甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法
【專利摘要】本發明涉及品種純度鑒定領域，特別涉及一種甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID3-5為特異性片段進行檢測哈翠種子的純度。本發明提供一種快速高效的、無季節依賴性的、準確的哈翠種子純度的檢測方法，該方法以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進行檢測，父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5是哈翠父母本間的穩定差異片段序列，通過這兩個特異性片段進行檢測，檢測更為迅速，準確。
【專利說明】甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及品種純度鑒定領域，具體而言，涉及一種甜瓜品種哈翠種子純度的快 速檢測方法。
【背景技術】
[0002] 甜瓜是世界范圍的重要經濟作物，在世界上的種植面積僅次于柑橘與香蕉，是全 球第三大水果作物，2009年全球的產量超過2500萬噸。亞洲是甜瓜產量最大的產區，中國 是全球最大的甜瓜生產國。2010年全國甜瓜播種面積590萬畝，總產量1226. 7萬噸，產值 達460億元（許勇，2012)。甜瓜產業在全國種植業發展中占有極其重要的地位，對提高農 民收入水平有重要的作用。哈密型甜瓜主要原產我國新疆，暢銷全國，揚名海外，是世界上 的著名甜瓜類型。隨著設施農業的發展及育種家的不斷努力，使得哈密型甜瓜在新疆以外 的地區種植成功，極大地促進了哈密瓜的生產。
[0003] 甜瓜新型品種"哈翠"是通過新疆哈密型甜瓜親本和亞洲型甜瓜親本雜交成功的 一個哈密型甜瓜優良品種。該品種口感脆爽，果大美觀，產量高，主要種植于江浙及長江流 域，深受市場喜愛。但目前甜瓜"哈翠"的制種仍是采用母本去雄雜交的方式進行，這在操作 過程中可能會出現母本去雄不完全從而導致雜交種不純的現象，對農戶造成極大地損失， 同時會給公司的種子銷售帶來極大風險。目前，鑒定"哈翠"雜交種純度的方法主要是田間 性狀觀察，這樣既耗工又耗時。一種新型快速精確的鑒定方法迫在眉睫。
[0004] 鑒定種子純度的研究早已開展，從早期的蛋白質、同工酶、AFLP到目前的應用 較廣泛的SSR標記等。SSR標記是一類基于簡單重復（simple sequence repeat)序列 的多態性標記，目前廣泛應用于各類作物的多態性分析，遺傳作圖、基因定位及分子標記 輔助育種等方面。現已報道的SSR引物已有1.3萬多條（CuGen DB, Cucurbit Genomics Database)。SRAP標記是由美國加州大學Li和Quiros于2001年提出的序列相關擴增多態 性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP)。SRAP 是在總結已有的 DNA 分子標 記優缺點的基礎上開發的一種新的基于PCR的DNA分子標記技術。其特點是針對基因外顯 子里GC含量豐富而啟動子和內含子里AT含量豐富的特點對ORFs (open reading frames, 開放閱讀框）進行擴增來設計引物進行擴增。正向引物長17bp，5'端的前IObp是一段非 特異性的填充序列，緊接著是CCGG，它們一起組成核心序列，然后是靠著3'端的3個選擇 性堿基，對外顯子進行擴增。反向引物長18bp，即由5'的11個無特異性的填充序列和緊 接著的AATT組成的核心序列，及3'的3個選擇性堿基，對內含子和啟動子區域進行特異 擴增。通過不同引物的組合測試，從而尋找和發現因個體不同以及物種的內含子、啟動子與 間隔長度不等而產生多態性擴增產物。SRAP標記具有簡便、中等產量、高共顯性、重復性、易 于分離條帶及測序等優點，也可以用于嘗試鑒定雜交種的種子的雜交情況及種子真實度， 從而獲得種子純度的數據較為可靠地數據，對種子的繁育及銷售意義重大。
[0005] 在現有的文獻或專利中，SSR標記主要用于生物性狀的標記。在中國公布的專利 中，黃瓜種子純度的快速檢測方法中公開了 SSR標記在黃瓜純度檢測上的應用。而如何將 SSR標記應用于甜瓜純度檢測中亟待研究。
[0006] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0007] 本發明的第一目的在于提供一種甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，該方法 通過選定哈翠種子的父本和母本的特異性基因序列，以該序列為基準進行PCR擴增，將樣 本的PCR擴增產物與純父本和純母本的擴增產物進行對比，來判斷樣本的純度，從而得知 哈翠種子是否為雜交種。本發明通過PCR擴增的方式進行檢測，更為客觀，準確率高，并且 檢測快速高效、無季節依賴性。
[0008] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0009] 甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進行檢測哈翠種子的純度；
[0010] 其中，父本序列SEQ ID 1-2為：
[0011] TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGA AACA- (GA) 18_19
[0012] - GTGTTTTTTGTTTATTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA ；
[0013] 母本序列SEQ ID 3-5為：
[0014] TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGA AACACA -（GA) 36_39- GTGTTTTTTGTTTATTTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA。
[0015] 針對目前甜瓜哈翠種子純度的檢測主要依靠對待測樣品農藝性狀的觀察，費工費 時、占用大量土地且準確率低下的方式，本發明提供一種快速高效的、無季節依賴性的、準 確的哈翠種子純度的檢測方法，該方法以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為 特異性片段進行檢測，父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5是哈翠父母本間的穩 定差異片段序列，通過這兩個特異性片段進行檢測，檢測更為迅速，準確。
[0016] 其中，父本序列SEQ ID 1-2中的（GA) 18_19為18-19個GA重復序列；母本序列SEQ ID 3-5中的（GA) 36_39為36-39個GA重復序列。
[0017] 優選地，以引物CMAGN75分別對哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母 本種子基因組進行PCR擴增來檢測哈翠種子純度；
[0018] 其中，所述引物CMAGN75為：
[0019] F :5' -TGGGTTTTCTTCTACTACTG-3'
[0020] R : 5，-TGCTTTTACTCTCATTCAAC-3，。
[0021] 通過多個引物的篩選，引物CMAGN75在甜瓜品種哈翠雜交種中穩定存在；引物 CMAGN75在雜交種、父本和母本中的基因組中均能PCR擴增得到條帶，但是，該引物在父本 中擴增后得到的條帶較小，該引物在母本中擴增后得到的條帶較大，該引物在雜交種中擴 增后得到的條帶既含有父本的條帶也含有母本的條帶，通過這種區別，即可很好的將父本、 母本和雜交種很好的區分開來。
[0022] 通過分別將哈翠種子基因組、父本基因組和母本基因組以引物CMAGN75進行PCR 擴增，分別得到待測哈翠種子的擴增產物、父本基因組擴增產物和母本基因組擴增產物；將 待測哈翠種子的擴增產物與父本基因組擴增產物和母本基因組擴增產物分別進行條帶對 t匕，從而得到種子的純度。具體為：若條帶只含有母本條帶，則哈翠種子雜交未成功，仍然只 是母本的基因序列；若條帶只含有父本條帶，則哈翠種子雜交未成功，仍然只是父本的基因 序列；若條帶既含有父本的條帶又含有母本的條帶，則哈翠種子雜交成功，為雜交種。
[0023] 采用CTAB法提取哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組， 簡單易行，且提取得到的基因組雜質含量少，濃度高，PCR擴增的條帶清晰，雜帶少。優選地， 哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組均通過CTAB法進行提取。為 了便于提取種植的基因組，優選地，提取基因組前將種子去除種皮。
[0024] 優選地，引物CMAGN75的PCR反應體系為10μ 1，包括以下成分：基因組15-25ng， 濃度為1〇1^上下游引物各0.24 1;1.254]\1的(1階1^2.754 1，10\131^€61'14 1，151111 MgCl2, 1 % Triton Χ-1002 μ I，5U/L 的 Taq DNA 聚合酶(λ 1 μ 1，無菌雙蒸水補齊至 10 μ 1 ;
[0025] 其中，IOXbuffer 中含有 500mM KCl, IOOmM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C 的 pH 為 9. 0 〇
[0026] 以該成分的PCR反應體系進行PCR，得到的PCR產物條帶的單一性強，且條帶清晰。 此外，PCR反應體系也可以為常用的15 μ 1、20 μ 1、50 μ 1的體系，其中的成分相應地增加即 可。
[0027] 優選地，引物CMAGN75的PCR擴增程序為：95°C預變性3-5分鐘；94°C變性1分鐘； 54°C退火45秒；72°C延伸1分鐘；35個循環；72°C延伸5-10分鐘；產物4°C保存。以該程 序擴增的產物含有雜帶少，條帶的濃度適當，很好的滿足檢測的需要。
[0028] 進一步地，引物CMAGN75的PCR產物用1. 8-2. 5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用 1. 8-2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測引物CMAGN75的PCR產物，即可將PCR產物分離開來，很 好的達到檢測的目的。
[0029] 進一步地，還包括以引物a20b37分別對哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和 哈翠母本種子基因組進行PCR擴增來檢測哈翠種子純度；
[0030] 所述引物a20b37為：
[0031] F : 5，-TGAGTCCAAACCGGCAT-3，
