專利名稱：敗血癥治療用免疫吸附劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及敗血癥治療用免疫吸附劑，尤其涉及用于除去補體因子和脂多糖(LPS)的免疫吸附劑，以及視需要而定，用于除去其他敗血癥介體如TNF和體液淋巴激活素的免疫吸附劑。本發明還涉及該免疫吸附劑的制備方法與應用。
在美國、日本和歐洲，每年約有350萬患者得敗血癥。這些國家居民總人數為7億8千5百萬，患病率小于0.5％。但若對住院患者進行發病率診查，人們卻發現每100收住病例中有2.0±0.16例為敗血癥。觀察得知，這些患者中約有25％的人即使由資深專科醫生在裝備現代化的設施(監護病房)中進行最努力的醫療護理，也會患敗血性休克綜合癥，而該綜合癥的特征是致死率＞45％，所以這種發現在保健政策方面和個體性方面有著極大重要性。
尤其對多創傷性患者(交通事故、燒傷、高難手術)來說，敗血性休克的疾病危險程度非常高。除了外部感染之外，由于這些病人部分喪失免疫系統功能，抵御通常存在于腸道中的革蘭氏陰性菌的腸道屏障被穿破，從而可確認有內部感染。
在50％以上的疾病中，革蘭氏陰性菌或其由內毒素(脂多糖即LPS)組成的細胞壁組成部分，都會誘發敗血性休克。所述細菌釋出的LPS與血清蛋白質(LBP)結合，以便繼而被單核細胞/巨噬細胞(CD14)的LPS受體吸收。如此活化后的CD14+細胞產生細胞因子(TNFα、淋巴激活素-1(IL-1)、IL-6、IL-8)，它們經由靶細胞的細胞因子受體起作用。
在刺激單核細胞和巨噬細胞的同時，補體系統得以活化。這是哺乳動物用于直接和非特異性防治細菌類微生物及異物顆粒的免疫性防御所必不可缺的組成部分。存在于血清的補體蛋白質中，占優先地位的是經蛋白水解裂解活化的前酶，血清濃度約1g/1的C3-蛋白質起著重要作用。微生物與C3接觸后，補體蛋白質C3a發生裂解，并一方面借助所產生的C3b形成C5轉化酶(補體活化的另一種方法)，另一方面反應因此而擴展，C3b通過血清因子積聚而變成C3轉化酶。同樣存在于血清中的補體蛋白質C5，這時由于此種加大提供的C5轉化酶而發生蛋白水解分裂，形成C5a。其他補體蛋白質(C6-C9)在所產生的C5b上積聚，直到最后形成聚合物類疏水性胞膜攻擊配合物(Membranangriffskomplex，縮寫為MAK)，該胞膜攻擊配合物插入細菌胞質膜(調理素作用，Opsonidierung)并形成孔隙，這些孔隙產生吞噬作用，從而消除微生物(并消除所結合的MAK)。由于血管通透性提高和因血管通透性提高而誘導化學吸引素(Chemotoxinen)釋出，致使補體活化過程中釋出的補體因子C3a和C5a(過敏毒素)引誘細菌侵襲位置上的吞噬細胞。細菌數減少引起補體系統激活作用降低。這種直接而非特異性的反應與其他免疫防御系統在例如通過補體因子來調節主導細胞防御的細胞因子的合成和釋放的范圍內密切交錯。為介導炎癥效應起見，使C3a和C5a與對細胞固有受體特異的受體結合，這些受體因免疫反應性而異，又被不同程度地強烈表達。為不斷獲得能隨時反應的免疫防御起見，活化補體因子不僅在微生物侵襲后可檢測，而且常人血清不可缺少的組成部分濃度為1-10ng/ml。
尤其在進行性敗血癥情況下、在急性肺衰竭情況下以及在患者瀕死情況下，過敏毒素的血漿中含有量提高一千倍以上。
為消除那些因具有預料中的副作用而幾乎不能在活體條件下進行試驗的各種不同補體因子所致影響起見，幾乎除了以活體外為基礎的診查還存在著一些最不相同的大多數起非特異性作用的溶液變更(例如WO-A-98/34959)。
在活體內預防補體活化方法中，借助人工體外表面(例如表層)，成功地進行了非特異性補體去活化作用。此外，由US5,853,722還已知使用特異性C5抗體來選擇性清除活性補體因子，而且還無疑地優選生成間歇對抗補體系統所有組分的特高親和性抗體。
