專利名稱：利用天然神經節苷脂或其衍生物來穩定并維持神經生長因子的生物學活性的制作方法
技術領域：
本發明涉及由蛋白質和神經節苷脂生成的新的，穩定而又具有生物學活性的絡合物，即由神經生長因子的β亞基(βNGF)和天然神經節苷脂或其半合成類似物，如羧酸酯和酰胺或其生物學上可接受的鹽生成的穩定而又具有生物學活性的絡合物;以及含有這種絡合物的藥物組合物，它的治療用途及其生產方法。
神經節苷脂，即含有唾液酸的糖鞘脂、通常存在哺乳動物的細胞膜中，還發現在神經組織中其濃度最高。在細胞膜外層神經節苷脂的定位表明，它們在細胞識別、生長和分化方面起著重要作用。已經知道，細胞表面的神經節苷脂和其他結合糖脂組分在分化期間和細胞成熟過程中會發生變化。在正常人的腦中，四種特殊的神經節苷脂，即GM1、GDla、GDlb和GTlb占所有神經節苷脂的近80-90%。
神經節苷脂由一個主要的、親水的唾液酸低聚糖基團和由一個在其氮原子上被脂肪酸酰化的鞘氨醇構成的、疏水的神經酰胺部分組成。
神經節苷脂在引起神經元的塑性變化方面起作用，它能在細胞培養物中促進軸突生長和中樞及外周神經系統的軸突生長。
越來越明顯，不僅神經系統的發育，而且神經系統的修復都是由作用于細胞表面的分子的胞外信號控制。
盡管對糖脂在神經元細胞表面上的表現和功能的詳細研究才剛剛開始，神經節苷脂已經表現出在調節神經元發育和修復方面起著突出的作用。在神經元發育過程中，大腦神經節苷脂的特性會發生顯著的量變和質變。
據報導，內服神經節苷脂能使得外周神經系統(PNS)在受損傷以后的神經再生和功能恢復變得容易(Ceccarell;B.etal.，Adv.Exp.Med.Biol.71∶275，Plenum Press，New York，1976;Gorio A.etal.Neuroscience 8∶417，1983)。另據報導，使用神經節苷脂，尤其是通常所說的GM1的單唾液神經節苷脂(根據Svennernolm命名法，J.Neurochemistry 10，613，1963)，能改善因損害中樞神經系統(CNS)而產生的后果(Toffano G.et al.，BrainReS.261∶163，1983;Cuello A.C.et al.，Dev.Brain Res.376∶373，1986)。很多近期研究表明，神經節苷脂可能在調節神經營養因子的體外活性方面具有調節功能。例如，已經有報導說外源神經節苷脂GM1能增強PC-12(它是受神經生長因子NGF刺激的細胞)中軸突的生長(Matta S.G.et al.，Dev.Brain Res.，27∶243，1986)，類似地，GM1能增強由NGF誘導的、起源于脊胚胎的神經節的神經元和由NGF誘導的交感神經節的神經突的生長(Skaper S.D.et al.，Imt.J.Dev.Neurosci.3∶187，1985;Skaper S.D.et al.，Dev.Brain Res.23∶19，1985)。
最近的評價GM1在體內影響NGF活性的可能性研究結果表明，神經營養因子NGF在中樞神經系統疾病之后維持細胞的成活方面也許起著主要作用(Cuello A.C.et al.，in∶A new intramembrane integrative mechanism62，Kjell Kuxe and L.Agnati Editors，1987)。有趣的是，有報導說用GM1治療，不僅能使得多巴胺能的和去甲腎上腺素能的神經元里的神經元細胞易于存活，而且能使得已知對NGF有反應的膽堿能的神經元里的神經元細胞易于存活。
在發育期間NGF對交感神經元和靶神經支配的必要性，構成了該生長因子對其靶細胞的主要營養作用的重要的證據。
已觀察到NGF含量與巨細胞膽堿能神經元分布之間的顯著相關性。在這些被觀察的已知靶-外周交感組織區域里的巨細胞膽堿能神經元的神經分布區和包含它們細胞體的區域，如海馬里都觀察到較高含量的NGF。基礎前腦膽堿系統的完整性和認識的功能之間的這種關系也存在于人類。早老性癡呆的主要神經病理學特征之一就是巨細胞膽堿能神經元的大量損失，盡管其它傳感系統也發生了各種形式的突變。因此，現在應該認真考慮NGF和機體病理學之間的可能聯系以及早老性癡呆的潛在的療法了。
