天花粉蛋白突變體的制作方法

專利名稱：天花粉蛋白突變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及天花粉蛋白突變體(Mutant Trichosanthin，MTCS)，其制備方法，及其用途。
本發明的目的在于克服天花粉蛋白的副作用，提供免疫原性低、能反復安全使用的新天花粉蛋白產品。
本發明還涉及編碼本發明天花粉蛋白突變體的核酸。
本發明還涉及含有本發明核酸的載體、特別是表達載體，以及用本發明的核酸或本發明的載體轉化的宿主細胞。
本發明還涉及制備本發明天花粉蛋白突變體的方法，包括在有利于所述天花粉蛋白突變體表達的條件下培養本發明的宿主細胞，及從培養物中回收所述天花粉蛋白突變體。
本發明還涉及含有本發明天花粉蛋白突變體和藥物可接受載體或賦型劑的藥物組合物。
本發明還涉及作為藥物的本發明的天花粉蛋白突變體。
本發明還涉及本發明天花粉蛋白突變體在制備治療病毒性疾病、治療腫瘤、治療宮外孕和/或引產的藥物中的應用。
最后，本發明涉及一種在哺乳動物中引產、治療宮外孕、治療病毒性疾病和/或治療腫瘤的方法，包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的本發明的天花粉蛋白突變體。
發明詳述經大量的研究，本發明人發現天花粉蛋白中免疫活性相關區域在結構上位于第174位到180位、203位到226位、230位到244位氨基酸殘基內。通過修飾這三個區域中的至少一個氨基酸殘基可以得到具有優秀性能的新的天花粉蛋白突變體。它顯著地降低了天花粉蛋白的過敏原性，但基本保留了天花粉蛋白的生物學活性。本發明的天花粉蛋白突變體至少保留核糖體失活和引產兩種活性，優選保留天然天花粉蛋白的全部生物活性，包括抗腫瘤和抗病毒等活性。
因此，本發明提供了一種低免疫原性天花粉蛋白突變體，其中在天花粉蛋白的以下三個氨基酸序列區域中至少一個氨基酸殘基被修飾氨基酸殘基第174位到180位、203位到226位、230位到244位。
在本申請說明書和權利要求中，氨基酸殘基的位置編號參照

圖1中的殘基編號。
本發明的天花粉蛋白突變體可以是一個全長的成熟蛋白，或其包含至少一個本發明中定義的氨基酸殘基修飾的片段或衍生物。
在本申請中，所述氨基酸殘基的“修飾”指氨基酸殘基的缺失、插入、添加、置換或化學修飾。氨基酸殘基的修飾優選能引起在被修飾的氨基酸位點的電荷改變。術語氨基酸殘基的“置換”優選指用疏水性氨基酸殘基置換親水性氨基酸殘基、用親水性氨基酸殘基置換疏水性氨基酸殘基、用堿性氨基酸殘基置換酸性氨基酸殘基，或用酸性氨基酸殘基置換堿性氨基酸殘基。
本發明中所用術語“親水性氨基酸”特別是指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、和組氨酸(His)。其中，Asp、Asn、Glu、Gln為酸性氨基酸，Lys、Arg、His為堿性氨基酸。術語“疏水性氨基酸”特別是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。
在本發明的一個優選實施方案中，天花粉蛋白突變體在174-180區域中含有至少一個選自表1中的氨基酸殘基修飾。
表1
在本發明的另一個選優實施方案中，天花粉蛋白突變體在203-226區域中含有至少一個選自表2中的氨基酸殘基修飾
表2
在另一優選實施方案中，天花粉蛋白突變體在230-244區域中含有至少一個選自表3中的氨基酸殘基修飾表3
優選地，本發明的天花粉蛋白突變體在所述174-180，203-226和230-244三個區域中的2個或3個區域中都含有氨基酸殘基的修飾。在這種情況下，更優選每個區域中的氨基酸殘基的修飾分別選自表1、2和3中所列出的那些。
在一個優選的實施方案中，本發明的天花粉蛋白突變體含有如下2個氨基酸殘基的修飾第177位的Lys被Glu置換，以及第203位的Ser被Gly置換。
在另一個特別優選的實施方案中，本發明的天花粉蛋白突變體含有如下所有3個氨基酸殘基的修飾第177位的Lys被Glu置換，以及第203位的Ser被Gly置換，以及第236位的Asn被Gly置換。
本發明還涉及編碼本發明天花粉蛋白突變體的核酸。
