本發明屬于保健食品的加工生產領域，具體涉及一種大豆內源酶生物轉化與酸解偶聯制備降血脂醋豆的方法。
背景技術：
大豆中含有蛋白質、不飽和脂肪酸、磷脂、異黃酮等多種活性成分，其中異黃酮因其具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗腫瘤等多種生理活性功能而得到社會的廣泛關注，也得到國內外學術界的高度重視與研究。大豆異黃酮分為結合型糖苷和游離型苷元兩種，游離型苷元包括大豆苷元、染料木素、大豆黃素，結合型糖苷包括β-葡萄糖苷（黃豆苷元、大豆黃素、染料木素）、丙二酰基葡萄糖苷（丙二酰基黃豆苷、丙二酰基黃豆黃苷、丙二酰基染料木苷）和乙酰基葡萄糖苷（乙酰基黃豆苷、乙酰基黃豆黃苷、乙酰基染料木苷）。研究結果表明，大豆苷元比大豆糖苷具有更高的生理功能，但苷元含量僅占2%~3%，使得其生理功能受限。
大豆內源性β-葡萄糖苷酶(BG，β-glucosidase，E.C. 3.2.1.21)，屬于配糖物水解家族，能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。作為大豆內源酶，BG廣泛存在于大豆等豆科植物中，在工農業中有著廣泛的應用，其在工業上的一個重要應用是在微生物體內進行生物轉化，目前BG的研究集中在：一是產BG菌株發酵條件研究；二是BG對動植物體內糖苷類物質的生物轉化研究。
為制備降血脂醋豆，主要通過提高大豆苷元含量的方法實現，目前制備大豆苷元的方法主要有化學合成法、酸堿水解法和酶水解法。化學合成法無法除去與大豆苷元相似相溶的物質；酸堿水解法所得產品純度太低，穩定性太差；酶水解法成本太高，無法實現工業化生產。目前所見涉及大豆苷元制備的方法均為單一方法，偶聯或雙相體系制備的相關專利報道較少，中國發明專利申請（公開號101701232A）公開了一種高純度大豆異黃酮苷元的制備方法，該專利所公開的異黃酮苷元制備方法中是通過有機溶劑萃取和雙相體系（微生物酶法提取結合有機溶劑萃取技術）實現。但該法存在以下缺點：一是微生物酶易受雜質污染；二是微生物酶與有機溶劑接觸時間長，容易導致酶失活。本專利涉及一種大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆的方法，利用大豆中豐富的糖苷類物質和內源性BG，具體通過第一步的內源酶生物轉化和第二步的內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆。第一步的內源酶生物轉化克服了微生物酶法易受雜質污染和固定化酶技術帶來的高生產成本等缺點；第二步的內源酶生物轉化和酸解偶聯，由于醋酸屬于弱酸，對BG破壞作用較小，利于BG的催化，使得偶聯作用長時間充分進行。
與此同時，隨著人們飲食結構的調整，高血壓、高血脂人群逐漸趨于年輕化，若不采取有效的調控手段，有發展為心腦血管疾病的趨勢，嚴重的危及生命。目前相關醋豆輔助降血脂保健品的研發還處在起步階段，但已有動物試驗證明相關產品安全有效，具有明顯的降血脂作用。
技術實現要素：
本發明提供一種大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆的方法。本發明制備得到的醋豆口感好，其中丙二酰基異黃酮糖苷轉化率最高，為80~90%；異黃酮苷元增加倍數為40~50倍；還原糖增加倍數為5~10倍。大豆內源酶中的BG活性與異黃酮苷元含量呈現一定的正相關，相關系數為0.8000~0.8500、與還原糖含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7500~0.8000。而且動物實驗結果表明，其具備顯著的抗氧化和輔助降血脂功能。