通過重組DNA生物技術方法產生人類NGF的可能性，是實驗研究的基礎。至于治療結果，在實驗損害膽堿能系統以后觀察到的好處表明，通過外源供給和內源產生刺激都能顯著提高這些神經元的NGF的可用性。生物技術方法的發展，不斷生產出越來越多的有潛在治療作用的蛋白質及其肽。作為藥物使用，這些大分子存在著特殊而又復雜的問題。目前，系統地使用這些具有藥物學活性的肽的唯一方法是通過皮下、肌內或顱內注射，尤其是NGF。每天或每周需要注射幾次的治療方式有很多缺陷，包括病人不同意和令人不快的藥物代謝動力學，蛋白質替換療法尤其如此。
在本領域進行研究的目的之一是開發能提高蛋白質的穩定性而又不妨礙其生物學活性的化學方法。通過脂質體技術開發了多種生物學產品。然而，這些生物學產品存在著各種問題，如用來吸收蛋白質的化學物質的專一性較差，在體內同器官有特殊的相互作用，該絡合物由一批再生出另一批的能力較差，以及用來吸收蛋白質的化合物的未知的藥物代謝動力學。
一方面通過評價神經營養因子的問題和潛在的藥物學用途，另一方面評價神經節苷脂在體內的生物學活性，有可能制備出具有生物學活性的兩類化合物的合適絡合物，并能滿足上述專一性、穩定性和可選擇的生物可用性要求。這些特性能在體外和體內實驗模型中得到證實。
因此，本發明主要涉及由神經營養因子NGF的β亞基和天然的神經節苷脂或半合成的神經節苷脂類似物所形成的絡合物，它是通過在室溫和弱堿性條件下讓溶解在水溶液里的這兩種組份相互接觸而得到的。
附圖的簡單說明如下
圖1表示GM1-NGF(β亞基)絡合物在同親和純化的抗小鼠NGF(β亞基)免疫球蛋白反應之后的免疫吸印結果。
圖2表示GM1-βNGF絡合物在小鼠生命的第6天對由VNB誘導的心臟中NA下降的影響。
該絡合的兩種成份的重量比可以有很大的變化，不過，神經營養因子和神經節苷脂的比例最好在1∶100，000和1∶10之間。在該范圍內，最重要的絡合物是神經營養因子∶神經節苷脂的比例為1∶1000的那些絡合物。
根據本發明，所用的神經生長因子β亞基(βNGF)可以用已知方法從人或動物的組織中分離;例如，從哺乳動物或細胞培養基中，應當采用通過重組DNA技術獲得的人的βNGF最好采用從人的胎盤組織或牛的精液中獲取的制劑。
不過，βNGF也能通過分子生物學技術制備，例如，象EP-B-121，338所公開的重組DNA技術。
本發明的新的絡合物具有與βNGF相同的生物學活性，正如在體外對PC-12細胞系進行實驗所證實的。因此，可將其用于需要以βNGF為基礎的制劑進行治療的所有場合，例如，神經系統的老化。這種新絡合物還能用于治療藥物或預防藥物中，而神經節苷脂的特殊功效在新絡合物中被保持下來是很有用的。例如，在βNGF與神經節苷脂GM1的絡合物對抗GM1多克隆抗體的作用中所看到的免疫化學活性。
新的βNGF-神經節苷脂絡合物及其衍生物的生物學活性可以在實驗動物上得到證實，正如采用絡合物βNGF-GM1的實施例1中所講述的。
有用的半合成神經節苷類似物的例子是功能衍生物，如美國專利US 4，713，374中描述的唾液酸羧基酯或酰胺;美國專利US 4，593，091和歐洲專利EP-0072722中描述的內酯。美國專利US 4，713，374中描述的在唾液酸、糖類以及可能是神經酰胺羥基上過酰化的衍生物，也是功能衍生物。其它有用的半合成神經節苷脂類似物的例子是被稱為溶原神經節苷脂的物質，即在鞘氨醇氮上脫酰化的神經節苷脂和/或脫-N-乙酰神經節苷脂和脫-N-乙酰-溶原神經節苷脂，其中，神經氨酸殘基上的氮也是脫酰化的，還有具有超級脂肪酸如軟脂酸或硬脂酸，或由任何其他脂族酸、芳族酸、脂環族酸或雜環族酸衍生出的酰基，也可能被其他功能基團，尤其是極性基團取代的神經節苷脂衍生類似物。在其他的半合成類似物中，除了這里提到的“非自然”酰基以外，還可能有與神經氨酸氮原子上的乙酰基不同的酰基存在。
用于本發明絡合物中的半合成化合物及其功能衍生物，如酯、酰胺、內酯和過酰化衍生物是已知的和/或在美國專利US 4，593，091和US 4，713，374中公開的。