本發明的天花粉蛋白突變體可以按本領域技術人員已知的基因工程或肽合成方法制備，例如固相肽合成(Merrifield J，J.Am.Chem.Soc.852149-2154.1963)。優選通過對天然天花粉蛋白基因的改造和在適當生物宿主中表達上述改造好的基因來制備。
本發明編碼上述天花粉蛋白突變體的核酸可以克隆在適當的載體中，特別是表達載體如質粒載體pET-2d或pET-3a。
本發明的核酸或含有該核酸的載體可被用來轉化適當的宿主細胞，如大腸桿菌(E.Coli.)。這種轉化了的宿主細胞可用于培養生產本發明的天花粉蛋白突變體。本發明同樣涉及這種被轉化了的宿主細胞。
因此，本發明還涉及一種制備本發明天花粉蛋白突變體的方法，包括在有利于所述天花粉蛋白突變體表達的條件下培養本發明的宿主細胞，及從培養物中回收所述天花粉蛋白突變體。
天然天花粉蛋白的基因是從ATG(起始密碼子)到TAG(終止密碼子)共計870堿基對。本技術領域人員可根據已發表的序列信息，用常規的方法得到該基因。如從基因組DNA文庫(Chow TP，Feldman RA，Lovett M，Piatak M，et al.，Isolation and DNA Sequence of a GeneEncoding Alpha-trichosanthin，a Type I Ribosome-inactivating Protein，J.Biol.Chem.265(15)8670-8674，1990)或cDNA文庫篩取(Shaw PC，Yung MH，Zhu RH，Ho WK，Ng TB，Yeung HW，et al.，Cloning ofTrichosanthin cDNA and its Expression in Escherichia Coli，Gene，97(2)267-72，1991)，或利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法吊取(聶慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及結構分析，第四次中國基因結構、克隆與表達學術討論會，海口，A-32，1991)，也可以利用化學方法合成。該基因編碼了一個由289個氨基酸殘基組成的前體蛋白。它除了編碼成熟的247氨基酸殘基的天花粉蛋白外，前體蛋白在N端前還包含一個23肽的信號肽，在C端后還包含一個19肽的尾肽。方便地，可以利用已發表的方法(Sambrook J，et al.，Molecular Cloning，A laboratoryManual(Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1982)克隆編碼天然天花粉蛋白前體蛋白的cDNA，或者直接使用含有該cDNA的質粒。
利用本技術領域人員均已知的DNA定點突變方法，可對天然天花粉蛋白基因進行修飾。在一個具體實施方案中，所述修飾包括a)必要時在編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前和3’端后分別引進適當的限制性內切酶位點，引入起始密碼子和終止密碼子。例如在編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端引入NcoI位點(CCATGG)，從而引進了起始密碼子ATG，同時在成熟天然天花粉蛋白的第-1位加了一個甲硫氨酸；或引進限制性內切酶NdeI位點(CATATG)，從而使成熟天然天花粉蛋白的第1位氨基酸殘基從天門冬氨酸改為甲硫氨酸。在編碼成熟天花粉蛋白的DNA序列的3’端后可引進限制性內切酶BamHI位點(GGATCC)，從而引進了終止密碼子；以及b)對編碼待突變部位氨基酸序列(在174-180、203-226、230-244區域的氨基酸殘基)的DNA序列進行修飾，以獲得編碼本發明天花粉蛋白突變體的基因。由于氨基酸遺傳編碼子的簡并性，對一個氨基酸位置的突變在基因水平上可以有多個方案。對特定部位的DNA序列的定點改造可以利用商業上可買到的試劑盒，例如Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，按廠家提供的說明來進行。
