一種水產畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生態制劑的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵技術領域，特別涉及一種水產畜禽用功能性氨基酸腐植酸 微生態制劑的生產方法。
【背景技術】
[0002] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)是能夠產生芽孢的好氧微生物。在分類學上 屬原核生物，單個細胞（0. 3~0. 5X1. 5~3. 0 μ m)、成對或鏈狀排列，革蘭氏陽性，無莢 膜，周生鞭毛，能運動。芽孢大（〇. 2~0. 4 X I. 0~1. 5 μ m)，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍 偏。芽孢形成后菌體不膨大，菌落表面粗糙，污白色或微黃色，在液體培養時，常形成皺醭。 主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中。枯草芽孢桿菌繁殖速度快、容易培養，能 分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、多種氨基酸、多種維生素、抗菌肽和生物促長因子，具有生物 好氧、調整菌群、抑制病菌、生物拮抗等功能，所以在提高動物機體免疫力、增強消化系統酶 活性、防病治病和促進生長中起著重要作用。其芽孢抗逆性強、耐高溫、耐酸堿、耐擠壓，產 品適用范圍廣泛，并且它能作為模式菌株在生物芯片上進行有效的DNA擴增和蛋白質、氨 基酸分離。國內外許多學者研究表明，枯草芽孢桿菌在醫藥保健、水產養殖、禽畜養殖和生 態環保等方面有較高的研究價值和應用價值。
[0003] 地衣芽孢桿菌的結構和功能同枯草芽孢桿相近，主要是能產生肽類抗生素和蛋白 酶，在篩選和應用時，有目標的選擇有抑菌活性和能夠產生蛋白酶的菌株，對動物的腸道的 炎癥有保健和治療作用和提高飼料利用率作用。
[0004] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，也是面包酵母或叫出芽酵母，是與人類 關系最廣泛的一種酵母。傳統上用于制作面包及釀酒，現代分子生物學和細胞生物學中用 作真核生物的模式生物菌。釀酒酵母的細胞形態為球形或者卵圓形，單生或對生，細胞大 小為2. 5~10μπιΧ4. 5~21μπι。繁殖的方式為出芽生殖，菌落為奶油狀，乳白色，表面有 光澤，邊緣圓鋸齒狀，不透明。其碳源氮源利用廣泛，能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、 果糖、棉籽糖、甘露醇、乙醇和甘油；釀酒酵母可以大量的合成酵母蛋白，可以代謝出各種酶 系，降解纖維素和蛋白質，有利于腸道健康和益生保健作用。
[0005] 嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidopophilus)屬于乳桿菌屬，細胞大小為 0. 8 μ mX 4. 9~11. 7 μ m。單個、成對或鏈狀排列，革蘭氏陽性菌，無芽孢，末端呈圓形，能利 用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、棉籽糖、甘露醇；主要存在小腸中。具有酸甜芳 香味，能分泌乳酸、乙酸，可以使PH值下降，能夠產生肽類抗菌素，抑制腸道不良微生物的 增殖，對致病微生物有拮抗作用。還可以改善適口性，提高飼料轉化率，降低抗生素和酸化 劑的使用量，促進生長，提高品質，降低成本。特別是對胃腸功能失調和服用抗菌素而引起 胃腸功能失調等癥狀有特效，可以迅速使腸道內的菌群恢復正常平衡，抑制腐敗菌的增殖， 具有很好的營養保健作用。近年來，嗜酸乳桿菌的應用很廣泛。
[0006] 精氨酸是氨基酸家族中的一種，同其他氨基酸一樣，精氨酸具有維持生命體的生 長發育、新陳代謝和生命體活動的正常運轉功能。精氨酸屬于條件性必需氨基酸。近年來 人們對精氨酸的研究日臻完善。主要研究結果是，精氨酸具有維持動物體氨基酸種類的氮 元素平衡，增強免疫功能，促進膠原蛋白合成，促進生殖系統生長，促進傷口愈合，提高生長 發育速度等功能。近年來，精氨酸在水產畜禽養殖上應用也日趨廣泛。
