專利名稱：神經節苷脂在制備抗癲癇藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及神經節苷脂(英文名稱Gangliosides)的用途，尤其涉及神經節苷脂在制藥領域中的用途。
目前已有成熟的從動物組織中提取神經節苷脂的技術和進一步分離純化的技術，其中的GM1作為藥品已有市售產品，其商品名為施捷因，單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉鹽注射液，進口注冊證號x19990444，x19990445，生產商阿根廷TRB藥廠trb pharma s.a.；專利申請號93112578報道了一種含神經節苷脂為主的腦保健品，中國專利95111569公開了一種含神經節苷脂為主的糖脂類物質的生產方法等。
神經節苷脂是一種具有廣泛用途的酸性糖鞘脂。中華航空航天醫學雜志2000年第1期第11卷；同濟醫科大學學報，2000；29(5)414-416、中風與神經系統疾病雜志1993；10(4)193.；《臨床神經病學雜志》2000年第13卷第2期等許多文獻報道了神經節苷脂在以下方面的臨床藥用價值1.由于各種原因引起的中樞神經系統結構損傷的功能恢復；2.對腦血管意外及創傷后的中樞神經系統后遺癥有治療作用；3.對缺血性和出血性的腦病變有治療作用。而該物質在制備抗癲癇藥物中的應用尚未見報道。
癲癇包括多組疾病和綜合征，是由多種原因引起的一種慢性腦功能障礙性疾病。不論病因如何，均以病程中有反復發生的大腦神經元過度放電所致的暫時性中樞神經系統功能失常為特征，以肌肉抽搐和(或)意識喪失為其重要表現，另外還可表現為感覺、行為、自主神經(即植物神經)等方面的障礙。具有發作性、復發性及通常能自限的特點。其患病率在一般人口中約(5～8)‰，我國人群癲癇的終生患病率為7‰，其中兒童和青少年是癲癇的高發人群。然而，目前癲癇人群的治療狀況令人擔憂，40％多的患者從未進行治療，35％的患者接受不正規治療，不能有效控制癲癇發作，會嚴重損害患者的智力，尤其對青少年。
癲癇的發生機理至今尚未完全清楚，它涉及遺傳、解剖、生理生化、病理生理和免疫等范圍，目前比較統一的看法是①癲癇的發生是由遺傳因素、腦內癲癇性病理改變和促發因素三者相互結合所產生的，任何一個單獨的因素都不可能導致癲癇發生。②腦神經元的膜電位不穩定，驚厥閾值下降，并出現異常放電是癲癇發作的實質。③每次的癲癇發作都包含起動、發作性放電的維持與擴展，以及發作性放電的抑制3個不同而連續的病理生理過程。在這個過程中，腦內鈉、鉀、鈣、氯等離子的傳導，興奮性神經遞質(如谷氨酸、天門冬氨酸)及抑制性神經遞質(如γ-氨基丁酸)均起重要作用。腦內發作間放電是產生癲癇的基礎，發作間放電代表某腦區神經元群異常的同步去極化，神經元去極化時Na+內流，K+持續外流，使細胞外K+急劇升高；同時神經膠質細胞的保護機制失調促進癇樣放電的擴展，Na+，K+-ATP酶的正常功能是將細胞外的K+攝入細胞內，已證實在各類癲癇活動病灶中，膠質細胞、神經元內Na+，K+-ATP酶的活性對細胞外K+急劇升高的反應速度顯著下降，即使在癇樣放電達到高峰時也如此，說明其細胞已失去清除K+的功能。實驗證明細胞外K+升高與癲癇發作有直接關系。