這些闡明功能的鏈鎖特別有利于對侵入機體的細菌進行清除。然而，入侵細菌數目及/或病毒性和免疫系統除菌能力(例如外傷后免疫缺陷時)之間一出現不一致，就觀察到過剩的激活作用，接著伴隨這種過剩的激活作用，大量釋放“休克介體”(淋巴激活素、血小板激活因子(PAF)、還有氧自由基、前列腺素及其代謝產物)，進一步消減對LPS的除菌能力。此外，由于血漿中可溶性CD14(sCD14)作為LPS捕捉者存在，它使與細胞的結合變得容易一些，并誘導其他休克介體形成和釋放，因此而增加有缺陷的環，所以借助LPS還使CD14陰性細胞(例如內皮)活化。由于休克介體雖然選擇性起作用而并不起特異作用，所以在不同細胞和器官中觀察到功能局限性(凝血系統、循環、補體系統)，以致侵襲整個機體的炎癥反應導致休克發生，這就導致不可逆器官損傷、循環衰竭，并導致死亡。
為突破此機能鏈起見，曾研究過各種不同的治療方略。
在不同的動物試驗敗血癥模型上，雖然成果給人留下深刻印象，但分別中斷抗體鏈鎖和拮抗藥鏈鎖，而所述抗體中斷蛋白質(LBP、sCD14)上、受體(CD14)上、釋出的細胞分裂素上或者細胞素受體上的LPS結合，所述拮抗藥則阻滯受體作用的范圍，所以迄今為止還沒有臨床試驗上卓有成效的預防及/或治療方面的研究結果。
由于必須不斷清楚地看到，LPS還影響到細胞和組織，而且其不被這種治療配藥損害的機能狀態發生了變化，所以高度的期待不能予以滿足。此外還須考慮到，必須消除掉被抗體/拮抗藥滅活的LPS(免疫復合體)，以便永久消除生物反應活性。然而，清除也是免疫系統的函數，它由于強烈減弱，而使該目的幾乎不能或者僅能非常不完美實現。
敗血性休克的進行是一種非常動態發生的病程，最初以不同的程度發生，在短時間中，不同介體引起非常不同的反應，然后按照無抵抗力生命維持的作用迅速因調節失調而導致敗血性休克明顯形成。
本發明賴以為基礎的目的在于，研制一種尤其用于體外解毒、使患者特異性血漿含量和組織含量有可能降低的預構免疫吸收系統。
此外，本發明還以TNFα在該調節系統中占據主要地位的發現為基礎。它通過大相徑庭的“外部”影響如外傷、炎癥、感染、敗血癥等等由巨噬細胞釋出，并經由細胞因子鏈鎖(IL-1、IL-6)誘導非特異性和特異性防御系統的局部激活作用和系統性激活作用。臨床上表現出來的是，體溫高時大量釋放TNFα、食欲不振以及降解代謝型代謝狀況的所有后遺癥狀。敗血癥發病機理中，在疾病早期，看來巨噬細胞激活作用和因此而引起的TNFα釋放，對病人能否活下來有著本質上的意義，然而在后續過程中，激活狀態中斷引起所有防御反應代償失調。
本發明的上述目的借助一種敗血癥治療用免疫吸附劑來實現。本發明免疫吸附劑尤其用來清除補體因子和脂多糖(LPS)，以及視需要而定，用來清除其他敗血癥介體，如TNF和體液中的淋巴激活素。該吸附劑以其載體材料為特征，所述載體材料由有機聚合物或合成聚合物制成，其上不僅結合了抗補體因子C3a及/或C5a的多克隆抗體或單克隆抗體，而且還結合了抗脂多糖(LPS)的抗體。在一種優選實施方式，還有抗其他敗血癥介體的抗體與所述載體結合。
優選涉及的是多克隆抗體，尤其優選涉及的是IgY型的aviaere抗體。根據調節障礙的狀況，含有抗敗血癥介體的抗體。
在此情況下，本發明涉及那些抗TNF、IL1、IL6、IL8及/或IL10的抗體。
抗補體因子C3a的優選抗體，至少對下列肽序列中的一種肽具有特異活性NH2-KCCEDGMRQNPMR-COOHNH2-RFSCQRRTRFISL-COOHNH2-ITELRRQHARAS-COOH抗補體因子C5a的優選抗體，至少對下列肽序列中的一種肽具有特異活性NH2-QADYKDDDDKLPAE-COOHNH2-DDKLPAEGLDIENS-COOH抗IL1α/β的優選抗體，至少對下列肽序列中的一種肽具有特異活性NH2-NCYSENEEDSSSID-COOHNH2-GAYKSSKDDAKIT-COOHNH2-WETHGTKNYFTS-COOHNH2-RISDHHYSKGFRQA-COOHNH2-VQGEESNDKIPVA-COOHNH2-ESVDPKNYPKKKMEKRF-COOH抗IL6的優選抗體，至少對下列肽序列中的一種肽具有特異活性NH2-APHRQPLTSSERIDKQI-COOHNH2-QNRFESSEEQARA-COOHNH2-AITTPDPTTNAS-COOH