[0032] R : 5，-GACTGCGTACGAATTGCA-3，。
[0033] 由于育種方式的原因，商業化的栽培品種在父本間或者母本間仍存在一定的多樣 性，因此，單個父母本間擴增出的差異條帶并不一定說明是父母本間的穩定的差異條帶。本 發明還從多對引物中挑選出引物a20b37,以引物a20b37分別對哈翠種子基因組、哈翠父本 種子基因組和哈翠母本種子基因組進行擴增，引物a20b37在哈翠父本種子基因組和哈翠 種子基因組中能穩定的擴增出約205bp大小的條帶；而在哈翠母本種子基因組中不能擴增 出該條帶。由于引物a20b37能在父本和哈翠種子中均能擴增出特定大小的條帶，以此，可 以鑒別得到種子是否只是母本的序列，從而排除只是母本的狀況。
[0034] 優選地，引物a20b37的反應總體系為10μ 1，包括以下成分：基因組15_25ng，濃 度為 ΙΟμΜ 上下游引物各 0·12μ1，1·25μΜ 的 dNTPs 1.2yl，10Xbyffer 1μ1，15πιΜ MgCl2, I % Triton X-100L 4 μ 1，5U/L 的 Taq DNA 聚合酶 0.12 μ 1，無菌重蒸水補齊至 10μ 1 ；
[0035] 其中，IOXbuffer 中含有 500mM KCl, IOOmM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C 的 pH 為 9. 0 〇
[0036] 以該成分的PCR反應體系進行PCR，得到的PCR產物條帶的單一性強，且條帶清晰。 此外，PCR反應體系也可以為常用的15 μ 1、20 μ 1、50 μ 1的體系，其中的成分相應地增加即 可。
[0037] 優選地，引物a20b37的PCR擴增程序為：94°C預變性3-5分鐘，94°C變性1分鐘、 35°C退火1分鐘、72°C延伸1分鐘，5個循環，94°C預變性1分鐘、50°C退火1分鐘、72°C延 伸1分鐘，35個循環，72°C延伸10分鐘，產物4°C保存。以該程序擴增的產物含有雜帶少， 條帶的濃度適當，很好的滿足檢測的需要。
[0038] 引物a20b37擴增出的條帶較多，瓊脂糖電泳對條帶的分辨率較低，因此，選用 5-7%的非變性聚丙烯酰胺凝膠即可將條帶很好的分離開來，從而實現檢測的目的，進一步 地，引物a20b37的PCR產物用5-7 %非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測。
[0039] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0040] (1)以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進行檢測哈翠 種子的純度，可快速高效的、無季節依賴性的、準確的檢測出哈翠種子的純度；
[0041] (2)特定選用引物CMAGN75鑒定哈翠種子的純度，很好的區分出雜交種子、父本種 子和母本種子，檢測方便易行，準確率高；
[0042] (3)輔以引物a20b37鑒定哈翠種子的純度，進一步確保檢測的準確性，使檢測更 為準確。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0044] 圖1為本發明實施例1中不同引物在父本和母本中擴增的條帶；
[0045] 圖2為本發明實施例1中引物CMAGN75在父本和母本中擴增的條帶；
[0046] 圖3為本發明實施例2中引物CMAGN75在父本、母本和雜交種中擴增產物在瓊脂 糖凝膠上的條帶；
[0047] 圖4為本發明實施例3中引物a20b37在在父本、母本和雜交種中擴增的條帶；
[0048] 圖5為本發明實施例3中引物a20b37在父本和母本中擴增的條帶。
【具體實施方式】
[0049] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市售獲得的常規產品。
[0050] 實施例1
[0051] 分別取哈翠母本種子、哈翠父本種子，分別剝去種皮，利用CTAB法分別提取得到 哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組；
[0052] 將得到的基因組分別采用引物1-12(如表1所示）進行PCR擴增，反應體系均 為1〇μ 1，包括以下成分：基因組15-25ng，濃度為ΙΟμΜ上下游引物各0. 2μ 1 ;1.25μΜ 的 dNTPs 2.75yl，10Xbuffer 1μ1，15πιΜ MgCl2，l %Triton X-100)2yl，5U/L 的 Taq DNA聚合酶0. 1 μ 1，無菌雙蒸水補齊至10 μ I ;其中，10Xbuffer中含有500mM KCl, IOOmM Tri s-HCl，Tris-HCl 在 25 °C 的 pH 為 9. 0 ;
[0053] 表1不同引物的基因序列
[0054]
【權利要求】
