一種纖維素酶突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種纖維素酶突變體及其應用。該纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：3，最適作用溫度為65℃，在70℃條件下能保持96％的酶活，在80℃條件下，仍能保持48％以上的酶活；而野生型的最適作用溫度為60℃，在70℃時僅能保持51％的酶活，在80℃條件下，僅剩11％的酶活。本發明的纖維素酶突變體的最適作用pH為5.5，且在pH4.5-8.0范圍內均能保持60％以上的酶活水平，而野生型僅在pH4.5-7.0范圍內維持60％以上的酶活，至pH8.0時，酶活降為30％，從而說明本發明提供的纖維素酶突變體在堿性條件下的適用范圍更加寬泛，比野生型更適合應用于紡織工業領域。
【專利說明】一種纖維素酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于酶工程【技術領域】，具體涉及一種纖維素酶突變體及其應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素酶是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，主要來源于真菌和細菌，如絲狀 真菌Trichoderma reesei等可大量合成和分泌胞外纖維素酶。其中根據其催化反應的功 能不同，主要分為：外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，纖維素酶對纖 維素的降解，是在多種酶組分的協同作用下完成的。纖維素酶是在工業中應用最廣泛的酶 之一，一般應用于紡織工業、去污劑工業、紙漿和造紙工業、飼料和食品工業、在采油、醫藥 等方面也有巨大的潛在市場。
[0003] 纖維素酶可以按照其一級序列分類成各種糖基水解酶家族，這得到了家族一些成 員的三維結構分析的支持（Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993,1996)。例如，糖 基水解酶家族5、7、12和45含有內切葡聚糖酶。大多數紡織用酸性纖維素酶屬于家族5,而 大多數紡織用中性纖維素酶為家族12或45。
[0004] 目前，利用纖維素酶對纖維素織物進行生物整理即酶降解整理，由于其環保、節能 和高效的效果而得到廣泛應用。織物經整理蓬松、豐滿、柔軟、滑爽、布面清晰、懸垂性好、吸 濕性強，并具有一定的"絲光"效果，纖維素酶的用量在0. 5%-3%，即可達到滿意的整理 效果。酸性纖維素酶在處理纖維織物時，在較短的時間內就產生有效的化學磨損效果，但它 對織物的剝蝕作用強，返沾染效果差，中性纖維素酶對織物的剝蝕作用比酸性纖維素酶弱， 需要較長的作用時間，但沾色較少，處理后可獲得更加豐滿的手感，因此在紡織工業應用廣 泛，需求更為迫切，為了降低成本，節約能源，急需提高纖維素酶在中性偏堿性條件下的酶 活力水平。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種纖維素酶突變體及其應用。本發明通過對纖維素酶進 行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白，在堿性條件下的酶活力得到顯著提高，且耐熱性更 強，更適合應用于紡織工業領域。
[0006] 本發明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID N0 :1的纖維 素酶第10位氨基酸由Cys變為Trp，第29位氨基酸由Ala變為Arg，第61位氨基酸由Thr 變為Ser，第141位氨基酸由Asp變為Lys，第216位氨基酸由Val變為His。
[0007] 上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼基因的核酸序列 為 SEQ ID N0 :4。
[0008] 本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3的纖維素酶突變體基因的 質粒。
[0009] 將上述質粒轉入里氏木霉中進行重組表達。
[0010] 本發明還提供了上述纖維素酶突變體在紡織領域中的應用。
[0011] 本發明所述纖維素酶突變體的最適作用溫度為65°c，在70°C條件下能保持96% 的酶活，在80°C條件下，仍能保持48%以上的酶活；而野生型的最適作用溫度為60°C，在 70°C時僅能保持51 %的酶活，在80°C條件下，僅剩11 %的酶活；從而說明纖維素酶突變體 的耐熱性明顯高于野生型。所述纖維素酶突變體的最適作用pH為5. 5,且在pH4. 5-8. 0范 圍內均能保持60%以上的酶活水平，而野生型僅在pH4. 5-7. 0范圍內維持60%以上的酶 活，至pH8. 0時，酶活降為30%，從而說明本發明提供的纖維素酶突變體在堿性條件下的適 用范圍更加寬泛，比野生型更適合應用于紡織工業領域。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1為發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，