抗IL10的優選抗體，至少對下列肽序列中的一種肽具有特異活性NH2-SPGQGTQSENSCT-COOHNH2-QMKDQLDNLLLKES-CCOHNH2-MPQAENQDPDIKA-COOHNH2-LPCENKSKAVEQ-COOH抗TNFα的優選抗體，至少對下列肽序列中的一種肽具有特異活性NH2-VRSSSRTPSDKPVA-COOHNH2-KSPCQRETPEGAEAKPW-COOH本發明免疫吸附劑以本身常用的膜或顆粒作為載體材料，所述膜或顆粒由有機或合成聚合物制成，例如由聚苯乙烯、碳水化合物如纖維素衍生物或瓊脂糖衍生物制成，或者由丙烯酸鹽制成，因此特異抗體可與載體材料共價結合，或者經由間隔序列或聯結子固定在載體材料上。
本發明免疫吸附劑借助本身已知的方法來制備，制備時使抗C3a及/或C5a及LPS以及視需要而定抗其他敗血癥介體的抗體與由有機聚合物或合成聚合物制成的載體材料共價結合，或者以吸附方式與所述載體材料偶合。
所述特異抗體用本身已知的免疫接種法來制造，優選用具有相應抗原的小型哺乳動物如小鼠、大鼠或家兔或者禽類如母雞來制備。
本發明的主題還包括本發明免疫吸附劑在裝置中清除補體因子、LPS和視需要而定清除來源于體液如血漿等因患者特異性情況而異的其他介體方面的應用。
優選將本發明免疫吸附劑用于對患有敗血癥或敗血性休克的病人進行去血漿療法的敗血癥治療。
雖然對大多數物質(Substanzen)都可用能按已知方法與不同載體偶合的抗體，但是優選使用鳥類(aviaere)抗體，因為與哺乳動物抗體相反，這種抗體不能激活。由于活化性能受哺乳動物抗體fc部分的制約，原則上也可使用以番木瓜蛋白酶裂解的Fab斷片。
按照目前的了解程度，固定的鳥類(aviaere)抗體對人類絲毫沒有非特異性作用。以常規方法對鳥，優選母雞不用或采用輔劑進行免疫接種。在蛋黃中析出特異免疫球蛋白，并且使之能以常規方法從中分離出來。以已知方法使之經由fc部分與大顆粒或膜共價結合。
本發明體外解毒免疫吸附系統首先提供了一種選擇性系統，它可患者特異性地使用，并能消除免疫系統的調節失常。
下列各實施例進一步闡明本發明實施例1用免疫原肽制備多克隆抗體用固相合成法制造表1中列舉的肽表1
使制得的肽與載體(KLH)共價結合。使所述軛合物溶于PBS，與等份弗羅因德氏佐劑混合。將每次接種劑量調節得使之含有歸屬相應抗原的肽各200μg。用這些混合物對15周齡的幼母雞進行免疫接種，并且在4周時間內增效4次。
實施例2用脂多糖(LPS)制備多克隆抗體將埃希氏大腸桿菌J5的純化LPS(SIGMA公司出品)溶于PBS，并與等份弗羅因德氏佐劑混合。用此混合物對15周齡的幼母雞s.c.進行免疫接種。LPS劑量為每次免疫接種1毫克LPS。在4周時間內進行4次增效。
實施例3從卵黃中提取抗體(IgY)收集窩中免疫接種后母雞下的蛋。分離出含抗體卵黃后，將之貯藏于-20℃下。按照需要將蛋黃解凍，并且按下列程式進行預加工(C.Schwarzkopf，B.Thiele(1996)ALTEX 13 Suppl.16，35-3)A TBS20mM Tris/HCl，pH7.5，0.5M NaClB 10％(w/v)硫酸葡萄糖溶于A所成的溶液 溶液C 1M CaCl2D 0.5M EDTA，pH7.5E飽和硫酸銨溶液將蛋黃(每個蛋黃的體積相當于10-20ml)懸浮于100ml TBS中。用硫酸葡萄糖(6ml B每100ml TBS蛋黃懸浮液)和Ca++(15ml C每100ml TBS蛋黃懸浮液)使脂質和脂蛋白沉淀，室溫下攪拌30至60min并用5,000轉/分鐘進行離心分離。所得片狀沉淀物用小體積TBS(約20ml/g蛋黃)洗滌，并再次進行離心分離。