西方醫學認為部分癲癇患者經過腦部手術與長期的抗癲癇藥物的治療能有效的控制疾病的發展。但是，在實際的治療當中往往不能達到預期的效果，珈瑪刀手術的治愈率只有3％，而且部分抗癲癇的西藥長期大量應用可能導致病人性格與行為的改變嚴重時甚至造成呆納或癡呆的腦功能改變，而且部分藥品在癲癇大發作時無法顯示出可靠的療效。傳統抗癲癇藥物引起毒性作用的機制可能涉及藥物代謝途徑、代謝的相互影響及藥物間的相互作用。如卡馬西癥可引起病人體內酶的自身誘導、肝藥酶的合成并增加酶活性使藥物代謝加快；苯妥英顯示飽和代謝；丙戊酸為濃度依賴蛋白結合型藥物，卡馬西癥、苯巴比妥及丙戊酸還為氧化代謝型藥物，這成為藥物間相互作用、影響代謝、增加毒性的基礎；苯巴比妥與苯妥英引起肝藥酶抑制，卡馬西平與丙戊酸能抑制其它抗癲癇及其它藥物的代謝。鑒于以上機制使毒性增加，給臨床使用增加難度。克服傳統抗癲癇藥物的特點，為難治性癲癇病人提高療效，研究開發具有預想特征的新一代抗癲癇藥物當務之急。
Mattson等認為無論癲癇發病機制與傳統AED作用機制研究上取得何等進展，新一代抗癲癇藥物的選擇主要取決于控制發作或減輕發作類型的療效與藥物耐受性的考慮，且有必要權衡臨床療效與毒性間的利弊，制藥過程與藥動學特征及其藥物價格在藥物選擇與個人病人治療指導上也需謹慎斟酌。
近年來對神經節苷脂的生理學功能研究表明1.經離體神經細胞培養和外科神經去勢的動物模型證實，外源性神經節苷脂與細胞膜結合后能增加神經生長因子的功能，促進神經生長，加速神經支配功能的恢復。增加感覺神經、交感神經和中樞膽堿能神經元軸索生長的營養作用；2.經在體動物實驗，發現神經節苷脂促進神經生長，加速受損神經恢復；3.離體和在體實驗均顯示，外源神經節苷脂能平穩進入細胞膜，同時激活細胞膜上的鈉-鉀-ATP酶的活性，該酶的活化是信息傳遞的基礎；4.動物實驗顯示，神經節苷脂具有周圍神經鎮痛作用。這些研究一方面表明，神經節苷脂可直接作用于腦細胞的有氧呼吸、氧化磷酸化及ATP合成的作用，從而激活、營養、增強腦細胞及神經元的生長、發育及恢復，使病灶逐步被消除、代償、腦功能得到康復；另一方面表明，神經節苷脂作為理想而安全的新一代抗癲癇藥物的可能。
作為新一代抗癲癇藥物應有能控制發作程度和時程的這種作用機制的基礎，增加療效譜，適合于抗癲癇藥物的聯合治療，不僅可作用于多種神經遞質受體或離子通道，還能在細胞與分子水平上更特異地作用于其它已知的或不同的受體與通道，以提高療效或顯示新的效果；應有較好的耐受性，有較高的治療指數，適合癲癇癥的長期治療，無致畸作用；在藥劑學與藥動學特性方面應適合多種給藥途徑，易于投藥，吸收充分，宜于多種劑量配方，代謝過程簡單，不與蛋白結合或代謝，與其它抗癲癇或其它藥物無相互作用。使治療簡便易行，無需廣泛的監護與繁瑣的劑量調整，適用于其它軀體疾病或老年人的伴隨藥物治療。近年來研究發現神經節苷脂可作為抗癲癇藥物，顯示一定的療效。
為了更好地理解本發明的實質，以下將用神經節苷脂的毒理、藥理和臨床實驗及結果來說明其在制藥領域中的新用途。
采用《一種分離純化制備神經節脂工藝》專利申請號85102590，公開的技術改良后進行提取純化神經節苷脂，純度達95％以上；用無熱源去離子水將神經節苷脂溶解、消毒，配置成25mg/ml/支或50mg/2ml/支的注射劑備用；或按本領域技術人員公知的方法制備神經節苷脂膠囊，以8％淀粉漿為黏合劑，制成顆粒，然后裝膠囊，制成的膠囊規格為25mg/囊。
具體實驗和臨床結果分述如下一、動物實驗1.小鼠口服神經節苷脂急性毒理實驗臟器組織學病理切片檢查由上海第二醫科大學病理教研組完成。