根據本發明，任何具有NANA基團，即N-乙酰神經氨酸的神經節苷脂都能與βNGF生成絡合物。
絡合物一詞是指神經節苷脂的NANA基團與NGF的β亞基之間的締合物。這種締合物是兩種化合物之間離子和氫相互作用的結果，這就是本發明的絡合物同神經節苷脂和βNGF簡單混合的區別。
作為制備新的絡合物的基礎的神經節苷脂最好是從前面所述包括大部分腦神經節苷脂，即GM1、GDla、GDlb、和GTlb以及上述功能衍生物和由它所產生的半合成類似物的神經節苷脂組中選擇的那些神經節苷脂。
根據本發明，神經節苷脂鹽也能被用于上述目的，例如，金屬鹽，象堿金屬和堿土金屬鹽或鋁和鎂鹽或者有機堿鹽，最好是治療上可以接受的含氮堿的鹽，例如氨基醇鹽，象乙醇胺鹽。
而且，根據本發明，有可能獲得由神經營養因子和神經節苷脂或它的上述衍生物的酸加成鹽，例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、甲磺酸鹽和酒石酸鹽生成的絡合物。
有關βNGF因子和神經節苷脂或它的衍生物生成的新絡合物的所有性質和用途也認為是上述鹽類引起的，因此，這也是本發明特殊的方面。
應當特別強調由下述神經節苷脂GM1的酯和酰胺衍生出來的那些絡合物由碳原子數最多為8個的醇類，象甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇和己醇，還有正己醇和正辛醇衍生出來的脂肪酸酯和由碳原子數最多為8個的胺類，象甲胺、乙胺、丙胺、己胺或辛胺衍生出來的脂族酰胺。
在神經節苷脂的羥基上過酰化的衍生物包括，但不限于乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、琥珀酸酯和丙二酸酯。
制備上述蛋白質和神經節苷脂或其衍生物或鹽的新絡合物的方法大體上包括在存在和不存在有機溶劑，如低級脂族醇、低級酮、低級二烷基胺或亞砜的條件下，使產生絡合物的兩種組分在水溶液里相互接觸;其他條件是在室溫或稍高于室溫的溫度，如50℃和弱堿性介質中，例如，在無機或有機堿類，象氨或低級脂族胺、堿或堿土金屬水合物或相關的碳酸鹽或乙酸鹽。在這些條件下，明顯形成可溶于水的神經節苷脂鹽，使得縮合反應容易進行。神經營養因子也能溶解于水溶液如堿性乙酸鹽水溶液中，或者它也能懸浮于神經節苷脂溶液里。
反應可以持續幾小時至幾天，但通常持續12至24小時。
蛋白質-神經節苷脂衍生出來的絡合物，可以通過已知方法，如實施例1中說明的方法，從反應混合物中分離，并能通過它的生物學活性和與該蛋白質專有的單克隆和多克隆抗體的免疫化學識別，或采用超離心沉降系統來進行鑒定。
本發明的另一個目的也是一種含有一種或一種以上NGF的β亞基和神經節苷脂的新絡合物、一種它的上述衍生物或半合成類似物或它的鹽，尤其是在上文詳細討論過的那些的絡合物作為有效成份的藥物組合物。這種藥物組合物可以口服、直腸使用、腸外使用或局部使用。因此，可將其做成固體或半固體形式，例如，丸劑、片劑、膠狀囊、膠囊、栓劑或軟膠囊。對于腸外施用，有可能采用可用于肌內或皮下注射、輸液、靜脈注射或大腦內注射的形式。結果，它們可以以活性化合物的溶液形式出現，或者以活性化合物的凍干粉末與藥物學上能接受的一種或一種以上適于上述用途而且其滲透性與生理液體相一致的賦形劑或稀釋劑混合形式出現。
至于局部使用，制劑是噴霧劑的形式，例如吸入噴霧劑、乳脂或局部使用的軟膏比較有用。
本發明的制劑可以對人或者動物使用。在溶液、噴霧劑、軟膏和乳脂中活性成分的含量最好在0.01%和10%之間，而在固體制劑中活性成分的含量在1%和100%之間，最好在5%和50%之間。使用的劑量取決于個體的需求、要求的效果和所選擇的用藥方式。
本發明還包括神經節苷脂或其衍生物與神經生長因子NGF的β亞基的所有絡合物對上述情形的治療用途。
人的日用藥量在0.01-100mg/kg體重之間變化。
人的日注射劑量(皮下、肌內或大腦內注射)在每公斤體重0.05-5mg活性物質的范圍內變化。
下面的實施例說明新絡合物如何制備，制備工藝，藥物制劑及其用途。