將定點突變得到的編碼天花粉蛋白突變體的DNA序列用適當的限制性內切酶如NcoI(或NdeI)和BamHI酶切，然后克隆進表達載體如質粒載體pET-2d(或pET-3a)。所得的突變表達載體用常規方法轉化合適的宿主細胞如大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。將轉化子在適當的培養基中培養，若需要在適當時加誘導劑如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導天花粉蛋白突變體表達。然后通過常規方法，包括宿主細胞裂解、對裂解液離心、柱層析分離純化等，從培養物中分離所表達的天花粉蛋白突變體。MTCS的活性實驗以下所列為本發明天花粉蛋白突變體的免疫反應能力及生物活性的測試方法和結果。
1.TCS缺失型突變體和TCS修飾型突變體的性質為了探索一級結構與生物學活性和免疫反應能力的關系，按表1至3中所示突變，從基因水平將天花粉蛋白進行改造，獲得了多個編碼天花粉蛋白C末端序列缺失(缺失型突變體)或多個氨基酸殘基被修飾(修飾型突變體)的基因。經大腸桿菌表達、純化后分別獲得了相應的多個缺失型突變體或修飾型突變體。天花粉蛋白及其突變體具有RNA N-糖苷酶活性，可使核糖體失活，從而阻斷細胞蛋白質的合成。對這些缺失型突變體和修飾型突變體的生物學活性和免疫反應能力進行檢測。根據這些檢測的結果，結合天花粉蛋白的空間結構信息，分析TCS活性區域的結構基礎。RIP活性依Pelhem和Jackson的方法進行(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67247-256，1976)。引產活性按發明人實驗室的常規方法進行(Nie HL，et al.，Position 120-123，a Potential Active Site of Trichosanthin，Life Sciences，62(6)491-500，1998)。體外免疫反應活性用競爭性ELISA方法檢測(He XH，et al.，Effects of Chemical Modification of Lysine and ArginineResidues of Trichosanthin on its Reactivity with IgE，Acta Biochemicaet Biophysica Sinica，26657-662，1994)。結果列于表4。
表4TCS缺失型突變體和TCS修飾型突變體的性質檢測


NTCS--天然天花粉蛋白LTCS--天花粉蛋白缺失型突變體MTCS--為天花粉蛋白修飾型突變體*RIP活性IC50(ng/ml)++≤50，50＜+≤500，500＜±≤5000，-＞5000**引產活性(％)++≥80，80＞+≥30，30＞±≥5，-＜5***體外免疫反應能力％++＞80，80≥+＞30，30≥±＞10，10≥-(a)＞5，-(b)≤5上述天花粉蛋白缺失型突變體和天花粉蛋白修飾型突變體的性質檢測結果表明對于天花粉蛋白缺失型突變體，當3個氨基酸殘基從C末端缺失時，它的體外與IgG和與IgE反應的能力如同天然天花粉蛋白一樣呈現強陽性。當缺失程度加大至5個氨基酸殘基時，免疫活性下降，但此時尚未觀察到對核糖體失活和引產活性的影響。直至缺失29個氨基酸殘基，它的生物學活性才出現下降。按本發明人以往所報道，天花粉蛋白的生物學活性中心位于位點110至174之間的區域(Ke YB，Chen JK，Nie HL，et al.，Structure-function Relationship ofTrichosanthin，Life Sciences，60(7)465-472，1997)。C末端序列的缺失引起的空間結構的變化對此活性區域同樣有影響。這種缺失序列越接近活性中心，生物學活性下降越大。現發現免疫反應區域較生物學活性區域結構排列接近羧基末端，因而它較易受到C末端序列缺失的影響。