點瓊脂 糖凝膠電泳，含溴乙啶，用TAE緩沖液配制，在長波紫外下，割下目的條帶；用回收試劑盒 回收純化；測定0D值檢驗純度，0D 260/280 > 1. 8,用0D260測定值和片段長度數據換算 出濃度，即為陽性標準品；取陽性標準品5 y 1按10倍稀釋，加水45 y 1并充分混勻，依次 倍比梯度稀釋，制備成陽性定量標準品梯度；然后待測樣本和陽性標準品PCR反應，反應 條件93°C3分鐘，然后93°C30秒，55°C45秒，72°C45秒，共40循環；反應體系[5XSYBR GreenIPCR1311打61'10 1^1，上游引物？（10卩1]1〇1/1^1)11^1下游引物1?(10卩1]1〇1/1^1)11^1， dNTPs(10mM) 1y1，Taq酶（3U/y1) 1y1，cDNA5y1，ddH20 31y1，總體積 50y1，PCR buffer成分：10mMTris-HCl(pH8.0)，50mMKCl，2mMMgCl2];
[0032] 第六步，標準曲線的制備：
[0033] 標準品以去離子水依次稀釋為4X 102,4X 103,4X 104,4X 105,4X 106;每次擴增 均使用標準品制備標準曲線，范圍為每毫升102-106;拷貝；
[0034] 第七步，PCR產物定量的校正和判定分析：
[0035] 采用GAPDH作為內參照，Survivin mRNA和GAPDH mRNA根據標準曲線得出mRNA 的分子拷貝數；用GAPDH的拷貝數作為校正基數，即目的基因mRNA精確含量=目的基因CT 值/內參照GAPDH CT值；以此比值做統計處理；根據FQ-PCR原理，被激發的熒光信號達到 一定閾值后被熒光探頭采集，最后將其轉換成CT值，該數值與擴增片段的實際拷貝數呈反 比，即CT值越低，實際拷貝數含量越高。
[0036] 進一步，實現鐵碳納米粒順鉬對喉癌Hep-2細胞微觀結夠、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3 mRNA表達的影響之前需要進行以下步驟：
[0037] 步驟一，應用電子天平稱量四氧化三鐵及石墨粉；采用高能球磨技術制備鐵碳納 米粒，球磨結束后用蒸餾水洗滌球磨罐，磁鐵吸附含鐵微粒，所獲洗滌液真空烘干待用，得 到干燥鐵碳納米微粒；
[0038] 步驟二，采用超聲乳化-溶劑揮發法制備磁性鐵碳納米粒順鉑；將鐵碳納米粒和 順鉑溶解在二氯甲烷中，超聲乳化后所得混懸液置于磁鐵上，洗滌，離心，并將所得沉淀物 冷凍干燥、真空干燥、照射滅菌，即得磁性鐵碳納米粒順鉑；
[0039] 步驟三，碳納米粒順鉑載藥量、包封率、磁性、穩定性及釋放性能考察。
[0040] 進一步，在步驟三中載藥量及包封率考察：稱取貼碳納米微粒順鉑20mg于10ml 容量瓶中，20°C加入二甲基亞砜，超聲水浴使其完全溶解，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻、 過濾，采用分管光度計測定吸光度，并計算順鉑濃度及質量，取過濾液超低溫20000r/min 離心60min，使順鉑完全沉積于管底，獲得澄清的游離順鉑溶液；采用分光光度計測定其吸 光度，據標標準曲線公式求出其游離順鉑的濃度并計算質量；將順鉑總量減去離心后游離 順鉑量，即得順鉑吸附量，據此做出計算載藥量及包封率：

【權利要求】
1. 一種鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，其特征在于，該鐵 碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法實現鐵碳納米粒順鉑對喉癌Hep-2 細胞微觀結夠、增殖活性及Survivin mRNA、caspase3mRNA表達的影響，具體包括： 步驟一，喉癌H印-2細胞培養及傳代： 細胞實驗室進行消毒，紫外照射40min，佩戴護目鏡及防凍手套，從液氮保存罐中取出 出凍存管，放入4°C無菌蒸餾水中水浴，快速搖晃，直至凍存液完全融化后置入4°C10%二 甲基亞砜；應用移液器將細胞懸液移入15ml離心管，加入IOml培養液，離心機lOOOr/min 離心511^11，分離喉癌細胞，0.25%胰蛋白酶恒溫水浴箱預熱201^11，保持37°〇，培養液懸液 混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，培養于含lOOml/L胎牛血清、青霉素及鏈霉素各100u/L的 1640培養液中，37°C、體積分數為5%的(1)2培養箱傳代培養，次日更換培養液；記錄復蘇日 期，觀察細胞生長情況； 步驟二，培養喉癌細胞分為藥物組、微粒藥物組、空白組和空白微球組，各組加入處理 液；藥物組的處理液為順鉑0. 9%生理鹽水溶液，微粒藥物組為鐵碳納米粒順鉑0. 9%生 理鹽水分散液，空白組是〇. 9%生理鹽水，空白微球組是鐵碳納米微粒0. 