[0007] 腐植酸是有機大分子的聚合物，分子中含有苯環、吲哚酸、羥基、酚羥基、甲氧基等 功能基團。在水產畜牧養殖中的應用主要是利用這些活性的功能基團，吸附水域環境中的 有毒有害物質，凈化水體，凈化養殖環境。腐植酸作為營養物質，含有的蛋白質、氨基酸、有 機鈣、微量元素、抗病因子等生物活性物質，有利于營養物質的轉化吸收和新陳代謝，可以 減少腸胃道疾病的發生，近年來，水產畜牧養殖中已廣泛應用。
[0008] 在以往研究中，科技工作者對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿 菌的分類學地位、生理生化特征、發酵條件及其調控，對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒 酵母和嗜酸乳桿菌的應用，對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母菌和嗜酸乳桿菌四者 之間的交互作用的研究和應用報道等均很多。但是對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵 母、嗜酸乳桿菌和氨基酸、腐植酸三大類，作為一個共同體來研究的不多。近年的研究中， 科技工作者以精氨酸濃菌液濕粉為發酵主要原料，以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵 母、嗜酸乳桿菌為有益微生物菌群進行發酵，其主要目的是，精氨酸濃菌液濕粉中含有豐富 的蛋白質、18種氨基酸和小肽等營養物質，但里面有2%的非蛋白氮，所以，利用微生物發 酵方法，利用精氨酸發酵過程中剩余非蛋白氮，將非蛋白氮代謝為蛋白氮，做到發酵氨基酸 過程中的零排放等均有報道。
[0009] 本發明產品功能是：1.提高飼料利用率，讓動物吃發酵制品；2.用生物制劑處理 養殖動物的腸胃，調整菌群平衡，殺滅有害菌，減少抗生素的使用量；3.使用本產品可以明 顯的改善養殖環境。本發明生產工藝簡單，產品應用效果好，可廣泛應用于水產、畜禽等養 殖行業中。
[0010] 目前，中國科學院沈陽應用生態研究所從海洋中已經分離、純化、鑒定出多株枯草 芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌，經過馴化、培育、提高得到多株產物含量 高、活性好、生長速度快的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌菌種，經過 我們生產應用，其應用效果非常好，已在遼寧的沈陽、大連地區，河北和河南等地區廣泛應 用，取得了很好的經濟效益，我們已將產品實現了商品化生產。
[0011] (地衣芽孢桿菌從中科院北京微生物所購買。枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿 菌和氨基酸生產菌株均從中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏購買。腐植酸從新疆雙龍 腐植酸生物公司購買。）
【發明內容】
[0012] 本發明提供了一種水產畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生態制劑的生產方法，該方 法以精氨酸濃菌液濕粉、腐植酸粉、玉米漿干粉、豆柏、麥麩皮為發酵原料，以枯草芽孢桿 菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母菌、嗜酸乳桿菌為有益微生物菌群。經過堆置固體發酵和通入 空氣有氧固體發酵，得到水產畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生態制劑產品。
[0013] 本產品營養豐富，防病治病效果好，促進養殖動物生長效果明顯。還可以改善養 殖環境，凈化水質，是一種綠色優質的水產畜禽用功能性微生態制劑。
[0014] 為解決上述問題，本發明所采用的技術方案是：以精氨酸濃菌液濕粉、腐植酸粉、 玉米漿干粉、豆柏、麥麩皮為發酵原料，以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母菌、嗜酸 乳桿菌為有益微生物菌群，將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母菌、嗜酸乳桿菌按比 例混合，經過堆置固體發酵和通入空氣有氧固體發酵，得到水產畜禽用功能性氨基酸腐植 酸微生態制劑。具體步驟如下：