合并后的上清液用紙過濾器進行過濾，然后向濾液中添加0.5M EDTA，直至最終濃度約為30mm EDTA(6ml每100ml)，以牢固結合剩余的Ca++離子。接著，每100ml上清液加入24.3克硫酸銨(相當于40％飽和)，并在+4℃下保溫30min。所產生沉淀物(IgY)先用30％(NH4)2SO4(30mlE+70ml蒸餾水)進行洗滌、離心分離，然后以盡可能最小的體積溶解TBS(約10ml/所用的蛋黃)，并對TBS進行透析。
IgY的含量在275nm光條件下用光度測定法進行測定。
實施例4a)載體活化使按實施例3除雜的IgY與相宜的載體共價結合。為此，例如可如下所述，使瓊脂糖珠活化(H.-F.Boeden，W.Büttner，C.Rupprich，D.Büttner，S.Heinrich，M.Becker，M.Holtzhauer(1992)Makromol.Chem.193，865-887)將所述瓊脂糖載體分多步，也即以逐步增加20％的量轉化成丙酮。最后，在密閉容器中，將五倍于流化床床體積的載體用無水丙酮靜置過夜，并再次用5至10體積的無水丙酮洗滌，并用G2玻璃漏斗迅速吸濾。向10ml沉淀后的載體添加400mg N-(氯代羰氧基)-5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亞胺(ClCOONB)溶于10ml無水丙酮p.a.所成的溶液。邊搖振邊在15分鐘內滴加由280μl三乙胺和20毫克4-二甲基氨基-吡啶(DMAP)溶于5ml無水丙酮所成的溶液(摩爾比ClCOONB∶三乙胺∶DMAP1∶1，2∶0，1)。接著，再搖振15分鐘，然后用約200ml無水丙酮洗滌載體。
b)固態載體與IgY的結合分多步將按實施例4a)進行過活化的多糖基質(凝膠)轉移到水基介質中，然后立即攪入含有配位體的偶聯溶液中。將pH4.2的檸檬酸鹽緩沖液用作偶聯緩沖液。室溫下輕輕搖振2小時，進行偶聯。接著，添加乙醇胺，將自由鍵封閉。表2中示明各別抗體的具體條件。
表2
實施例5使用按實施例4固定的抗體，以便從液態介質如緩沖液、血清脂多糖或血漿脂多糖中除掉淋巴激活素、TNF或者補體因子。
為此，對載體進行洗滌，轉移到生理緩沖液(PBS)中，并裝入無氣泡塑料柱或玻璃柱中。連接色譜儀，把裝置配成套。這時，可借助重力或用相宜的泵，經由固定的、對所舉抗原特異的抗體，引入待吸附的材料樣品(添加了抗原的緩沖溶液、摻雜或含自然抗原的血清樣品或血漿樣品)。現存的抗原被IgY辨出，牢固結合，從而從流過分離柱的介質中分離出來。經柱流分析(ELISA)，柱流中抗原含量減少，證明有效。分離柱經生理緩沖溶液洗滌后，以相宜洗脫劑(0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH3)脫附結合抗原，分餾并分析洗脫液。抗原的定量測定用來確定免疫吸附劑的吸附容量。
權利要求
1.敗血癥治療用免疫吸附劑，其特征在于，載體材料由有機聚合物或合成聚合物制成，載有抗補體因子C3a及/或C5a并抗脂多糖(LPS)的結合多克隆抗體或結合單克隆抗體，以及視需要而定，載有抗其他敗血癥介體的抗體。
2.權利要求1所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述抗體為多克隆抗體。
3.權利要求2所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述抗體為IgY型鳥抗體。
4.權利要求1至3所述的免疫吸附劑，其特征在于，根據調節障礙的狀況，含有其他抗敗血癥介體的抗體。
5.權利要求1和4所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述抗體為抗TNF、IL1、IL6、IL8及/或IL10的抗體。