實施例1材料和方法按照Ageletti P.V.等在Natl.Acad.Sci.USA64，787，1969中所述的方法提純小鼠NGF(β亞基)。按照Skaper S.D.等在Exp.Neural，76∶655，1982中所述的方法，用從E8小雞脊根神經節(DRGE-8)“解離的”胚胎細胞進行體外研究。對抗小鼠NGF以抑制NGF(β亞基)的生物學活性而產生的抗體的研究，采用前文所述的體外模式來評價。
GM1、NGF(β亞基)和GM1-NGF(β亞基)絡合物的免疫活性通過免疫吸印技術來測定。
抗小鼠NGF(β亞基)的NGF多克隆抗體通過親和色譜法來提純，采用如K.Stoeckel等在J.Neurochem，26∶1207，1976中所述的與瓊脂糖4B(Sepharose 4B)結合的2.5S小鼠NGF。
抗單唾液酸神經節苷脂GM1的GM1多克隆抗體是通過將GM1固定在Sepharose 4B上的親和色譜法來提純的。
NGF(β亞基)和神經節苷脂絡合物的等密度沉降是按照Ulrich-Bott B.等在Journal of Lipid Research 25，1233，1984中所述的方法進行的。
將單唾液酸神經節苷脂GM1(例如5mg)溶解于CHCL3/MeOH(比例3∶1)中。溶劑在氮氣保護下蒸發。單唾液酸神經節苷脂被再懸浮于pH8.5的50mM NH4OH中1小時。濃度臂如為10mg/ml的單唾液酸神經節苷脂GM1和高度純化的小鼠NGF(β亞基)被溶解于pH5.0的50mM乙酸鈉中，并保溫，以獲得重量比為1∶1000的βNGF-GM1。該混合物在pH8.5在攪拌下保溫，例如，在室溫下過夜。在4℃條件下獲得同樣的結果。
通過陰離子交換色譜將生物學絡合物βNGF-GM1從未反應的βNGF中提純出來，例如，在分析用的單Q柱上，用pH8.5的50mM NH4OH平衡。該βNGF-GM1絡合物用在pH8.5的50mM NH4OH中梯度為0-1.0M的乙酸銨洗脫。流速為1ml/min。未反應的βNGF由外水體積洗脫。βNGF-GM絡合物在第15-18分時間范圍內被濃度為0.15-0.25M的乙酸銨洗脫。這些都是實驗條件，在這些條件下有12μg的NGF(β亞基)與1mg的單唾液酸神經節苷脂GM1結合。
βNGF-GM1絡合物的化學、免疫化學和生物學特性在體外評價如下a)提純的βNGF-GM1絡合物在免疫吸印技術中表現出保持其抗提純的由抗小鼠NGF(β亞基)而產生的多克隆抗體的免疫活性(圖1)。
b)提純的βNGF-GM1絡合物在DRG-E8上表現出生物學活性。
c)βNGF-GM1絡合物的生物學活性能被濃度為60μg/ml的經親和純化的多克隆抗體和濃度為500μg/ml的單克隆抗體抑制。沒有GM1的βNGF的生物學活性能被濃度為30μg/ml的經親和純化的多克隆抗體和濃度為100μg/ml的單克隆抗體抑制。
d)通過免疫吸印技術，與有生物學活性的βNGF-GM1絡合物相關的同一個帶表現出抗由抗NGF(β亞基)和抗單唾液酸神經節苷脂GM1而產生的多克隆抗體的反應性。
e)經DRG-E8評價的βNGF-GM1的生物學活性，在βNGF-GM1于低pH緩沖液中和在有二價離子(例如40mM CaCl2)存在條件下保溫之后仍被保持下來。
f)βNGF-GM1絡合物的穩定性在有人的血清存在時，在37℃下能維持96小時。
g)βNGF-GM1絡合物的生物學活性在經蛋白酶消化(例如2%(W/W)的胃蛋白酶，pH2.0，室溫，16小時)以后被保持。在相同條件下，蛋白酶能抑制沒有GM1的βNGF的活性。
h)在不同溫度條件下(例如4℃、37℃、45℃)保存之后，βNGF-GM1的生物學活性仍被保持。在相同保存條件下(指時間和蛋白質濃度)，沒有單唾液酸神經節苷脂GM1的βNGF完全喪失其生物學活性。
i)用等密度沉降試驗時，βNGF-GM1絡合物停留在密度為1.298g/cm3之處。
在與親和純化的抗小鼠NGF(β亞基)免疫球蛋白反應之后，GM1-NGF(β亞基)絡合物的免疫吸印結果如圖1所示。
A欄色譜分離之前的GM1-NGF絡合物。