采用實施例4所配置的膠囊，選用40只22月齡雄性Wistar大鼠(軍事醫學科學院動物中心提供)，體重(455±30)g，平均分成4組，一次灌胃神經節苷脂，根據預實驗，最高劑量定為150mg/kg體重，以25mg的比例遞減，即為150、125、100、50mg/kg四個劑量組，連續喂養14天。結果服用組大鼠無死亡，另一組用蒸餾水作對照；比較各組體重情況、血液學和生化檢測、臟器重量和組織學檢查均正常，結果顯示服用組與對照組無顯著差異。
2.神經節苷脂小鼠肌肉注射急性毒理實驗在上海醫科大學藥學院進行。采用實施例3配置的注射劑，昆明小鼠肌肉注射神經節苷脂的急性毒性進行檢驗，結果無死亡，各組織器官未發現病理變化。
小結上述結果表明神經節苷脂無毒性，臨床使用安全。
二、神經節苷脂抗癲癇模型的藥效學實驗研究(一)神經節苷脂對戊四唑(PTZ)點燃模型的影響PTZ點燃模型，其驚厥行為與腦電圖異常放電同步，建立后能維持較長時間，是研究癲癇最常用的模型之一。
1.大鼠PTZ點燃模型的制備1)實驗動物22月齡SD大鼠70只，隨機分為3組(治療組、模型對照組和正常組)，由上海醫科大學實驗動物中心提供。
2)點燃模型的誘發注射34mg/kg的PTZ，記錄各組動物的反應級別。
2.方法治療組(N＝30)治療實驗采用實施例4的膠囊，連續每天一次給予神經節苷脂12.5mg/kg灌胃；對照組(N＝30)連續每天一次給予生理鹽水5ml/kg；正常組(N＝10)與治療組和對照組相同地每天一次喂食生理鹽水5ml/kg；在90天后，用34mg/kg PTZ腹腔注射，測試其抗癲癇效應，觀察行為變化60分鐘。
3.觀察項目根據點燃大鼠行為驚厥評分標準，參考文獻《Functional Neuology》，1994，9(1)3-94.結果結果顯示，治療后驚厥級別與治療前相比，模型對照組升高(P＜0.01)；治療組反應級別下降(P＜0.05)，正常組始終無驚厥出現。結果見表1。
表1神經節苷脂對PTZ點燃模型的影響(x±s)
治療組，治療后反應級別與治療前比P＜0.05。
小結神經節苷脂可阻斷大鼠點燃后發作程度的進行性加重，使其發作級別降低。
(二)神經節苷脂和苯巴比妥對大鼠聽源性發作的影響和不良反應P77-PMC聲源發作癲癇雄性大鼠(AS)是一種先天型遺傳模型，相當于臨床癲癇打發作；苯巴比妥(又稱魯米那)是臨床常用的抗癲癇藥。
1.實驗動物P77-PMC聲源發作癲癇雄性大鼠(AS)54只，體重152～162g，購自上海醫科大學實驗動物中心，隨機分成6組。
2.方法神經節苷脂組采用實施例3的注射液，按給藥的不同劑量平均分成4組，每組9只(N＝9)；每組每天的給藥劑量分別為100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg，用生理鹽水稀釋；苯巴比妥組(N＝9)每天的給藥劑量為100mg/kg，用生理鹽水稀釋；
模型組(N＝9)連續每天一次給予生理鹽水5ml/kg；先測定各組大鼠給藥前對鈴聲的刺激反應強度，然后給各組大鼠腹腔注射30天后，測定大鼠對鈴聲的刺激反應強度。
3.觀察項目根據AS大鼠對鈴聲的刺激反應強度標準評分，參考文獻《Vire Res》，1974，(Supp.1)1434.結果(1)不同劑量的神經節苷脂注射液對AS發作有不同的對抗作用，其劑量反應呈正比關系，當給藥劑量為50mg/kg時，抗驚厥率達100％；(2)神經節苷脂和苯巴比妥組與模型組相比均有顯著的抗驚厥率(P＜0.05)，兩治療組相比無顯著差異(P＞0.05)；結果見表2。