表4中修飾型突變體M7TCS(1-247)[位點174至180間的一個氨基酸殘基被突變]，M24TCS(1-247)[位點203至226間一個氨基酸殘基被突變]和M15TCS(1-247)[位點230至244間一個氨基酸殘基被突變]表現出弱的與IgG和IgE相關的體外免疫反應能力，但仍然保留著包括RIP和引產的強生物學活性。這個結果表明這三個被修飾的氨基酸序列區域(第180-174，226-203，244-230位)與免疫反應能力相關。在這些區域中任何結構改變均可導致免疫反應能力的下降。這些結構改變包括至少一個氨基酸殘基被缺失；相鄰兩個氨基酸殘基間插入至少一個氨基酸殘基；這些序列被加上至少一個氨基酸殘基；用疏水性氨基酸殘基置換至少一個親水性氨基酸殘基；用親水性氨基酸殘基置換至少一個疏水性氨基酸殘基；用堿性氨基酸殘基置換至少一個酸性氨基酸殘基；用酸性氨基酸殘基置換至少一個堿性氨基酸殘基；至少一個氨基酸殘基被接上其它化學基團；和/或包括插入至少一個氨基酸殘基的任何修飾，此修飾能引起被修飾氨基酸位點的電荷改變。修飾型突變體M31TCS(1-247)[位點174至180間的一個氨基酸殘基和位點203至226間的一個氨基酸殘基被突變]和M46TCS(1-247)[位點174至180間的一個氨基酸殘基，位點203至226間的一個氨基酸殘基和位點230至244間的一個氨基酸殘基被突變]兩種蛋白突變體免疫反應能力為陰性而仍然保留包括RIP和引產在內的強生物學活性。這是兩類性質優秀的天花粉蛋白突變體。極大地降低了天然天花粉蛋白的免疫原性，而無損生物學活性。其中M46TCS(1-247)的免疫原性比M31TCS(1-247)更低。
2.本發明天花粉蛋白突變體的性質按上文所述方法檢測本發明的MTCS(M177、203)(177位Lys被Glu置換，且203位Ser被Gly置換)的體外RIP活性、懷孕小白鼠中期引產活性、體外與IgG和IgE的反應能力。體外培養下對腫瘤細胞的毒性作用的檢測按本發明人實驗室的常規方法進行(Kong M，et al.，Studyon Trichosanthin Induced Apoptosis of Leukemia K562 Cells，ActaBiologiae Experimentalis Sinica，31(3)233-243，1998)。
a)天花粉蛋白突變體與天然天花粉蛋白的免疫與生物學活性的比較列于表5。
表5天花粉蛋白突變體與天然天花粉蛋白的免疫與生物學活性的比較

*詳見(c-iv)**詳見(c-iii)b)天花粉蛋白突變體對不同細胞株的毒性列于表6。
表6天花粉蛋白突變體對不同細胞株的毒性

*為人正常外周血淋巴細胞，從臨床采集。
天花粉蛋白突變體對K562、HL60、MLT、U937等白血病細胞株和Jar絨癌細胞株的半數致死濃度LC50低于30ug/ml。這些LC50≤30ug/ml的細胞株被視為最敏感的細胞株。天花粉蛋白突變體對B16、A431、B7-325、SPCA1、7404等癌細胞的LC50高于30ug/ml，這些細胞為中度敏感型細胞株。天花粉蛋白突變體對正常體細胞，如人外周血淋巴細胞和人羊膜細胞(Wish細胞)的LC50高于1000ug/ml以上，稱為非敏感型細胞株。這些數據清楚地表明在一定的劑量條件下，天花粉蛋白突變體對白血病細胞和其它種類的癌細胞有強烈的毒性，而不損傷正常體細胞。這結果與以往對天花粉蛋白的類似研究相符。
c)動物模型的研究c-i)抗腫瘤研究將人慢性髓細胞白血病的K562細胞接種至八周齡裸小鼠皮下，接種細胞數量為1×107細胞。接種10天后，可見接種細胞在50％動物中體內生長并形成實體腫瘤。選擇腫瘤生成鼠并隨機分為四組。三組動物給予不同劑量的天花粉蛋白突變體注射治療。另一組以生理鹽水注射作為對照。在治療劑量≤引產劑量(三組分別為15nm/Kg、45nm/Kg、75nm/Kg)條件下，每四天注射一次，以四次治療為限，均可見不同程度的抑瘤效應。各治療組的抑瘤率分別為(40±3)％、(71±2)％和(92±4)％。選用另一種T和B淋巴細胞雙缺陷的免疫嚴重陷動物SCID小鼠，研究天花粉蛋白突變體對K562細胞的毒性。選用九周齡SCID小鼠皮下接種1×107的K562細胞，100％的接種動物長出了實體腫瘤。在接種后第五天，隨機將小鼠分為四組，其中三組為治療組，另一組為生理鹽水對照組。治療組按高、中、低不同劑量進行天花粉蛋白突變體注射治療。高劑量組一次注射150nm/kg；中劑量組二次治療注射，每次75nm/kg，每周注射一次；低劑量組三次注射，每次37nm/kg，每四天注射一次。每組的總劑量均為150nm/kg。高、中、低三組抑瘤率分別為(43±6)％、(64±8)％、和(94±3)％。兩種動物模型的實驗結論是天花粉蛋白突變體在引產劑量條件下，便可見明顯的抑瘤效應。一半引產劑量四次注射便可見90％以上的抑瘤效果，即小劑量多次注射效果尤佳。