1. 甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，以父本序列SEQ ID 1-2和母 本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進行檢測哈翠種子的純度； 其中，父本序列SEQ ID 1-2為： TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTA TTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACA- (GA) 18_19 - GTGTTTTTTGTTTATTTTATTTTTGAGTTGAATGAGA GTAAAA GCA ； 母本序列SEQ ID 3-5為： TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTA TTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACACA- (GA) 36-39- GTGTTTTTTGTTTATTTTTATTTTTGAGTTGAATG AGAGTAAAA GCA。
2. 根據權利要求1所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，以引 物CMAGN75分別對哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組進行PCR 擴增來檢測哈翠種子純度； 其中，所述引物CMAGN75為： F :5' -TGGGTTTTCTTCTACTACTG-3' R :5' -TGCTTTTACTCTCATTCAAC-3'。
3. 根據權利要求2所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，哈翠 種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組均通過CTAB法進行提取；優選 地，提取基因組前將種子去除種皮。
4. 根據權利要求2所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，弓丨 物CMAGN75的PCR反應體系為lOiil，包括以下成分：基因組15-25ng，濃度為lOiiM上下 游引物各0.2111;1.2511]\1的（1階138 2.75111，10\1311打61'1111，1511111%(：12，1%1'1'行〇11 X-1002 ill，5U/L的Taq DNA聚合酶0? 1 ill，無菌雙蒸水補齊至10 ill ; 其中，lOXbuffer 中含有 500mM KC1, 100mM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C的 pH 為 9. 0。
5. 根據權利要求4所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，引物 CMAGN75的PCR擴增程序為：95°C預變性3-5分鐘；94°C變性1分鐘；54°C退火45秒；72°C 延伸1分鐘；35個循環；72°C延伸5-10分鐘；產物4°C保存。
6. 根據權利要求2所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，還包 括以引物a20b37分別對哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組進 行PCR擴增來檢測哈翠種子純度； 所述引物a20b37為： F :5, -TGAGTCCAAACCGGCAT-3， R :5' -GACTGCGTACGAATTGCA-3'。
7. 根據權利要求6所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，弓丨 物a20b37的反應體系為lOiil，包括以下成分：基因組15-25ng，濃度為10iiM上下游 引物各 0? 12 y 1，1. 25 ii M 的 dNTPs 1. 2 y 1，10Xb ii ffer 1 y 1，15mM MgCl2, 1 % Triton X-1001.4iil，5U/L的Taq DNA聚合酶0. 12iU，無菌重蒸水補齊至lOiil ; 其中，lOXbuffer 中含有 500mM KC1, lOOmM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C的 pH 為 9. 0。
8. 根據權利要求7所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在于，引物 a20b37的PCR擴增程序為：94°C預變性3-5分鐘，94°C變性1分鐘、35°C退火1分鐘、72°C延 伸1分鐘，5個循環，94°C預變性1分鐘、50°C退火1分鐘、72°C延伸1分鐘，35個循環，72°C 延伸10分鐘，產物4°C保存。
9. 根據權利要求2-5任一項所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征在 于，引物CMAGN75的PCR產物用1. 8-2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
10. 根據權利要求6-8任一項所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測方法，其特征 在于，引物a20b37的PCR產物用5-7%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404155SQ201410737266
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】巫水欽, 郭誠, 肖建成, 余永輝, 俞金龍 申請人:浙江美之奧種業有限公司