(3)不良反應，苯巴比妥組在治療過程中出現嗜睡、和發燒現象；神經節苷脂組在治療過程中未發現任何毒性反應。
表2藥物對AS大鼠發作的影響(x±s)
平均分數與給藥前比較P＜0.05；抗驚厥率與模型組比較P＜0.05。
小結神經節苷脂對AS癲癇模型有明顯的拮抗作用，且無不良反應。
三、神經節苷脂治療癲癇患者的臨床實驗1.病例選擇結合病史及腦電圖確診的癲癇305例，其中男166例，女139例。年齡1～50歲，大多數為15～30歲。病程在1～20年以上。5年以上者61.2％。
本組305例經回顧病史，腦電圖檢查，腦炎后遺癥者45例，腦外傷后遺癥者11例。由頻繁受驚造成的兒童癲癇患者36例，余為無明顯誘因者193例。
2.治療方法對305例癲癇患者均單獨以實施例4的膠囊治療，不配有其它中西藥物。患者于治療前及療程結束后1周內復查腦電圖。口服1次1粒，1日3次，療程為6個月。
3.療效評定標準(1)完全控制癇癥未再發作，腦電圖示正常，隨訪1年未見復發。
(2)基本控制癇癥發作次數明顯減少。
(3)有效癇癥發作次數頭減小，癥狀減輕，但腦電圖不正常。
(4)無效癇癥發作次數雖有減少或癥狀有的所減輕，但和治療前無明顯差別，甚至加重為無效。
4.結果305例患者中，按以上療效標準完全控制20例，占6.56％；基本控制94例，占30.81％；有效50例，占22.62％無效122例，占40.00％，總有效率為52.77％，在治療過程中患者未出現藥物毒副作用反應。見表3。
表3癲癇患者神經節苷脂治療療效觀察
由表3可見，癲癇患者經神經節苷脂治療后，癥狀得到明顯控制。
由上述公開的毒性、藥理實驗和臨床實驗可見1)神經節苷脂可阻斷大鼠點燃后發作程度的進行性加重，使其發作級別降低；2)神經節苷脂對AS癲癇模型有明顯的拮抗作用，且無不良反應；3)臨床研究表明，神經節苷脂能有效地控制各類型癲癇患者的臨床癥狀，總有效率達52.77％，且無不良反應；4)神經節苷脂無毒性，臨床使用安全。
附神經節苷脂含量測定神經節苷脂的測定方法參照Biochim Biophys Acta 1957 Vol.24 p604的方法和國際上同行實驗室的分析方法加以改良而制定，經實踐證明完全適用于在科研分析和商品檢驗中對神經節苷脂含量的正確測定，經上海技術監督局審核批準，已列入“企業標準”。
1.材料(1)間苯二酚儲液2克間苯二酚溶于100毫升蒸餾水中，冰箱放置。
(2)對照工作液(A液)80毫升鹽酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、19.75毫升蒸餾水。
(3)間苯二酚工作液(B液)10毫升間苯二酚儲液、80毫升鹽酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、9.75毫升蒸餾水。此工作液至少在使用前的4小時配制，冰箱放置。
(4)正戊醇(C液)。
(5)標準品唾液酸(Sigma產品)(6)紫外分光光度計SPD-1型，日本產(Spectrophotometric Detector SPD-1，Shimadzu，Japan)2.方法電子天平精確稱取5毫克標準樣品溶于5毫升蒸餾水中，即為毫克/毫升標準溶液儲液，由上述標準溶液儲液配成10微克，20微克，30微克，40微克，50微克(系500微升中的濃度)儲液，冰箱放置。
標準曲線的制作a.取具塞試管5支，分別準確加入500微升已配制的5種濃度標樣，然后加入蒸餾水1.5毫升。
