本發明屬于果蔬采后保鮮生物防治技術領域，尤其是一種果蔬高生防拮抗菌素防霉保鮮劑及其制備方法。
背景技術：
現有技術中有諸多的灰霉菌(Botrytis cinerea)染病實例，而且灰霉菌在諸多水果中都能繁殖和生長，產生病害。現有技術中通常是用化學藥劑來抑制灰霉菌的生長，起主要確定體系在一下幾個方面：
1、抗藥性危害：長期使用化學藥劑導致病菌產生的抗藥性，降低了其防病效果，同時殘毒量增加而威脅著人類的健康。
2、殘留性危害：隨著人們食品安全意識的加強，國內外對水果的農藥殘留要求也越來越嚴格，不使用化肥農藥的綠色水果成為市場熱門。
3、環境危害：頻繁反復的是用化學防霉劑對環境造成不可逆的傷害，容易造成環境中的灰霉菌變異等生物災害，同時也會競爭抑制環境中的其他有益菌的生長。
我國鮮食葡萄保鮮防腐技術越來越需要更加安全、環保的新技術，熏硫等化學劑防腐技術的被淘汰成為大勢所趨，及時開展新型綠色防腐保鮮劑的研究具有十分重大的意義。
技術實現要素：
本發明是為了克服現有技術的不足之處，提供一種防霉效果好，復性效率高的果蔬高生防拮抗菌素防霉保鮮劑及其制備方法。
本發明實現目的的技術方案如下：
一種果蔬高生防拮抗菌素防霉保鮮劑的制備方法，具體成分如下：
(1)由蘇云金芽孢桿菌CICC 23702產生幾丁質酶：
采用磁化水代替蒸餾水制備培養基，培養基中加0.8～1.0％的Mg2+、0.3％～0.5％的Mn2+以及0.2～0.3wt％的幾丁質配成高產幾丁質酶的誘導培養液；在紅光條件下，加入30～40mL的增殖誘導培養基培養4d，復合誘導蘇云金芽孢桿菌高產幾丁質酶，培養液采用超聲頻率為15KHz-20KHz的超聲波進行細胞破碎并純化以敲除幾丁質酶雜基，然后5000r/min低溫離心20min后收集上清液，調節pH5.5～5.8至該幾丁質酶等電點，沉淀提取分離；
(2)由從葡萄中分離的灰霉誘導產生角質酶、纖維素酶
誘導條件：將108spore/mL灰霉菌孢子加5mL霉菌增殖培養基中，其中培養基中加入0.8％～1.2％的角質酶和2.0％～2.5％的纖維素酶以誘導霉菌高產角質酶和纖維素酶，28℃培養4d后，5000r/min冷凍低溫離心10min～20min，以除去菌體和培養基殘渣，取上清液調節上清液pH6.2-6.9至兩酶等電點，沉淀提取生物活性物質角質酶和纖維素酶；
(3)防霉保鮮劑配方：重量份數
100份無菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、環氧大豆油3～4份和殼聚糖0.2～0.4份，并500～600r/min攪拌1-1.5小時，使其完全溶解，5～10份的幾丁質酶、5～8份的角質酶、8～10份的纖維素酶，500～600r/min攪拌20～30分鐘混勻，所制備拮抗菌素防霉劑置于0℃～4℃條件下保存；
(4)保鮮劑使用前首先進行抗菌酶復性
復性加入復性劑，復性劑為：將0.5～0.6份Mg2+、0.3～0.5份的Mn2+，并用10份的0.1mol/L磷酸緩沖液，混勻，調節pH 7.2～7.9。
而且，所述步驟⑴的誘導培養液成分為：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl5.0g，蒸餾水1L，pH7.0，121℃滅菌20min備用；
而且，所述霉菌增殖培養基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。
而且，100重量份數復性劑可以復性1-10重量份保鮮劑。
本發明的優點和積極效果如下：
本發明采用高產幾丁質酶的菌種以及高效生產培養基來生產幾丁質酶，能夠大幅提高產率。
本發明的保鮮劑生產后形成干燥的粉末，非常容易保藏，常溫保存即可，不需要特殊條件，使用時直接噴灑至葡萄表面，延長果蔬尤其是葡萄的保存期限。