B欄asialo GM1-βNGF絡合物。
C欄小鼠NGFβ亞基是二聚體狀態，GM1和βNGF按前述方法在室溫下保溫2小時。asialo GM1和NGF的保溫是在相同條件下進行。
βNGF-GM1絡合物在體內的生物學活性是在動物模型上試驗的，試驗中βNGF的生物學活性受到一種化合物的抑制。采用了兩種性別的新生Sprague-Dawley小鼠。所有系統注射都是用濃度為0.01ml/g體重的絡合物在皮下進行的。用鹽水制備硫酸長春花堿(VNB)溶液，在其生命的第3天，每只小鼠按0.15mg/kg體重的劑量用藥。用VNB處理過的小鼠再分成3組第1組接受鹽水溶液處理，第2組接受βNGF(例如，0.1mg/kg的βNGF)處理，第3組接受βNGF-GM1絡合物(例如，0.1mg/kg的βNGF和30mg/kg的單唾液酸神經節苷脂GM1)。這些動物在其生命的第6天被殺死，迅速取出心臟，在干冰中冰凍并于-80℃貯存備用。
測定心臟里去甲腎上腺素(NA)的含量。如圖2中所顯示的，使用VNB導致了心臟中NA含量的明顯下降(第1組)，并對沒有GM1的βNGF的使用(第2組)和βNGF-GM1絡合物的使用(第3組)有明顯的頡抗作用。
而且，這些結果表明，在體內βNGF-GM1對交感神經系統是有生物學活性的，其生物學活性比βNGF高。
實施例2采用與實施例1所述完全相同的方法，通過重組DNA技術獲得由單唾液酸神經節苷脂GM1和人的NGF(β亞基)生成的NGF-神經節苷脂絡合物。其體外和體內的特性與實施例1中所述相同。
實施例3由從頜下腺中提純的神經節苷脂GDla和βNGF生成的絡合物按照在實施例1中所述的實驗條件下制備。
在用DRG-E8試驗時，GDla-βNGF仍保持其生物學活性。該絡合物用等密度沉降試驗時停留在密度為1.3496g/cm3的地方。
實施例4由從頜下腺中提純的神經節苷脂GDlb和βNGF生成的絡合物按照在實施例1中所述的實驗條件下制備。
在用DRG-E8試驗時，GDlb-βNGF仍保持其生物學活性，該絡合物用等密度沉降試驗時停留在密度為1.3596g/cm3之處。
實施例5由從頜下腺中提純的GTlb和βNGF生成的絡合物是在實施例1中所述試驗條件下獲得的。
在用DRG-E8試驗時，GTlb-βNGF仍保持其生物學活性。絡合物用等密度沉降試驗時停留在密度為1.3700g/cm3的地方。
實施例6按照實施例1中所述試驗條件制備由GM1的內酯和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例7按照實施例1中所述的試驗條件制備由GM1的甲酯和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例8按照實施例1中所述的試驗條件制備由GM1的乙酯和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例9按照實施例1中所述的試驗條件制備由GM1的異丙基酯和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例10按照實施例1中所述的試驗條件制備由GM1的叔丁基酯和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例11按照實施例1中所述的試驗條件制備由GM1的芐基酯和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例12按照實施例1中所述的試驗條件制備由GM1的甲酰胺衍生物和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例13在實施例1中所述的試驗條件下制備由GM1的乙酰胺衍生物和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例14在實施例1中所述的試驗條件下制備由GM1的芐酰胺衍生物和NGF的β亞基生成的絡合物。
實施例15在實施例1中的試驗條件下制備由GM1的異丙基酰胺衍生物和NGF的β亞基生成的絡合物。