9%生理鹽水分散 液； 步驟三，喉癌細胞生長抑制率檢測： 細胞傳代至10-16代，選取對數生長期的喉癌Hep-2細胞，制成細胞濃度為4XIOVml的細胞懸液，接種于24孔培養板中，每孔lml，37°C、5 %CO2培養，培養24h待細胞貼壁、進 入對數生長期后，用無血清的RPMI-1640培養液清洗兩次，換液；每孔加入90μml培養液和 100μml處理液；藥物組及微粒組最終濃度梯度為10、20、40、80、160mg/L，每亞組設5個平 行孔；37°C、飽和濕度、5%CO2孵箱培養，24、48、7此后，吸除各孔原液，每孔加入100μIMTT 液和900μ1培養液，繼續37°C、飽和濕度、5%C02培養4h，吸除各孔原液900μ1，每孔加入 900μ1二甲基亞研^，振蕩混勾30min，自動酶標讀數儀測定570nm各孔A值；抑制率（fa)= (1-實驗組平均A值/空白組平均A值）X100% ; 步驟四，鐵碳納米粒順鉑抑制喉癌細胞形態學觀察： 將各組培養細胞濃度調整為透射電鏡觀察細胞在加藥后的內在結構變化；掃描電鏡觀 察細胞在加藥后的表面形態變化及內部結構變化，重點在細胞膜形態及細胞核形態； 步驟五，鐵碳納米粒順鉬對喉癌細胞caspase3mRNA、Survivin mRNA表達影響，具體包 括以下步驟： 第一步，總RNA提取： 取各組細胞培養液加入1.5mlEP管中，加入Trizollml，使細胞濃度為lXlOVml/Trizol，用玻璃棒研磨，充分振蕩混勻，加入氯仿0. 2ml，蓋緊蓋子，輕輕搖動15s，15-30°C 孵育2_3min，低溫離心機4°C12000r/min離心15min，取上清液至新的I. 5mLEppendorf 管，加與上清液等體積的異丙醇，15_30°C孵育樣品10min，4°C12000r/min離心10min，棄去 上清液，保留總RNA在管底的白色沉淀，沉淀采用75%乙醇I.Oml洗滌洗滌三次，lml75%乙 醇/mlTrizol，4°C7500r/min離心5min，棄去上清液，沉淀真空干燥5-10min，保持適當濕 度，以增加溶解度，加DEPC處理水溶解RNA，加入2. 5倍體積75%乙醇，-80°C保存備用； 第二步，mRNA提取：總RNA標本解融后，取上述提取的總RNA到無RNase的EP管中， 用無RNase的水定容到250ul，使RNA處于過飽和狀態，加入BufferOBB250ul，Oligotex Suspension15ul，用手彈勻，70°C水浴3分鐘，RNA退火，裂解RNA二級結構，室溫條件下， 靜置10分鐘，4°C12000r/min離心2分鐘，小心吸走上清，A液，用Buffer0W2400ul重懸 含Oligotex/mRNA復合物的沉淀，然后加到套有I. 5mlEP管的SPIN柱子上，高速離心1分 鐘后將SPIN柱子移到EP管上，加Buffer0W2400ul到柱子，高速離心1分鐘，丟掉濾過液； 將SPIN柱子移到EP管上，加20-100ul熱的70°C，BufferOEB到柱子上，用Tip來回吸打 3-4次，高速離心1分鐘后轉入無RNase的EP管中，加入等體積異丙醇，4°C12000r/min離 心2分鐘，棄去上清，沉淀加入75%乙醇，室溫干燥，融于250ul無RNase的EP管中，備用； 第三步，mRNA引物合成： 在GenBank上查找目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0軟件在⑶S區設計 特異性引物，采用ABI 3900臺式高通量DNA合成儀合成引物，序列如下： Survivin序列，擴增片段AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，長度129bp ; Forward primer :5' -AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3' Reverse primer :5' -GAC AAC TGC GTC TCTG-3 Caspase3序列，擴增片段，長度IOlbp ; Forward Primer :5' -AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3' Reverse Primer :5' -TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3' 第四步，逆轉錄： 取4 μ IRNA模板做逆轉錄反應，儀器為ABI 9700儀，反應體系[5X逆轉錄buffer 4 μ 1，下游引物0· 4 μ 1，dNTPsO. 5 μ 1，MMLV 1 μ 1，DEPC水10. 1 μ 1，RNA模板； 4 μ 1，總體積20 μ 1，逆轉錄buffer成分，50mM Tris-HCl pH8.0,50mM KCl，4mM MgCl2，IOmM DTT； 第五步，熒光定量PCR反應： 采用標準曲線定量法制備陽性標準品，PCR擴增的陽性產物經過2%低熔點瓊脂糖凝 膠電泳，含溴乙啶，用TAE緩沖液配制，在長波紫外下，割下目的條帶；用回收試劑盒回收純 化；測定OD值檢驗純度，OD 260/280 > 1. 