專利名稱：利用白腐菌酶液提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法
技術領域：
本發明屬于卷煙再造煙葉技術領域，具體涉及再造煙葉生產過程中使用白腐菌酶液處理煙梗漿料以提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法。
背景技術：
再造煙葉是利用煙末、煙梗、碎煙片等煙草物質為原料，經過萃取、濃縮、制漿、抄造、干燥工藝制備而得，是一種具有高附加值的煙草資源再生利用產品，將再造煙葉按照一定比例摻配于卷煙產品中可大幅降低單箱生產消耗、改善煙支結構與燃燒狀態、降低卷煙焦油及有害成分的釋放量。目前，國內再造煙葉在產品質量方面與國外產品存在一定差距。在物理性質方面，國內再造煙葉較厚，厚薄不均，均不如進口再造煙葉，尤其在柔軟性方面，與國外差距較大。在再造煙葉內在品質方面，國產再造煙葉存在木質氣比較重，刺激性大，煙氣不協調，紙質 氣明顯，煙氣柔和程度差等缺點。公開號為CN101103839的中國發明專利申請報道了一種造紙法生產重組煙葉的方法，公開號為CN1739409的中國發明專利申請報道了一種用于造紙法生產煙草薄片的煙梗的制漿方法，公開號為CN102240065A的中國發明專利申請報道了一種改善造紙法薄片抄造基片濕強度和柔軟性的方法，公開號為CN102068034A的中國發明專利申請報道了一種造紙法再造煙葉降焦減害的方法，公開號為CN101637298的中國發明專利申請報道了一種煙草薄片的制備方法及其應用。上述介紹的專利都是采用萃取后涂布抄造的造紙法制備再造煙葉，只是萃取工藝與制漿抄造工藝不同。這些制備技術與工藝存在共同的不足之處，就是沒有對萃取后的煙草纖維原料進行處理。整個生產過程基本不涉及煙草原料的任何化學變化。公開號為CN 101427846的中國發明專利申請報道了一種用復合酶提高薄片原料萃取效率和薄片煙氣質量的方法，公開號為CN 102058154A的中國發明專利申請報道了一種酶法降解煙草中木質素的方法，美國專利申請號為US20050527286的Process forreducing nitrogen containing compounds and lignin in tobacco公開了從煙草中減少含有尼古丁的復合物和木質素的過程。以上專利公開的工藝只是涉及煙草萃取液或煙梗原料煙葉表面的生物發酵處理，沒有涉及煙草漿料的處理，應用的局限性較大。木質素是一種高度復雜的、不定形的芳香環聚合物，是木質植物的主要組成成分之一。其結構的基本單元是類苯基丙燒(Phenyl Propanoid),靠多種共價鍵連接形成一種不溶性的、異質的、無光學活性的、不規則的、高度分枝的三維網絡大分子。對于煙草原料，煙梗中木質素本身熱解會產生兒茶酚、烷基兒茶酚等引起澀口，有促癌活性。目前已知的木質素氧化酶系有三種類型1、Lip-Mnp-Lac組，如CoriolusVersicolor> Phlebiavadiate 和 Phanerochaete Chrysosporium,對后者一般認為不含漆酶，但有人認為是因培養基不適宜產漆酶引起；2、Mnp-Lac組，如Lentinulaedodes、Panustigrinus,能修飾木質素增加水溶性，但CO2釋放量不很高；2、Lip-Lac組，如Phlebiaochraceofulva> Junghuhunia Separabalima,該組菌降解木質素非常慢。雖然并非所有白腐菌都具有全部三種主要酶，但漆酶與Lip、Mnp 一起協同作用，完成大量白腐菌特有、高效的生理過程。白腐菌對木質素的降解，依賴一個主要由細胞產生分泌的酶系統組成的細胞外降解體系，需氧并靠自身形成的H2O2激活，由酶觸發啟動一系列自由基鏈反應，實現對底物無特異性的氧化降解，主要包括單電子氧化、酯質氧化、共代謝等過程。這一系列自由基鏈反應導致各種連接鍵斷裂，使木質素解聚成各種低分子量片段，再經進一步氧化降解為C02，實現對多變的木質素底物非特異性和無立體選擇性的氧化降解。故菌與降解對象并非一一對應，而是與一類乃至于多類底物的廣譜關系。白腐菌是一類絲狀真菌，因腐生在樹木或木材上引起木質的白色腐爛而得名。白腐菌菌絲體為多核，少有隔膜，無鎖狀聯合，多核的分生孢子常為異核，擔孢子卻是同核體，存在同宗配合和異宗配合兩類交配系統。白腐菌通過分泌非專一性的木素降解酶系以單電子氧化、共代謝及脂肪過氧化等途徑進行降解活動，它的特點是1)低成本、高效率，它的生長對營養要求不高，可以利用廢棄物中的木質纖維素等廉價的營養源，將其轉化為腐殖質；2)它產生氧化能力極強的羥基自由基，對其他微生物具有很大殺傷力，從而在競爭中 保持一定的優勢；3)降解對象不需進入細胞內代謝，因而它不易受到有害物質的傷害；4)降解底物的非專一性機制，使其能降解煙梗木質素而具有更大的實用性。在分類學上白腐菌屬擔子菌綱，是目前已知的唯一能在純系培養中有效地將木質素降解為CO2和H2O的一類微生物，是自然界中木質素最有效降解者，能分泌出非專一性的木質素降解酶，以氧化還原反應形式對木質纖維素及多環芳烴衍生物進行鏈式反應，從而能夠有效的將這類物質降解，轉化成無毒、無害的物質。
發明內容