本發明通過緩沖液浸泡大豆預處理，大豆自身的吸水作用可激活大豆內源酶的活性并提供內源酶進行生化反應的特殊微環境，從而提升其生物轉化效率，同時節省外加酶而大大降低成本；通過大豆內源酶生物轉化與發酵食醋酸解協同作用將大豆中的異黃酮糖苷類物質水解成生物活性更高的異黃酮苷元、多糖類物質水解成還原糖、寡糖等活性糖類。
為了實現本發明目的，采用如下技術方案：
一種大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆的方法，其步驟如下：
1) 首先，選用優質東北大豆，采用提前預熱的緩沖液進行低速恒溫振蕩浸泡，激活大豆內源糖苷酶并進行生物轉化；
2) 其次，將經緩沖液浸泡后的大豆撈出，置于烘箱中烘干處理，控制溫度為25~45 ℃，時間為30~60 min，撈出大豆后剩余的緩沖液用于下一批大豆的初次浸泡，循環利用；
3) 然后，將步驟2）經內源酶生物轉化后的大豆，用已預熱至25~45 ℃的、陳釀期為3年以上的發酵食醋浸泡進行酸解，通過大豆內源酶生物轉化與酸解偶聯制備具有降血脂作用的醋豆；
4) 最后，將步驟3）中得到的大豆進行低溫冷凍干燥，真空包裝，得到成品；
步驟1）中的緩沖液浸泡，具體通過吸水作用可激活大豆內源酶的活性，使其進行生物轉化，提升其生物轉化效率并降低成本；所述緩沖液為檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液，優選檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液，尤其優選檸檬酸鹽緩沖液，相應pH為4~6，優選5~6，尤其優選5；所述大豆內源糖苷酶為α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶；所述恒溫振蕩器轉速為100~500 r/min，優選300~500 r/min，尤其優選500 r/min，恒溫振蕩器溫度為25-50℃；所述浸泡時間為12~24 h，優選18~24 h，尤其優選24 h；
步驟3）中所述食醋為山西老陳醋、鎮江香醋、福建紅曲醋或天津獨流老醋，優選山西老陳醋和福建紅曲醋，尤其優選福建紅曲醋；食醋總酸含量為6~12 g/100mL；所述大豆內源糖苷酶為α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶；所述偶聯表現為通過大豆內源酶生物轉化和食醋酸解協同作用將大豆中的異黃酮糖苷類物質水解成生物活性更高的異黃酮苷元、多糖類物質水解成還原糖、寡糖等活性組分。所述浸泡時間為20~30 d。
一種如上所述大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備的降血脂醋豆，其特征在于：多種異黃酮糖苷發生了轉化，其中丙二酰基異黃酮糖苷轉化率最高，為80~90%；異黃酮苷元增加倍數為40~50倍；還原糖增加倍數為5~10倍，β-葡萄糖苷酶活性為1~10 U/g。大豆內源酶中的β-葡萄糖苷酶活性與異黃酮苷元含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7500~0.8000、與還原糖含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7000~0.7500。
所述醋豆，經動物功能試驗證明，在高劑量的處理情況下，與對照組進行比較，該產品能夠至少降低血清總膽固醇含量和甘油三脂水平分別為19.3%和19.0%，高密度脂蛋白水平至少升高23.7%，具有顯著降血脂的功能。
本發明的優點及有益效果：
1）本發明采用大豆內源酶生物轉化的方法，減輕了酶的污染，降低了固定化酶技術帶來的高生產成本，提升了BG活性。
2）本發明采用大豆內源酶生物轉化與酸解偶聯的方法，避免強酸導致BG失活，使其能最大限度地發揮偶聯作用。