[0013] 其中M所示為蛋白Marker ;泳道1所示為里氏木霉工程菌McE發酵上清液中蛋白 表達情況；泳道2所示為里氏木霉工程菌McE5發酵上清液中蛋白表達情況；泳道3所示為 宿主菌里氏木霉SCHD4發酵上清液中蛋白表達情況；箭頭所指處為分子量為48KDa的蛋白 條帶；
[0014] 圖2為纖維素酶突變體與野生型相對酶活-溫度曲線圖；
[0015] 圖3為纖維素酶突變體與野生型相對酶活-pH曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如 MOLECULARCL0NING:ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是本發明不限定于所述的任何具體方法、實 驗方案和試劑。
[0017] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細描述。
[0018] 實施例1 :纖維素酶突變體基因的合成
[0019] 為了提高纖維素酶（野生型氨基酸序列為SEQIDN0:1，編碼核苷酸序列為SEQ IDN0 :2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在中性偏堿性條件下的酶活力，通過定 向進化技術對該酶進行了大量突變的篩選，設計PCR引物McE-Fl、McE-Rl如下：
[0020] McE-Fl:GGCGAATTCGCCAGCTGCTCCTCCGTCTA(下劃線為限制件內切酶 EcoRI 識別位 點）
[0021] McE-Rl:ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGATACCAG(下劃線為限制件內切酶 Notl 識 別位點）
[0022] 以SEQ ID N0:2基因為模板，以上述引物用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒 (Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，EcoRI、Notl進行酶切處理后與經同樣酶 切后的pET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培 養，待轉化子出現后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150iiL含有0. ImM IPTG的 LB+Amp培養基，37°C 220rpm培養6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復凍融破壁， 獲得含有纖維素酶的大腸桿菌細胞裂解液。
[0023]分別取出50 ii L裂解液至兩塊新的96孔板，分別在pH 6. 0和pH 8. 0的條件下測 定其纖維素酶活，結果發現，有些突變子在堿性條件的酶活力沒有變化，有些突變甚至使其 堿性耐受性降低了，對在pH 8. 0條件下依然保持高活性的突變子進行DNA測序，最終獲得 了能顯著提高纖維素酶堿性耐受性的突變位點組合C10W、A29R、T61S、D141K和V216H。
[0024] 含C10W、A29R、T61S、D141K和V216H五點突變的纖維素酶突變體，其氨基酸序列 為SEQ ID N0 :3,編碼核苷酸序列為SEQ ID N0 :4, SEQ ID N0 :4由上海生工生物工程股份 有限公司合成完成，并且在合成序列5'和3'兩端分別加上Kpnl和Xbal兩個酶切位點。
[0025] 合成后的質粒用限制性內切酶Kpnl和Xbal (Fermentas)進行酶切；同時，用限制 性內切酶Kpnl和Xbal對載體pTG進行酶切；凝膠回收目的基因片段和載體；并用T4DNA連 接酶將上述兩片段連接，轉化Trans5 a大腸桿菌，用氨芐青霉素進行篩選。為確保準確，對 若干克隆進行測序（Invitrogen)。
[0026] 使用質粒中量制備試劑盒（Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質 粒，纖維素酶重組表達質粒命名為pTG_McE5。
[0027] 實施例2 :纖維素酶突變體木霉重組菌株的構建及驗證
[0028] (1)原生質體制備
[0029] 取纖維素酶基因缺陷型的宿主菌里氏木霉SCHD4孢子懸液，接種于PDA平板上， 30°〇培養6天；待其產孢豐富后，切取約1〇1^1〇11的菌落置于含1201^￥￡6+以0.5%酵母 粉、1%葡萄糖、0. 1%尿苷）的液體培養基中，30°C，220rpm振蕩培養14?16h;
[0030] 用無菌紗布過濾收集菌絲體，并用無菌水清洗一次；將菌絲體置于含有20mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用l-2h;用顯微鏡觀察檢測 原生質體轉化進展；