由各種神經節苷脂衍生物和神經生長因子的β亞基生成的所有絡合物，在用DRG-E8培養物試驗時都表現出生物學活性。
藥物制劑含有神經節苷脂-βNGF絡合物的藥物制劑的配制，包括制備對病人使用的藥物學上可接受的組合物的已知方法，而且，有可能將有效量的絡合物與藥物學上可接受的賦形劑混合。
適合的賦形劑和它的包括其他蛋白質的配方在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”一書(Remington′S Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA，1985)中有記載。這些賦形劑包括可以注射的“沉積配方”。
在此基礎上，該藥物組合物含有(但不排除其他可能)與一種或一種以上藥物學上可接受的賦形劑或稀釋劑相混合的GM1-βNGF絡合物溶液或GM1-βNGF絡合物的凍干的粉末，而且包含在一種PH適當，與生理體液等滲的緩沖介質中。含有GM1-βNGF絡合物的各種配方可以當作神經節苷脂衍生物-βNGF絡合物藥用制劑的實例，該制劑取決于需要的生物學活性和用藥方式。
表1是可以以溶液形式制備的用來治療神經系統的機能障礙的制劑實施例，只是作為說明性的例證，而不局限于此。如果是凍干的制劑，可以采用(但不排除其他可能)甘露糖醇或甘氨酸作為載體賦形劑，并提供需要體積的合適的緩沖液，以便得到適當的PH理想的等滲緩沖溶液。類似的溶液可以用于在需要體積的等滲溶液里的GM1-βNGF絡合物的藥物制劑，還包括(但不排除其他可能)使用由磷酸或檸檬酸以適當濃度緩沖的鹽水溶液，以便在任何時間都能得到理想PH的，例如中性的等滲藥物制劑。
為了說明，表2和表3給出了用于神經系統機能障礙治療的藥物制劑的實施例。
表3中系統4和系統5給出了配成兩瓶供一次使用的藥物制劑。第一瓶含有組合物重量大約0.01%-50%的活性物質和藥物學上可接受的賦形劑，如甘氨酸或甘露糖醇。第二瓶含有用適當體積的由磷酸或檸檬酸緩沖的鹽水溶液配制的溶液。兩只藥瓶里的內容物在使用前立即混合，并將凍干的活性物質迅速溶于其中，形成可以注射的溶液。表3中還列出了用于皮下注射的藥物制劑的可能的實施例(系統5)。
本發明絡合物可以通過與適當的藥物載體或稀釋劑混合制成藥物組合物，并能以常規的方法配制成用于口服或腸外使用的固體、半固體、液體或氣體狀態的制劑，如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、藥膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、氣霧劑。下述方法和賦形劑只是說明用的，而不受限制。
以吸入劑或氣霧劑為例，本發明的液體或細末狀態的絡合物由氣體或液體噴灑劑填滿氣霧劑罐，如有需要可采用常規的添加劑，如增濕劑。還可將其作為無壓縮的藥物制劑用于噴霧器或霧化器中。
藥物制劑還包括，但不僅限于此，腸道使用的具有親脂的賦形劑的栓劑，例如水溶性自乳化賦形劑，如糖膠或者類似的物質。在這些制劑中，GM1-βNGF絡合物的含量在賦形劑總重量的0.001%-1%的范圍內變化。該栓劑另外還可以含有適量的乙酰水揚酸鹽。
表4僅是出于說明的目的列出了用于神經系統機能障礙治療的栓劑形式的制劑。
GM1-βNGF絡合物的藥物制劑的劑量和使用次數取決于要求的效果(由臨床試驗決定)和使用方式，例如，劑量和使用次數可以與通常用于研究的其它神經營養劑類似。
表1.可注射溶液的藥物實施例制劑1.一支2ml安瓿含有GM1-βNGF絡合物 2mg單唾液酸神經節苷脂GM11ug(8.000BU)βNGF氯化鈉 16mgPH7的檸檬酸的 2ml蒸餾水緩沖液制劑2.一支2ml安瓿含有GM1-βNGF絡合物 5mg單唾液酸神經節苷脂GM110μg(8.000BU)βNGF氯化鈉 16mgPH7的檸檬酸的 2ml蒸餾水緩沖液生物學單位(BU)是由Fenton，E.L.在Expl Cell Res.59∶383，1970的文章中定義的。
表2.藥物組合物系統的實施例系統1.