針對現有技術的上述不足，本發明要解決的技術問題是提供一種提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法。將白腐菌(Coriolus versicolor T42)酶液處理煙梗漿料應用于再造煙葉的生產，能有效的提高再造煙葉的柔軟度，同時也提高再造煙葉的感官質量。為解決上述技術問題，本發明所設計的一種利用白腐菌酶液提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法，按照現有工藝技術方法完成煙梗原料磨漿階段前后的工序。在再造煙葉生產過程的煙梗原料磨漿階段，按照煙梗原料物質干量的I. (Tio. 0%的比例加入白腐菌T42酶液，在煙梗漿料溫度為3(T80°C，pH值為2. 0^6. 0，處理時間為2(T90min的條件下降解煙梗衆料中木質素，其中所述的白腐菌T42菌株名為Coriolus versicolor T42,保藏號為 CCTCC NO: M 2012252。作為優選方案，所述白腐菌T42酶液制備步驟I) PDA綜合瓊脂培養基的制備按重量百分比進行稱量配合馬鈴薯提取液 I. 0 4. 0%、葡萄糖 20. 0 40. 0%、KH2PO4 I. 0 6. 0%、MgSO4 7H20 I. 0 5. 0%、維生素 B1
0.OOfO. 006%、瓊脂 10. (T30. 0%、酒石酸氨 0. 05^2. 5%,用 I. OmoI/L 的鹽酸調節 pH 至
3.0 6. 5備用;2)產酶培養基按重量百分比進行稱量配合無水CaCl2 0. 05、. 30%、KH2PO4
0.02 0. 10%、無水MgSO4 0. 05 0. 20%、葡萄糖0. I 0. 5%、酒石酸氨0. 10 0. 80%、硝酸氨
0.10^0. 90%、維生素B1 0. 00r0. 008%、微量元素混合液0. 001 0. 005%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節pH至3. 5 6. 5備用；3)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度2(T50°C，轉速15(T600r/min條件下搖床培養5 7d，然后將菌懸液2 7%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養8 15d后得到發酵液；在700(Tl5000r/min下離心5 15min，上清液即為白腐菌T42酶液。作為優選方案，微量元素混合液為MnS04、NaCl、ZnSO4, FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、AlK (SO4) 2 12H20、HB03、CoCl2 6H20和NaMoO4 2H20任選一種或幾種復配而成，微量元素混合液濃度為0. 1%。本發明的優點是I、本發明的方法合理，操作方便，效果顯著，能顯著提高再造煙葉的柔軟度，同時使再造煙葉的感官質量得到提升，木質氣減少，刺激性降低。
2、本發明進行了大量的試驗驗證，根據白腐菌的結構特點和對煙梗木質素的降解特性，優化改性白腐菌，開發了新型的菌株白腐菌T42，該白腐菌T42菌株名為Coriolusversicolor T42，于2012年6月27日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: M 2012252，該白腐菌T42應用于煙梗漿料木質素的降解，證明白腐菌T42能提高再造煙葉的柔軟度和感官質量，并且該生物酶價格低廉、處理效果良好。3、本發明的白腐菌T42降解木質素有三個特點。第一，能徹底降解木質素生成CO2，而細菌至多將20%木質素碳轉化成CO2;第二，木質素降解主要是氧化反應，產物中不出現木質素單體；第三，木質素降解本身不提供菌生長和維持所需的碳源和能源，需要提供另外的碳源和能源供菌降解木質素。
具體實施例方式下面列舉一部分實施例對本發明的有關技術問題作進一步詳細的描述，有必要在此指出以下具體實施例只是對本發明的進一步說明，不代表對本發明保護范圍的限制。其他人根據本發明做出的一些非本質的修改和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例II、白腐菌T42酶液的制備所述白腐菌T42酶液按以下方法制備(I)培養基的制備將下述物質按所述重量百分比進行稱量配合。①PDA綜合瓊脂培養基馬鈴薯提取液2. 0%、葡萄糖20. 0%、KH2PO4 3. 0%、MgSO4 7H202. 0%、維生素B1 0. 002%、瓊脂15. 0%、酒石酸氨0. 07%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH至5. 0備用；②產酶培養基無水CaCl2 0. 08%、KH2PO4 0. 06%、無水 MgSO4 0. 10%、葡萄糖 0. 1%、酒石酸氨0. 50%、硝酸氨0. 20%、維生素B1O. 002%、微量元素混合液0. 001%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至4. 5備用；③微量元素混合液由MnS04、NaCl、ZnS04、FeSO4 7H20 和 CuSO4 5H20 復配而成，濃度為0. 1%。(2)、白腐菌T42菌株的培養