[0031] 將預冷的20mL 1. 2M山梨醇（1. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，輕輕搖勻，用無菌Miracloth濾布過濾收集濾液，3000rpm，4°C離心10min ;棄上 清，加入預冷的5mL 1. 2M山梨醇溶液懸浮菌體，3000rpm，4°C離心10min ;棄上清，加入適量 預冷的1. 2M山梨醇懸浮分裝（200 ii L/管，原生質體濃度為108個/mL)。
[0032] (2)表達載體轉化與菌株驗證
[0033] 以下操作均在冰上進行，取10 U g重組質粒加入到含有200 ii L原生質體溶液的 無菌 7mL 離心管中，然后加入 50iiL 25%PEG(25%PEG，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)，輕彈 管底混勻，冰上放置20min ;加入2mL 25% PEG，混勻后室溫放置5min ;加入4mL 1. 2M山 梨醇，輕輕混勻后倒入熔化并保持在55°C的上層培養基中（0. 1 % MgS04, 1 % KH2P04, 0. 6% (NH4)2S04, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，0. 35%瓊脂糖）；輕輕混勻后鋪在制備好的下層培養 基平板上（2%葡萄糖，0.5%(順4)2504，1.5%腿 2卩04,0.06%]\%504,0.06%〇3(：12，1.5%瓊 脂），30°C培養5?7d至有轉化子長出。
[0034] 挑取轉化子至下層培養基平板，30°C培養2d;取適量菌絲體置于2mL離心管中，力口 入 100mg無菌石英砂和 400ii L抽提緩沖液（100mM Tris-HCl, 100mM EDTA, 250mM NaCl, 1% SDS);用珠打儀劇烈振蕩2min ;65°C水浴20min后，加入200 ii L 10M NH4AC，冰浴lOmin ; 13000rpm離心lOmin ;取上清，加入2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ;13000rpm離心 10min，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加水溶解，于-20°C保存。
[0035] 以上述提取轉化子基因組DNA為模板，利用引物McE-F和McE-R進行PCR擴增目 的基因進行驗證。
[0036] McE-F：GCCAGCTGCTCCTCCGTCTA
[0037] McE-R ：CTACAGGCACTGATGATACCAG ；
[0038] PCR 擴增條件為 94°C 4min ;94°C 40s ;58°C 40s，72°C lmin，30 個循環；72°C 7min， 16°C;利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物并進行測序分析，構建得到了含纖維素酶突變 體基因的里氏木霉工程菌，將其命名為里氏木霉McE5(Trichoderma reesei McE5)。
[0039] 采用上述同樣的方法構建得到重組表達野生型纖維素酶的里氏木霉工程菌，命名 為里氏木霉McE(TrichodermareeseiMcE)。
[0040] 實施例3發酵驗證和酶活檢測
[0041] 將上述里氏木霉工程菌McE與里氏木霉工程菌McE5接種于PDA平板，30°C培養 6d，待孢子豐富后，取兩塊直徑lcm的菌絲塊接種于含有50mL發酵培養基的250mL三角 瓶中（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米漿，0.44%(順4)2504,0 . 09%]\%504,2%腿2?04， 0.04%0&(：1 2,0.018%吐溫-80,0.018%微量元素），301：培養48小時，然后251：培養48小 時，將發酵液離心，取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖1所示，泳道1，2所述里氏 木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5發酵上清液在48KDa處均有一明顯蛋白條帶，與本 發明重組表達的纖維素酶的理論分子量大小一致，而泳道3所述宿主菌里氏木霉SCHD4發 酵上清液在48KDa處無明顯蛋白條帶，從而說明本發明構建得到的里氏木霉工程菌McE能 有效重組表達野生型纖維素酶，里氏木霉工程菌McE5能有效重組表達纖維素酶突變體。 [0042] (1)酶活測定方法
[0043] 在50°C、pH值為4. 8(中性為pH6. 0)的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的輕甲基 纖維素鈉溶液中降解釋放1 U mol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U，還原糖以葡萄 糖等量。