a)一支2ml藥瓶含有凍干的活性物質 1.5mg單唾液酸神經節苷脂GM14μg(32.000BU)βNGF甘氨酸 30mgb)一支2ml溶劑瓶含有氯化鈉 16mg
檸檬酸的 2ml蒸餾水緩沖液系統2a)一支2ml的安瓿含有凍干的活性物質 1.5mg單唾液酸神經節苷脂GM14μg(32.000BU)βNGF甘露糖醇 40mgb)一支2ml溶劑瓶含有氯化鈉 16mg檸檬酸的蒸餾 2ml水緩沖液系統3a)一支3ml安瓿含有凍干的活性物質 3mg單唾液酸神經節苷脂GM110μg(80.000BU)βNGF甘氨酸 45mgb)一支3ml溶劑瓶含有氯化鈉 24mg檸檬酸的蒸餾 3ml水緩沖液表3.藥物組合物系統的實施例系統4.
a)一支3ml藥瓶含有凍干的活性物質 3mg單唾液酸神經節苷脂GM1
10μg(80.000BU)βNGF甘露糖醇 60mgb)一支3ml溶劑瓶含有氯化鈉 24mg檸檬酸的蒸餾 3mg水緩沖液系統5(肌內注射實施例)a)一支2ml安瓿含有凍干的活性物質 1.5mg單唾液酸神經節苷脂GM15μg(40.000BU)βNGF甘氨酸 30mgb)一支2ml溶劑瓶含有氯化鈉 16mg檸檬酸的蒸餾 2ml水緩沖液表4.直腸里使用的栓劑形式藥物組合物的實施例制劑1.
GM1-βNGF絡合物 3mg單唾液酸神經節苷脂GM110μg(80.000BU)βNGF可可油 2.5gr制劑2.
GM1-βNGF絡合物 3mg單唾液酸神經節苷脂GM110μg(80.000BU)βNGF聚乙二醇1540 1.75gr
聚乙二醇6000 0.75g制劑3.
GM1-βNGF絡合物 3mg單唾液酸神經節苷脂GM110μg(80.000BU)βNGF吐溫61 2.125gr羊毛脂 0.25gr制劑4GM1-βNGF絡合物 3mg單唾液酸神經節苷脂GM110μg(80.000BU)βNGF甘油 1.5gr水 0.75gr明膠 0.25gr很顯然，上述本發明中的這些方法能以各種方式進行改進。這些改進，不能認為是背離本發明的精神和范圍的，對于本領域技術人員來說是顯而易見的任何改進都落在本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種絡合物，它主要由NGF的β亞基和從由天然的神經節苷脂或上述天然神經節苷脂半合成的類似物或由它產生的生理學上可接受的鹽組成的組中選擇的神經節苷脂生成的。
2.如權利要求1所述的絡合物，其特征在于上述βNGF因子和神經節苷脂的重量比在1∶100，000和1∶10之間。
3.如權利要求2所述的絡合物，其特征在于上述βNGF與神經節苷脂的重量比大約為1∶1000。
4.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是從由GM1、GDla、GDlb和GTlb組成的一組物質中選擇出來的一種天然的神經節苷脂。
5.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是一種溶原神經節苷脂。
6.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是一種脫N-乙酰-神經節苷脂或一種脫N-乙酰-溶原神經節苷脂。
7.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂具有一個鞘氨醇酰基，其中上述酰基是由除天然神經節苷脂中存在的酸以外的酸衍生的，這種酸是從由脂族酸、芳族酸、脂環族酸和雜環族酸組成的組中選擇的，并可被至少一個功能基團任意取代。
8.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是一種具有一個酰基的神經節苷脂衍生物，該酰基是由除天然神經節苷脂中存在的酸以外的酸衍生的，這種酸是從由脂族酸、芳族酸、脂環族酸或雜環族酸組成的組中選擇的，并可被至少一個功能基團任意取代。