3）本發明制備得到的醋豆，異黃酮苷元增加倍數為40~50倍；還原糖增加倍數為5~10倍。此外，與對照組進行比較，能夠至少降低血清總膽固醇含量和甘油三脂水平分別為19.3%和19.0%，高密度脂蛋白水平至少升高23.7%，具有顯著的降血脂功能。
具體實施例
下面用具體實施例，并參照數據進一步詳細地描述并說明本發明的方法，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。
實施例1
一種大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆方法，包括以下步驟：
1）選用優質東北大豆，采用提前預熱的緩沖液進行低速恒溫振蕩浸泡，激活大豆內源糖苷酶并進行生物轉化；
2）將經緩沖液浸泡后的大豆撈出，置于烘箱中低溫烘干處理，控制溫度為45 ℃，時間為30 min，撈出大豆后剩余的緩沖液用于下一批大豆的初次浸泡，循環利用；
3）選擇經內源酶生物轉化后的大豆，用已預熱至45 ℃的、陳釀期為5年的發酵食醋進行酸解，通過大豆內源酶生物轉化與酸解偶聯制備具有降血脂作用的醋豆；
4）將步驟3）中得到的大豆進行低溫冷凍干燥，真空包裝，得到成品；
步驟1）中所述緩沖液為檸檬酸鹽緩沖液， pH為5；步驟1）和3）中所述大豆內源糖苷酶為α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶。
步驟1）中所述恒溫振蕩器轉速為500 r/min，溫度為40℃（請補充）。
步驟1）中浸泡時間為24 h；步驟3）中浸泡時間為30 d。
步驟3）中所述食醋為福建紅曲醋，其總酸含量為10 g/100mL。
對所得成品進行成分檢測，結果為：
經處理的大豆中多種異黃酮糖苷發生了生物轉化，其中丙二酰基異黃酮糖苷轉化率最高，為90%；異黃酮苷元增加倍數為50倍；還原糖增加倍數為10倍。大豆內源酶中的BG活性與異黃酮苷元含量呈現一定的正相關，相關系數為0.8000、與還原糖含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7500。
動物實驗：
1.實驗材料與方法
實驗用Wistar大鼠，雄性，健康清潔級，體重150~200 g，共48只，均由福建醫科大學實驗動物中心提供。檢測環境條件，溫度范圍20~25 ℃，相對濕度范圍50~70%，大鼠在試驗前在動物房適應一周。
經本實施例1處理后的醋豆樣品經粉碎后進行喂養，動物供試樣品為不同濃度的產品稀釋液，實驗時用生理鹽水將樣品配制成各劑量。
儀器及試劑：膽固醇、膽鹽、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)測定試劑盒。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。
高脂飼料配方：78.8％基礎飼料、1％膽固醇、10％蛋黃粉、10％豬油、0.2％膽鹽。
劑量分組及受試樣品給予時間：實驗設三個劑量組和一個高脂對照組，以人體推薦量的5、10、20倍分別為三個劑量組。預防性給受試樣品時間和治療性給受試樣品時間均為30 d。
采用脂代謝紊亂模型法-治療性給受試動物
實驗步驟：大鼠在清潔級動物實驗室內喂飼基礎飼料觀察7天，取血前一天晚間禁食16h，不禁水，次日上午，大鼠眼內眥取血測定血清TC，TG，HDL-C水平，觀察指標正常值。取高脂飼料喂Wistar雄性大鼠兩周，測定血清TC，TG，HDL-C水平，與喂飼高脂飼料前比以確定是否已形成高脂血癥模型。然后根據血清TC水平和體重隨機分為4組，每組12只。四個組實驗前Wistar雄性大鼠體重和血清水平無顯著性差異。設1.35、2.7、5.4g/kg?bw（分別相當于推薦量的5、10、20倍）3個劑量組，一個高脂模型對照組（高脂組）。正式開始實驗后，各組均繼續用高脂飼料喂飼。各實驗組大鼠經口灌胃給予受試溶液，對照組灌胃給予生理鹽水，灌胃量為1.0ml/100g?bw。每天一次，連續21天，每周稱重一次，并依此調整灌胃量。實驗至第14、21天時分別采血測定血清TC、TG、HDL-C含量，采血前各組大鼠禁食16h。血清TC、TG和HDL-C含量的測定均用試劑盒。