[0044] 取三支試管各加入0. 5mL CMC底物，與待測酶液一起50°C水浴預熱5min。在第 一、二試管中各加入0. 5mL待測液，并計時，50°C水浴中反應15min。反應完后在三支試管 中各加入1. 5mLDNS試劑，并在第三支試管總補加0. 5mL的待測酶液。取出并搖勻三支試管 后，在沸水浴中反應5min。迅速冷卻至室溫，用水定到5. OmL。以第三支試管試液為對照在 540nm波長條件下測第一、二試管試液的吸光度，吸光度在0. 25-0. 35之間為宜。待測酶液 反應液的吸光度與水平控制酶液反應液吸光度之差的絕對值不超過0. 015。
[0045] 酶活X =(葡萄糖等量值/180/15/0. 5) X n
[0046] 其中：X-酶活力單位，IU/g(mL);
[0047] 180--葡萄糖從微克換算成微摩爾；
[0048] 15--待測液與底物的反應時間；
[0049] 0. 5-加入反應的待測酶液量；
[0050] n--稀釋倍數；
[0051] (2)酶活測定結果
[0052] 采用上述方法檢測上述發酵上清液的酶活，結果顯示：宿主菌里氏木霉SCHD4發 酵上清液中幾乎檢測不出纖維素酶酶活，重組表達野生型纖維素酶的里氏木霉工程菌McE 發酵上清液酶活為115U/mL，而重組表達纖維素酶突變體的里氏木霉工程菌McE5發酵上清 液酶活為140U/mL。酶活檢測結果進一步證實，本發明所選用的宿主菌本身不產纖維素酶， 而本發明構建的里氏木霉工程菌McE能高效表達野生型纖維素酶，里氏木霉工程菌McE5能 高效表達纖維素酶突變體。
[0053] 實施例4酶學性質分析
[0054] 1、最適作用溫度
[0055] 分別在 2(TC、3(TC、35t：、4(rC、45t：、5(rC、55t：、6(rC、65t：、7(rC、8(rC，pH6. 0 條 件下測定里氏木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的發酵上清液酶活，以最高酶活為 100 %，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結果如圖2所示，本發明所述纖維素酶突變 體的最適作用溫度為65°C ;在70°C條件下能保持96%的纖維素酶酶活，在80°C條件下，仍 能保持48%以上的纖維素酶酶活；而野生型纖維素酶的最適作用溫度為60°C，在70°C時僅 能保持51 %的酶活，在80°C條件下，僅剩11 %的纖維素酶酶活。與野生型相比，本發明所述 纖維素酶突變體具有更高的耐熱性。
[0056] 2、最適作用pH值
[0057] 分別用 pH 值為 3. 0、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0 的緩沖液稀釋里氏 木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的發酵上清液，在50°C條件下測定其酶活，以最高 酶活為1〇〇%，計算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。結果如圖3所示，纖維素酶突變體的 最適作用pH為5. 5,在pH4. 5-8. 0范圍內，均能保持60%以上的酶活水平，且在pH6. 0-8. 0 范圍內，酶活水平保持穩定；而野生型纖維素酶的最適作用pH為6. 0,僅在pH4. 5-7. 0范圍 內能維持60%以上的酶活，且在pH6. 0-8. 0范圍內，酶活下降明顯，至pH8. 0時，酶活僅剩 30%。與野生型相比，本發明所述纖維素酶突變體在堿性條件下的適用范圍更加寬泛，具有 更大的應用空間。
[0058] 綜上所述，本發明突變后的纖維素酶具有更強的耐熱性，且在堿性條件下的適用 范圍更加寬泛，因此更適合其在紡織工業中的應用，前景廣闊。
【權利要求】
1. 一種纖維素酶，其特征在于，所述纖維素酶氨基酸序列為SEQ ID NO :3。
2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權利要求1所述的纖維素酶。
3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列為SEQ ID NO :4。
4. 一種重組質粒，其特征在于，所述的重組質粒為攜帶有權利要求2所述的基因的質 粒。
5. -種重組菌株，其特征在于，所述的重組菌株為轉化/轉染有權利要求4所述的重組 質粒的菌株。
6. 如權利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述的菌株為里氏木霉。
7. 權利要求1所述的纖維素酶在紡織領域中的應用。
【文檔編號】C12N1/15GK104450653SQ201410783788
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優先權日:2014年12月16日
【發明者】張青, 李賓, 曹體爽, 董計巧, 唐波, 黃亦鈞, 王華明 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司