9.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是一種既具有鞘氨醇基團又具有神經氨酸酰胺基團的神經節苷脂衍生物，其中一個或二個上述基團被除天然神經節苷脂中存在的酸以外的酸酰化，其中上述酸是從由脂族酸、芳族酸、脂環族酸和雜環族酸組成的組中選擇的，并可被至少一個功能基團任意取代。
10.如權利要求1-3中任何一個所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂的半合成類似物是從由GM1、GDla、GDlb和GTlb的半合成類似物組成的組中選擇的。
11.如權利要求1所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是神經節苷脂GM1的脂族酯，該脂族酯最多具有8個碳原子。
12.如權利要求1所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是GM1的脂族酰胺，該脂族酰胺最多具有8個碳原子。
13.如權利要求1所述的絡合物，其特征在于上述神經節苷脂是神經節苷脂GM1的過乙酰化物、過丙酰化物、過丁酰化物、過戊酰化物、過琥珀酰化物或過丙二酰化物。
14.如權利要求1-13中任何一個所述的絡合物，它是βNGF-GM1的絡合物。
15.如權利要求1-13中任何一個所述的絡合物，它是βNGF-GDla絡合物。
16.如權利要求1-13中任何一個所述的絡合物，它是βNGF-GDlb絡合物。
17.如權利要求1-13中任何一個所述的絡合物，它是βNGF-GTlb絡合物。
18.如權利要求1-13中任何一個所述的絡合物，它是βNGF-GM1內酯絡合物。
19.一種制備如權利要求1中所述絡合物的方法，包括在室溫或略高于室溫和堿性條件下讓NGF的β亞基與神經節苷脂在有或沒有其它有機溶劑的水溶液中接觸，并收集所述絡合物。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于上述有機溶劑是低級二烷基酰胺或二乙基亞砜。
21.在治療應用中權利要求1-26中之一所述的由NGF神經營養因子的β亞基和天然的神經節苷脂或神經節苷脂的半合成類似物生成的絡合物。
22.一種藥物組合物它包括有效量的由NGF的β亞基和天然的神經節苷脂或神經節苷脂的半合成類似物或它的生理學上可接受的鹽生成的絡合物和藥物學上可接受的載體。
23.如權利要求1-22中的一個所述的由NGF神經營養因子的β亞基和神經節苷脂生成的絡合物的治療用途。
24.如權利要求1所述的由NGF神經營養因子的β亞基和神經節苷脂生成的絡合物用于神經病理學治療的治療用途，包括根據治療需要給病人使用有效量的上述絡合物。
25.如權利要求24所述的由神經營養因子NGF的β亞基和神經節苷脂生成的絡合物用于治療神經系統老化。
26.如權利要求24所述的由NGF神經營養因子的β亞基和神經節苷脂生成的絡合物用于治療困擾神經系統的慢性神經衰退疾病或慢性免疫性疾病。
27.如權利要求24所述的由神經營養因子NGF的β亞基和神經節苷脂生成的絡合物用于制備治療神經病理學疾病用的藥物組合物。
28.如權利要求27所述的由NGF神經營養因子的β亞基和神經節苷脂生成的絡合物用于由神經系統的老化引起的神經病理學病變或困擾神經系統的慢性神經衰退疾病或慢性免疫學疾病的治療。
29.一種由NGF的β亞基和天然的神經節苷脂或上述天然神經節苷脂的半合成類似物或它的生理學上可接受的鹽生成的絡合物。
全文摘要
本發明涉及由蛋白質和神經節苷脂生成的新的，穩定的，并且具有生物學活性的絡合物，即由神經生長因子的β亞基(βNGF)和天然的神經節苷脂或它的半合成類似物，如羧酸酯和酰胺生成的穩定而又具有生物學活性的絡合物，以及含有這種絡合物的藥物組合物，它的治療用途和生產方法。
文檔編號A61P25/28GK1052868SQ90110048
公開日1991年7月10日 申請日期1990年11月14日 優先權日1989年11月14日
發明者弗朗切斯科·德拉·瓦萊, 蘭弗蘭科·卡列加羅, 奧雷利奧·羅密歐, 阿爾貝特·萊昂 申請人:菲迪安股份公司