實驗數據統計：采用spss19.0和sigmaplot11.0軟件進行數據匯總與分析。
2實驗結果
2.1 降血脂醋豆對大鼠體重的影響
表1 治療模型中四組大鼠實驗前后的體重值(n =12, g, x±s)
由表1可見，大鼠給受試物前（0 d），各組體重沒有顯著差異。給受試物一定時期(7 d、14 d、21 d)后，與高脂對照組相比，其余各組體重均未出現顯著差異(p ＞0.05)。表明該降血脂醋豆對大鼠生長發育沒有不良影響。
2.2 降血脂醋豆對大鼠血清總膽固醇(TC)含量的影響
表2 降血脂醋豆對大鼠血清總膽固醇(TC)含量的影響（ｘ±ｓ,mmol/L,ｎ=12）
注:與模型對照組比較差異的顯著性為 * p<0.05和 ** p<0.01
由表2可見，大鼠給予受試物前(0 d)，各實驗組血清總膽固醇(TC)含量與高脂對照組比較無顯著性差異(p ＞0.05)。給受試物一定時期(7 d、14 d、21 d)后，各時期高脂對照組與給受試物之前比較，血清TC升高，差異有極顯著性(p ＜ 0.01)，表明高TC模型建立成功。與高脂對照組比較，其余各劑量組均顯著降低(p ＜0.05)，實驗至第21 d時，低劑量組下降9.47%。中劑量組下降14.40%，高劑量組下降19.34%。表明該降血脂醋豆具有降低血清總膽固醇(TC)含量的作用。
2.3 降血脂醋豆對大鼠血清甘油三酯(TG)含量的影響
表3 降血脂醋豆對大鼠血清甘油三酯(TG)含量的影響（ｘ±ｓ,mmol/L,ｎ=12）
注:與高脂模型組比較差異的顯著性為 * p<0.05
由表3可見，大鼠給予受試物前(0 d)，各實驗組血清甘油三脂(TG)含量與高脂對照組比較無顯著性差異(p ＞0.05)。給受試物一定時期(14 d、21 d)后，各時期高脂對照組與給受試物之前比較，血清TG升高，差異有極顯著性(p ＜0.01)，表明高TG模型建立成功。與高脂對照組比較，其余各劑量組均顯著降低(p ＜0.05)，實驗至第21 d時，低劑量組下降8.50%，中劑量組下降14.38%，高劑量組下降19.00%。表明該降血脂醋豆具有降低血清甘油三脂(TG)含量的作用。
2.4 輔助降血脂醋豆對大鼠高密度脂蛋白(HDL-C)含量的影響
表4 輔助降血脂醋豆對大鼠高密度脂蛋白(HDL-C)含量的影響（ｘ±ｓ,mmol/L,ｎ=12）
注:與高脂模型比較差異的顯著性為 * p<0.05
由表4可見，給予受試物前(0 d)，各實驗組高密度脂蛋白(HDL)含量與高脂對照組比較無顯著性差異(p ＞0.05)。給受試物一定時期(14 d、21 d)后，各時期高脂對照組與給受試物之前比較，高密度脂蛋白(HDL)含量升高，差異有極顯著性(p ＜0.01)，表明高HDL-C模型建立成功。與高脂對照組比較，其余各劑量組均顯著降低(p ＜0.05)，實驗至第21 d時，低劑量組升高11.86%，中劑量組升高18.64%，高劑量組升高23.72%。說明表明該降血脂醋豆具有增加高密度脂蛋白(HDL)含量的作用。
根據《保健食品功能學評價程序與檢驗方法》對輔助降血脂保健食品的判定標準（動物實驗結果判定）對輔助降血脂功能結果判定：在血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇三項指標檢測中血清總膽固醇和甘油三酯二項指標陽性，可判定該受試樣品輔助降血脂功能動物實驗結果陽性。
3. 結論
綜上所述，采用制備實施例1所制得的降血脂醋豆具有降低血脂的作用。