[0015] (1)精氨酸濃菌液濕粉的制備：將精氨酸菌種接種到精氨酸發酵培養基中，精氨 酸發酵培養基為：葡萄糖1 %~2 %、玉米漿粉3 %~4 %、硫酸銨1 %~2 %、谷氨酸鈉1 %~ 2% ;接種量為5%~10% ;
[0016] 經過48~64小時發酵得到精氨酸發酵液，向精氨酸發酵液中加入終濃度200~ 250ppm絮凝劑聚丙烯酸鈉，用質量分數35 %~40 %的硫酸調節pH值到5. 5~6. 5后，在溫 度為40°C~50°C下反應，反應時間為60~80分鐘，而后，用3MPa的壓力將反應后的精氨 酸發酵液壓入到壓濾機中，壓濾時間為40~60分鐘，得到質量含水量為35%~40%的精 氨酸濃菌液濕粉；
[0017] (2)發酵原料制備：按所需比例將發酵原料中的精氨酸濃菌液濕粉、腐植酸粉、玉 米漿干粉、豆柏、麥麩皮充分混合；發酵原料的組成為精氨酸濃漿菌液濕粉20~30重量份、 腐植酸粉10~20重量份、玉米漿干粉20~30重量份、豆柏10~20重量份、麥麩皮20~ 30重量份；
[0018] (3)枯草芽孢桿菌種子液、地衣芽孢桿菌種子液、釀酒酵母菌種子液、嗜酸乳桿菌 種子液的重量百分比例：枯草芽孢桿菌種子液30~40份、地衣芽孢桿菌種子液30~40份、 釀酒酵母菌種子液20~30份。
[0019] 發酵原料：種子液的混合液=80~130份重量份：40~60重量份。
[0020] 枯草芽孢桿菌種子液活菌數為100個億/ml、地衣芽孢桿菌種子液活菌數為100個 億/ml、釀酒酵母菌種子液活菌數為30個億/ml、嗜酸乳桿菌種子液活菌數為50個億/ml ; [0021 ] 發酵原料中的各物質的質量含水量：精氨酸濃漿菌液濕粉35%~40%、腐植酸粉 10%~13%、玉米漿干粉10%~13%、豆柏10%~13%、麥麩皮10%~13% ;所述發酵原 料的總質量含水量為17. 65%~22. 55%。
[0022] (4)固體堆置發酵階段和通入空氣有氧固體發酵：
[0023] 按所需比例將枯草芽孢桿菌種子液、地衣芽孢桿菌種子液、釀酒酵母菌種子液、嗜 酸乳桿菌種子液混合，接種到所制備的發酵原料中，進行固體堆置發酵。
[0024] 1)固體堆置發酵：
[0025] A、有氧固體發酵階段：第一天24小時有氧發酵，不翻倒，不通風，溫度從室溫開始 緩慢升高，溫度控制在25 °C~35 °C，質量含水量40 %~45% ;
[0026] B、厭氧固體發酵階段：第二天24小時厭氧發酵：不翻倒，不通風，溫度升高后，維 持平衡溫度，溫度控制在35°C~40°C，質量含水量35 %~40%，發酵料中的微生物開始分 解發酵料中的蛋白質、淀粉、纖維素；
[0027] 2)通入空氣有氧固體發酵：
[0028] 第三天溫度升到最高點45°C~50°C時，開始翻倒，開始通風（空氣），溫度開始下 降，質量含水量25 %~30 %，水活度降低，繼續通風（空氣），芽孢出現率達到80 %時，停止 通風，放置10小時后，開始烘干，經過粉碎、過篩、得到一種水產畜禽用功能性氨基酸腐植 酸微生態制劑。（5)枯草芽孢桿菌種子液的制備：
[0029] 1)單菌落分離：將經活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種，在盛有新配制的葡萄糖牛肉 膏蛋白胨培養基的培養皿上涂布，在恒溫培養箱中30°C、24小時培養，得到枯草芽孢桿菌 單菌落種子；
[0030] 2)固體種子培養：將枯草芽孢桿菌單菌落種子，在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草 芽孢桿菌培養基的200ml茄形扁瓶中接種，在恒溫培養箱中30°C、24小時培養，得到枯草芽 孢桿菌固體種子；
[0031] 3)液體種子培養：將枯草芽孢桿菌固體種子按質量分數為10%~20%的接種量 接種到種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；所述種子罐培養基以重量百分 比計為：葡萄糖0. 5~1. 5 %、玉米漿干粉2. 0~4.