將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度40°C，轉速300r/min條件下搖床培養5d，然后將菌懸液2%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養IOd后得到發酵液；在4°C，9000r/min下離心5min，上清液即為白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液處理煙梗漿料在煙梗磨漿階段，加入2%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以煙梗絕干質量計，調節煙梗漿料的PH值為5. 0，煙梗漿料的溫度為50°C，保持上述溫度的時間為60min。經檢測，白腐菌T42酶液降解煙梗漿料中木質素后，制備的再造煙葉柔軟度提高了 10. 2%，感官質量評價提高了 I. I分。實施例2I、白腐菌T42酶液的制備所述白腐菌T42酶液按以下方法制備(I)培養基的制備將下述物質按所述重量百分比進行稱量配合。①PDA綜合瓊脂培養基馬鈴薯提取液3. 0%、葡萄糖30. 0%、KH2P042. 0%、MgSO4 *7H203. 0%、維生素B1O. 003%、瓊脂20. 0%、酒石酸氨0. 3%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH至5. 5備用；②產酶培養基無水CaCl2 0. 10%、KH2PO4 0. 05%、無水 MgSO4 0. 12%、葡萄糖 0. 2%、酒石酸氨0. 30%、硝酸氨0. 40%、維生素B1O. 003%、微量元素混合液0. 002%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至5. 5備用；③微量元素混合液由ZnS04、FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、HBO3 和 NaMoO4 2H20 復配而成，濃度為0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度50°C，轉速400r/min條件下搖床培養6d，然后將菌懸液3%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養9d后得到發酵液； 在8000r/min下離心lOmin，上清液即為白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液處理煙梗漿料在煙梗磨漿階段，加入3%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以煙梗絕干質量計，調節煙梗漿料的PH值為5. 5，煙梗漿料的溫度為45°C，保持上述溫度的時間為70min ；經檢測，白腐菌T42酶液降解煙梗漿料中木質素后，制備的再造煙葉柔軟度提高了 13. 4%，感官質量評價提高了 I. 3分。實施例3I、白腐菌T42酶液的制備所述白腐菌T42酶液按以下方法制備(I)培養基的制備將下述物質按所述重量百分比進行稱量配合。①PDA綜合瓊脂培養基馬鈴薯提取液I. 0%、葡萄糖20. 0%、KH2PO4 3. 0%、MgSO4 *7H20 3. 0%、維生素B1O. 003%、瓊脂10. 0%、酒石酸氨I. 0%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH
至4. 5備用；②產酶培養基無水CaCl2 0. 10%、KH2PO4 0. 04%、無水 MgSO4 0. 10%、葡萄糖 0. 1%、酒石酸氨0. 20%、硝酸氨0. 70%、維生素B1O. 003%、微量元素混合液0. 004%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至6. 0備用；③微量元素混合液由MnSO4' NaCU ZnSO4' FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、AlK (SO4)2 12H20、HBO3> CoCl2 6H20 和 NaMoO4 2H20 復配而成，濃度為 0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度40°C，轉速250r/min條件下搖床培養5d,然后將菌懸液4%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養8d后得到發酵液；在7000r/min下離心7min，上清液即為白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液處理煙梗漿料在煙梗磨漿階段，加入2%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以煙梗絕干質量計，調節煙梗漿料的PH值為3. 