本發明通過在培養基中增加誘導離子，同時輔以紅光誘導，能夠使幾丁質的產量增加20％左右。經過高頻超聲的震蕩，不僅能劈碎細胞，還能將幾丁質上的雜基團震蕩下去，提高幾丁質酶的活性，保證生物保鮮劑的有效性。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
本發明以下沒有提及的均為重量百分比，如果涉及液體為體積百分比。
一種果蔬高生防拮抗菌素防霉保鮮劑及其制備方法，具體成分如下：本保鮮劑主要作用成分為幾丁質酶、角質酶、細胞壁降解酶，具體制備過程如下
⑴幾丁質酶由產幾丁質酶的蘇云金芽孢桿菌(CICC 23702)產生的，其為高生防拮抗菌素的主要成分。
該菌株采用磁化水代替蒸餾水制備培養基(培養基成分：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0)，培養基中加0.8～1.0％的Mg2+、0.3％～0.5％的Mn2+以及0.2％～0.3％的幾丁質配成高產幾丁質酶的誘導培養液；紅光條件下加入30～40mL的增殖誘導培養基培養4d，復合誘導蘇云金芽孢桿菌高產幾丁質酶，培養液采用超聲頻率為15KHz-20KHz的超聲波細胞破碎后5000r/min低溫離心20min后收集上清液，調節pH5.5～5.8至該幾丁質酶等電點，沉淀提取分離。
其中，菌種蘇云金芽孢桿菌(CICC 23702)于2016年5月30日購買于中國食品發酵工業研究院，發票號：17576933。
誘導培養液：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1L，pH7.0，121℃滅菌20min備用。
⑵角質酶、纖維素酶由從葡萄中分離的灰霉誘導產生
誘導條件：將108spore/mL灰霉菌孢子加5mL霉菌增殖培養基中，其中培養基中加入0.8％～1.2％的角質酶和2.0％～2.5％的纖維素酶以誘導灰霉菌高產角質酶和纖維素酶，28℃培養4d后，5000r/min冷凍低溫離心10min～20min，以除去菌體和培養基殘渣，取上清液調節上清液pH6.2-6.9至兩酶等電點，沉淀提取生物活性物質角質酶和纖維素酶。
本步驟中使用的灰霉菌(孢子)又叫做灰葡萄孢霉，分離于葡萄。英文：Botrytis cinerea公開文獻：Botrytis：Biology Pathology and Control,Edited by Y.Elad,B.Williamson,P.Tudzynski and N.Delen。
霉菌增殖培養基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。
⑶防霉保鮮劑配方：重量份數
100份無菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、環氧大豆油3～4份和殼聚糖0.2～0.4份，并500～600r/min攪拌1-1.5小時，使其完全溶解，5～10份的幾丁質酶、5～8份的角質酶、8～10份的纖維素酶，500～600r/min攪拌20～30分鐘混勻，所制備拮抗菌素防霉劑置于0℃～4℃條件下保存；
⑷保鮮劑使用前首先進行抗菌酶復性
復性劑為：將0.5～0.6份Mg2+、0.3～0.5份的Mn2+，并用10份的0.1mol/L磷酸緩沖液，充分混勻，調節pH 7.2～7.9，以提升酶活性；使用時活化保鮮劑后噴施于果蔬表面，自然晾干后于適宜溫度、濕度和氣體條件下貯藏。
100重量份數復性劑可以復性1-10重量份保鮮劑，可以根據需要自己選擇。
相關實驗數據說明：
本申請防霉保鮮劑噴灑于葡萄表面，能夠有效防止葡萄表面霉菌的生長。復性后100份水中加入5份保鮮劑重量份，噴灑與葡萄表面，放置60-70天不生長霉菌。