實施例2
一種大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆的方法，主要包括以下步驟：
1）選用優質東北大豆，采用提前預熱的緩沖液進行低速恒溫振蕩浸泡，激活大豆內源糖苷酶并進行生物轉化；
2）將經緩沖液浸泡后的大豆撈出，置于烘箱中低溫烘干處理，控制溫度為35 ℃，時間為60 min，撈出大豆后剩余的緩沖液用于下一批大豆的初次浸泡，循環利用；
3）選擇經內源酶生物轉化后的大豆，用已預熱至35 ℃的、陳釀期為3年的發酵食醋進行酸解，通過大豆內源酶生物轉化與酸解偶聯制備具有降血脂作用的醋豆；
4）將步驟3）中得到的大豆進行低溫冷凍干燥，真空包裝，得到成品；
步驟1）中所述緩沖液為醋酸鹽緩沖液，相應pH為4；步驟1）和3）中所述大豆內源糖苷酶為α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶。
步驟1）中所述恒溫振蕩器轉速為100 r/min，溫度為30℃（請補充）。
步驟1）中浸泡時間為12 h；步驟3）中浸泡時間為20 d。
步驟3）中所述食醋為山西老陳醋，其總酸含量為6 g/100mL。
對所得成品進行成分檢測，結果為：
多種異黃酮糖苷發生了轉化，其中丙二酰基異黃酮糖苷轉化率最高，為80%；異黃酮苷元增加倍數為40倍；還原糖增加倍數為6倍。大豆內源酶中的BG活性與異黃酮苷元含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7800、與還原糖含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7200。
實施例3
一種大豆內源酶生物轉化和酸解偶聯制備降血脂醋豆的方法，主要包括以下步驟：
1）選用優質東北大豆，采用提前預熱的緩沖液進行低速恒溫振蕩浸泡，激活大豆內源糖苷酶并進行生物轉化；
2）將經緩沖液浸泡后的大豆撈出，置于烘箱中低溫烘干處理，控制溫度為37℃，時間為60 min。撈出大豆后剩余的緩沖液用于下一批大豆的初次浸泡，循環利用；
3）選擇經內源酶生物轉化后的大豆，用已預熱至40℃的、陳釀期為3年的發酵食醋進行酸解，通過大豆內源酶生物轉化與酸解偶聯制備具有降血脂作用的醋豆；
4）將步驟3）中得到的大豆進行低溫冷凍干燥，真空包裝，得到成品；
步驟1）中所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，相應pH為6；步驟1）和3）中所述大豆內源糖苷酶為α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶。
步驟1）中所述恒溫振蕩器轉速為300 r/min，溫度為45℃（請補充）。
步驟1）中浸泡時間為18 h；步驟3）中浸泡時間為25d。
步驟3）中所述食醋為鎮江香醋，其總酸含量為12 g/100mL。
對所得成品進行成分檢測，結果為：
多種異黃酮糖苷發生了轉化，其中丙二酰基異黃酮糖苷轉化率最高，為80%；異黃酮苷元增加倍數為60倍；還原糖增加倍數為9倍。大豆內源酶中的BG活性與異黃酮苷元含量呈現一定的正相關，相關系數為0.8000、與還原糖含量呈現一定的正相關，相關系數為0.7000。
動物實驗方法參照實施例1，喂養時間延長至12周，實驗結果表明：高劑量組血清總膽固醇（TC）水平至少降低23.9%，甘油三酯（TG）水平至少降低25.1%，同時高密度脂蛋白（HDL）水平至少升高15.6%，具有顯著的抗氧化和輔助降血脂功能。
上述僅為本發明的較佳實施例，但本發明的設計與構思并不局限于此。凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆屬于侵犯本發明范疇的行為。