0，煙梗漿料的溫度為40°C，保持上述溫度的時間為30min。 經檢測，白腐菌T42酶液降解煙梗漿料中木質素后，制備的重組煙葉柔軟度提高了 15. 6%，感官質量評價提高了 I. 8分。實施例4I、白腐菌T42酶液的制備所述白腐菌T42酶液按以下方法制備(I)培養基的制備將下述物質按所述重量百分比進行稱量配合。①PDA綜合瓊脂培養基馬鈴薯提取液3. 0%、葡萄糖25. 0%、KH2PO4 4. 0%、MgSO4 *7H20 4. 0%、維生素B1O. 004%、瓊脂25. 0%、酒石酸氨2. 0%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH至5. 5備用；②產酶培養基無水CaCl2 0. 05%、KH2PO4 0. 08%、無水 MgSO4 0. 20%、葡萄糖 0. 2%、酒石酸氨0. 10%、硝酸氨0. 50%、維生素B1O. 004%、微量元素混合液0. 005%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至5. 5備用；③微量元素混合液由MnSO4' NaCU CuSO4 5H20、AlK (SO4) 2 12H20、HBO3 和CoCl2 6H20復配而成，濃度為0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度50°C，轉速350r/min條件下搖床培養7d，然后將菌懸液5%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養IOd后得到發酵液；在9000r/min下離心8min，上清液即為白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液處理煙梗漿料在煙梗磨漿階段，加入3%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以煙梗絕干質量計，調節煙梗漿料的PH值為4. 0，煙梗漿料的溫度為60°C，保持上述溫度的時間為40min。經檢測，白腐菌T42酶液降解煙梗漿料中木質素后，制備的再造煙葉柔軟度提高了 8. 9%，感官質量評價提高了 0. 9分。實施例5I、白腐菌T42酶液的制備所述白腐菌T42酶液按以下方法制備(I)培養基的制備
將下述物質按所述重量百分比進行稱量配合。①PDA綜合瓊脂培養基馬鈴薯提取液2. 0%、葡萄糖30. 0%、KH2PO4 2. 0%、MgSO4 7H20 I. 0%、維生素B1O. 005%、瓊脂15. 0%、酒石酸氨0. 08%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH至6. 0備用;②產酶培養基無水CaC l2 0. 20%、KH2PO4 0. 06%、無水 MgSO4 0. 15%、葡萄糖 0. 3%、酒石酸氨0. 40%、硝酸氨0. 10%、維生素B1O. 007%、微量元素混合液0. 003%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至4. 0備用；③微量元素混合液由ZnS04、FeSO4 7H20、A1K (SO4) 2 12H20、HB03、CoCl2 6H20和NaMoO4 2H20復配而成，濃度為0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度30°C，轉速200r/min條件下搖床培養6d,然后將菌懸液5%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養IOd后得到發酵液；在10000r/min下離心IOmin,上清液即為白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液處理煙梗漿料在煙梗磨漿階段,加入5%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以煙梗絕干質量計，調節煙梗漿料的PH值為6. 0，煙梗漿料的溫度為70°C，保持上述溫度的時間為60min ；經檢測，白腐菌T42酶液降解煙梗漿料中木質素后，制備的再造煙葉柔軟度提高了 8. 7%，感官質量評價提高了 0. 8分。實施例6I、白腐菌T42酶液的制備所述白腐菌T42酶液按以下方法制備(I)培養基的制備將下述物質按所述重量百分比進行稱量配合。①PDA綜合瓊脂培養基馬鈴薯提取液4. 0%、葡萄糖35. 0%、KH2PO4 5. 0%、MgSO4 7H20 2. 0%、維生素B1O. 002%、瓊脂20. 0%、酒石酸氨I. 50%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH至6. 5備用;②產酶培養基無水CaCl2 0. 30%,KH2PO4 0. 10%、無水 MgSO4 0. 05%、葡萄糖 0. 40%、酒石酸氨0. 60%、硝酸氨0. 