8,用0D260測定值和片段長度數據換算出濃度， 即為陽性標準品；取陽性標準品5 μ 1按10倍稀釋，加水45 μ 1并充分混勻，依次倍比梯度 稀釋，制備成陽性定量標準品梯度；然后待測樣本和陽性標準品PCR反應，反應條件93°C 3 分鐘，然后93°C 30秒，55°C 45秒，72°C 45秒，共40循環；反應體系[5 X SYBR Green I PCR bufferlO μ 1，上游引物Fl μ 1下游引物Rl μ 1，dNTPsl μ 1，Taq酶1 μ 1，cDNA5 μ 1，CldH2O 31 μ 1，總體積50 μ 1，PCR buffer成分：10mM Tris-HCl，50mM KCl，2mM MgC12 ; 第六步，標準曲線的制備： 標準品以去離子水依次稀釋為4X102,4X103,4X104,4X105,4XIO6;每次擴增均使 用標準品制備標準曲線，范圍為每毫升IO2-IO6;拷貝； 第七步，PCR產物定量的校正和判定分析： 采用GAPDH作為內參照，SurvivinmRNA和GAPDHmRNA根據標準曲線得出mRNA的分 子拷貝數；用GAPDH的拷貝數作為校正基數，即目的基因mRNA精確含量=目的基因CT值/ 內參照GAPDHCT值；以此比值做統計處理；根據FQ-PCR原理，被激發的熒光信號達到閾值 后被熒光探頭采集，最后轉換成CT值，該數值與擴增片段的實際拷貝數呈反比，即CT值越 低，實際拷貝數含量越高。
2. 如權利要求1所述的鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，其 特征在于，實現鐵碳納米粒順鉬對喉癌Hep-2細胞微觀結夠、增殖活性及SurvivinmRNA、 caspase3mRNA表達的影響之前需要進行以下步驟： 步驟一，應用電子天平稱量四氧化三鐵及石墨粉；采用高能球磨技術制備鐵碳納米粒， 球磨結束后用蒸餾水洗滌球磨罐，磁鐵吸附含鐵微粒，所獲洗滌液真空烘干待用，得到干燥 鐵碳納米微粒； 步驟二，采用超聲乳化-溶劑揮發法制備磁性鐵碳納米粒順鉑；將鐵碳納米粒和順鉑 溶解在二氯甲烷中，超聲乳化后所得混懸液置于磁鐵上，洗滌，離心，并將所得沉淀物冷凍 干燥、真空干燥、照射滅菌，即得磁性鐵碳納米粒順鉑； 步驟三，碳納米粒順鉑載藥量、包封率、磁性、穩定性及釋放性能考察。
3. 如權利要求2所述的鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，其 特征在于，在步驟三中載藥量及包封率考察：稱取貼碳納米微粒順鉑20mg于IOml容量瓶 中，20°C加入二甲基亞砜，超聲水浴使其完全溶解，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻、過濾， 采用分管光度計測定吸光度，并計算順鉑濃度及質量，取過濾液超低溫20000r/min離心 60min，使順鉑完全沉積于管底，獲得澄清的游離順鉑溶液；采用分光光度計測定其吸光度， 據標標準曲線公式求出其游離順鉑的濃度并計算質量；將順鉑總量減去離心后游離順鉑 量，即得順鉑吸附量，據此做出計算載藥量及包封率：
4. 如權利要求2所述的鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，其 特征在于，在步驟三中磁性測定： 稱取納米微球，通過VSM繪制納米微粒的磁滯曲線，外磁場的磁場強度用橫坐標表示， 外磁場的方向用正負號表示，縱坐標表示磁場強度下樣品的磁化強度，驗證納米粒的磁性。
5. 如權利要求2所述的鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，其 特征在于，在步驟三中體外釋放性能測定： 稱取適量鐵碳納米粒順鉑，懸浮于IOmlPH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，0. 02%Tween80溫 潤劑，0. 02%NaN3抑菌劑，37°C水浴恒溫條件下，頻率為100次/min振蕩器上振蕩；設定時 間梯度，在各設定時間點取出鐵碳納米粒分散液，12000r/min離心lOmin，除去上清液，剩 余微球用二甲基亞砜完全溶解，l〇〇〇r/min離心2min后，取上清液測定吸光度，計算鐵碳納 米微球的順鉑體外釋放性能。
6. 如權利要求2所述的鐵碳納米粒介導順鉑對喉癌細胞株化療敏感性影響的方法，其 特征在于，在步驟三中磁性納米微球保存期間的穩定性試驗： 將當日制備的磁性鐵碳納米微球凍干粉，置于4°C保存，于0、1、2、3個月后取樣，采用 激光粒徑儀檢測鐵碳納米粒順鉑的粒徑變化。
【文檔編號】C12Q1/02GK104450855SQ201410708979
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月1日 優先權日:2014年12月1日
【發明者】朱力 申請人:朱力