b.邊振蕩，邊加入2毫升B液；空白對照加500微升上述任意一種濃度的標樣，加1.5毫升水后，加2毫升A液。
c.100℃度水浴加熱15分鐘，然后在冷流動水中冷卻10分鐘。
d.邊振蕩，邊加入4毫升C液，冰浴中冷卻15分鐘。
e.離心5分鐘(3000轉/分)，吸取上清液，在OD580測定吸收值，作出標準曲線(在OD580讀數為縱軸，濃度為橫軸)。
樣品的測定樣品(膠囊20囊)溶于5毫升蒸餾水中，稍離心后，取三支具塞試管，分別加入搖勻樣品200微升混懸液。以下操作方法均按照標準曲線的制作方法進行。樣品中神經節苷脂含量的計算 斜率斜率從標準曲線中求得。稀釋倍數指測定是標準溶液總體積500微升與加入的被測樣品體積比。5.82系校正因子。
實施例1采用含神經節苷脂的動物臟器粗提取物(由寶智生物制品有限公司提供)，濃縮后，加5倍體積的丙酮沉淀，得到白色固體，過濾后真空干燥；用2倍量的含氯化鉀的68％乙醇溶解于燥固體，作為上柱液；再應用柱層析的方法提純具體工藝如下(1)樹脂的處理將經過堿乙醇和酸乙醇處理過的樹脂，用水洗至中性，再以68％的乙醇溶脹后待用。樹脂用量，240升。
(2)柱吸附將制備好的上柱液用4N鹽酸pH 2～2.5上柱；流速為150L/h。
(3)淋洗用68％的乙醇洗去未被吸附的雜質；流速和溫度與吸附條件相同。
(4)洗脫經過淋洗后的吸附柱再以1.8倍柱體積的石油醚～食用乙醇混合液(體積比1/5)洗脫。洗脫速度90L/h。
(5)最后進行濃縮和干燥，收集的洗脫液在低于60℃溫度下減壓濃縮。濃縮后的液體用5倍體積的丙酮沉淀，得到的白色固體用真空干燥去除有機溶劑。
用上海市食品監督檢驗所提供的間苯二酚法測定含神經節苷脂的原料中神經節苷脂的含量。
實施例2按本技術領域人員公知的方法，將實施例1的神經節苷脂用1000ml無熱源純凈水溶解、消毒，制成注射液規格為25mg/ml/支。
實施例3按本技術領域人員公知的方法，將實施例1的神經節苷脂用1000ml無熱源純凈水溶解、消毒，制成注射液規格為50mg/2ml/支。
實施例4按本技術領域人員公知的方法，將實施例1的神經節苷脂制備膠囊，以淀粉為填充劑，以8％淀粉漿為黏合劑，制成顆粒，然后裝膠囊。制成膠囊的規格為神經節苷脂含量25mg/囊。
神經節苷脂原料 25克淀粉80克。
實施例5
按本技術領域人員公知的方法，將實施例1的神經節苷脂以檸檬酸和甘露糖作為添加劑制成口服液。制成口服液規格為神經節苷脂口服液25mg/10ml/支。
神經節苷脂原料 25克甘露糖 5克檸檬酸 5克純凈水 10升。
權利要求
1.神經節苷脂在制備抗癲癇藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了神經節苷脂在制備抗癲癇藥物中的新用途。神經節苷脂無毒性，臨床使用安全、方便；對戊四唑點燃模型，神經節苷脂可阻斷大鼠點燃后發作程度的進行性加重，使其發作級別降低；神經節苷脂對AS癲癇模型有明顯的拮抗作用，且無不良反應；臨床研究表明，神經節苷脂能有效地控制癲癇患者的臨床癥狀，在治療各類型癲癇癥患者的總有效率為52.77％，且無不良反應。因此神經節苷脂治療癲癇癥有效、安全可作為新一代的抗癲癇藥物。
文檔編號A61K31/7032GK1413587SQ01131998
公開日2003年4月30日 申請日期2001年10月25日 優先權日2001年10月25日
發明者杜士明, 潘怡 申請人:杜士明