30%、維生素B1O. 008%、微量元素混合液0. 003%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至4. 5備用；③微量元素混合液由MnS04、NaCl、ZnS04、FeSO4 7H20、HB03、CoCl2 6H20、NaMoO4 2H20復配而成，濃度為0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基，在溫度50°C，轉速500r/min條件下搖床培養7d，然后將菌懸液5%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養13d后得到發酵液；在8000r/min下離心12min，上清液即為白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液處理煙梗漿料在煙梗磨漿階段，加入10%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以煙梗絕干質量計，調節煙梗漿料的PH值為5. 0，煙梗漿料的溫度為50°C，保持上述溫度的時間為70min ；經檢測，白腐菌T42酶液降解煙梗漿料中木質素后，制備的再造煙葉柔軟度提高了 16. 5%，感官質 量評價提高了 2. I分。
權利要求
1.一種利用白腐菌酶液提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法，按照現有工藝技術方法完成煙梗原料磨漿階段前后的工序，其特征在于在再造煙葉生產過程的煙梗原料磨漿階段，按照煙梗原料物質干量的I. (Γιο. 0%的比例加入白腐菌Τ42酶液，在煙梗漿料溫度為30^80°C, pH值為2. (Γ6. 0，處理時間為2(T90min的條件下降解煙梗漿料中木質素，其中所述的白腐菌 T42 菌株名為 Coriolus versicolor T42，保藏號為 CCTCC NO: M 2012252。
2.根據權利要求I所述的利用白腐菌酶液提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法，其特征在于其中，所述白腐菌T42酶液制備步驟 DPDA綜合瓊脂培養基的制備按重量百分比進行稱量配合馬鈴薯提取液I. (Γ4. 0%、葡萄糖 20. 0 40· 0%、KH2PO4 I. 0 6· 0%、MgSO4 · 7H20 I. 0 5· 0%、維生素 B1 O. 001 O. 006%、瓊脂10. 0 30· 0%、酒石酸氨O. 05 2. 5%，用I. OmoI/L的鹽酸調節pH至3. 0 6· 5備用; 2)產酶培養基按重量百分比進行稱量配合無水CaCl2O. 05^0. 30%、KH2PO4O. 02 O. 10%、無水MgSO4 O. 05 O. 20%、葡萄糖O. I O. 5%、酒石酸氨O. 10 0· 80%、硝酸氨O. 10^0. 90%、維生素B1 O. ΟΟΓΟ. 008%、微量元素混合液0. 00Γ0. 005%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節PH至3. 5 6. 5備用； 3)白腐菌T42菌株的培養將白腐菌T42菌株接種在PDA綜合瓊脂培養基上，在溫度20^500C，轉速15(T600r/min條件下搖床培養5 7d，然后將菌懸液2 7%接種于產酶培養基到發酵罐中，培養8 15d后得到發酵液；在7000 150001·/!^!!下離心5 15min，上清液即為白腐菌T42酶液。
3.根據權利要求2所述的利用白腐菌酶液提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法，其特征在于所述步驟2)中，微量元素混合液由MnS04、NaCl、ZnS04、FeS04 ·7Η20,CuSO4 ·5Η20、AlK (SO4) 2 · 12H20、HB03、CoCl2 · 6Η20和NaMoO4 · 2Η20任選一種或幾種復配而成，微量元素混合液濃度為0. 1%。
全文摘要
本發明公開了一種利用白腐菌酶液提高再造煙葉柔軟度和感官質量的方法，按照現有工藝技術方法完成煙梗原料磨漿階段前后的工序，在再造煙葉生產過程的煙梗原料磨漿階段，按照煙梗原料物質干量的1.0~10.0%的比例加入白腐菌T42酶液，在煙梗漿料溫度為30~80℃，pH值為2.0~6.0，處理時間為20~90min的條件下降解煙梗漿料中木質素，其中所述的白腐菌T42菌株名為Coriolus versicolor T42，保藏號為CCTCC NO: M 2012252。本發明的方法合理，操作方便，效果顯著，能顯著提高再造煙葉的柔軟度，同時使再造煙葉的感官質量得到提升，木質氣減少，刺激性降低。
文檔編號A24B15/20GK102823938SQ20121029592
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者毛耀, 劉志昌, 姚元軍, 王鳳蘭, 王亮 申請人:湖北中煙工業有限責任公司, 武漢淡雅香科技發展股份有限公司