6.權利要求1所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述結合抗體針對至少一種下列補體因子C3a以及C5a的肽序列C3aNH2-KCCEDGMRQNPMR-COOHNH2-RFSCQRRTRFISL-COOHNH2-ITELRRQHARAS-COOHC5aNH2-QADYKDDDDKLPAE-COOHNH2-DDKLPAEGLDIENS-COOH。
7.權利要求5所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述結合抗體針對至少一種下列白細胞介素1α以及1β的肽序列IL1αNH2-NCYSENEEDSSSID-COOHNH2-GAYKSSKDDAKIT-COOHNH2-WETHGTKNYFTS-COOHIL1βNH2-RISDHHYSKGFRQA-COOHNH2-VQGEESNDKIPVA-COOHNH2-ESVDPKNYPKKKMEKRF-COOH。
8.權利要求5所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述結合抗體針對至少一種下列淋巴細胞激活因子6的肽序列IL6NH2-APHRQPLTSSERIDKQI-COOHNH2-QNRFESSEEQARA-COOHNH2-AITTPDPTTNAS-COOH。
9.權利要求5所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述結合抗體針對至少一種下列淋巴細胞激活因子10的肽序列IL10NH2-SPGQGTQSENSCT-COOHNH2-QMKDQLDNLLLKES-CCOHNH2-MPQAENQDPDIKA-COOHNH2-LPCENKSKAVEQ-COOH。
10.權利要求5所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述結合抗體針對至少一種下列肽序列TNFαNH2-VRSSSRTPSDKPVA-COOHNH2-KSPCQRETPEGAEAKPW-COOH。
11.權利要求1至10所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述有機或合成載體材料由聚苯乙烯、碳水化合物如纖維素衍生物或瓊脂糖衍生物或者丙烯酸鹽(酯)制成的膜或顆粒構成。
12.權利要求1至11中任何一項所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述特異抗體與膜或顆粒共價結合。
13.權利要求1至11中任何一項所述的免疫吸附劑，其特征在于，所述抗體經由間隔序列或聯結子固定在載體材料上。
14.權利要求1至13所述免疫吸附劑的制備方法，其特征在于，抗體與載體材料由有機聚合物或合成聚合物制成的載體材料共價結合或以吸附方式結合，所述抗體針對C3a及/或C5a及LPS，以及視需要而定針對其他敗血癥介體。
15.權利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體經免疫法，優選對小型哺乳動物如小鼠、大鼠或家兔或者禽類如雞進行免疫，用相應的抗原來制造。
16.權利要求1至13所述免疫吸附劑作清除補體因子、LPS以及視需要而定、源于體液的患者特異性組合物中其他介體器件有效組成部分的應用。
17.權利要求16所述的應用，其特征在于，所述免疫吸附劑用于對敗血癥或敗血性休克及其他炎癥并發疾病的患者進行去血漿療法。
全文摘要
本發明涉及敗血癥治療用免疫吸附劑,尤其涉及用于除去補體因子和脂多糖(LPS)的免疫吸附劑,以及視需要而定用于除去其他敗血癥介體如TNF和源于體液的淋巴細胞因子的免疫吸附劑。本發明還涉及該免疫吸附劑的制備方法與應用。
文檔編號A61M1/34GK1346280SQ00805568
公開日2002年4月24日 申請日期2000年3月23日 優先權日1999年3月26日
發明者H·W·海里西, H·J·漢, U·邁爾, P·克路西可, H·J·瓦格納 申請人:生化研究股份公司