上述為人慢性髓細胞型白血病的細胞接種至兩種動物機體形成實體瘤后，天花粉蛋白突變體的治療效果均佳。在此兩種動物模型的基礎上，繼續用SCID小鼠建立了另一種與臨床表現更為接近的人慢性髓細胞型白血病的動物模型。接種K562細胞后小鼠體內生成液體瘤，并通過小鼠血液白血球數量和其它生化指標的變化得到反映。在三個治療組中，從小鼠尾靜脈注射3.75nm/kg、7.5nm/kg、和15nm/kg劑量的天花粉蛋白突變體，用以治療移植瘤模型小鼠。經三次注射后，三個治療組中小鼠白血球總數恢復至正常值的百分比分別為(25±6)％、(75±8)％和(94±3)％。這些數據表明MTCS治療液體瘤的劑量可小于實體瘤，而治療液體瘤的效果卻優于實體瘤。
c-ii)小白鼠急性毒性試驗按常規方法進行小鼠急性毒性試驗。選用八周齡F1小鼠(ICR/Balb-c)，每只動物一次注射天然天花粉蛋白或天花粉蛋白突變體，觀察動物7天，比較天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體的半致死劑量(LD50)。在同一劑量下，天然天花粉蛋白組相對天花粉蛋白突變體組可見較高的動物死亡率和較早的動物死亡時間。LD50(天然天花粉蛋白)＝18.4mg/Kg，LD50(天花粉蛋白突變體)＝27.5mg/Kg，天花粉蛋白突變體的急性毒性比天然天花粉蛋白幾乎下降了50％。
c-iii)豚鼠體內急性過敏試驗將天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體分別作豚鼠體內急性過敏試驗。致敏用量為一次皮內注射人引產劑量的4.5倍劑量，14天后對動物進行攻擊，攻擊劑量為一次靜脈注射人引產劑量的10倍。觀察動物在受過敏原攻擊后30分鐘內的過敏反應和死亡情況。天然天花粉蛋白組死亡動物數與試驗動物總數之比為12/14，大約86％。天花粉蛋白突變體組為3/15，大約20％。兩者相較差異顯著。即天花粉蛋白突變體引起的豚鼠體內急性過敏程度比天然天花粉蛋白顯著降低。
c-iv)大鼠被動皮膚過敏試驗按Ovary的方法(Ovary Z，et al.，PCA Reactions with MouseAntibodies in Mice and Rats，Inter Archs Allergy Appl Immun，4816-21，1975)，作大鼠被動皮膚過敏(Passive Cutaneous anaphylaxis，PCA)試驗。兩組小鼠分別用天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體致敏。14天后，分別得到抗天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體的小鼠抗血清。將兩種抗血清分別注入麻醉了的大鼠剃去毛的背部皮內，并分別用含天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體的1％伊文思藍注射入大鼠的靜脈進行攻擊。30分鐘后，處死動物，觀查大鼠背部皮膚藍斑形成情況，以藍斑直徑大于0.5cm者為PCA陽性反應。天然天花粉蛋白組的所有動物均顯陽性，天花粉蛋白突變體組的所有動物均顯陰性。天花粉蛋白突變體誘發大鼠體內IgE應答較天然天花粉蛋白銳減。
3.天花粉蛋白突變體抗腫瘤機理a)天花粉蛋白突變體誘導敏感細胞的凋亡如上文2a和2b所述，天花粉蛋白突變體對體外培養中的白血病細胞有極強的毒性，而無損正常細胞。以天花粉蛋白突變體對K562細胞的作用為例，經多種手段研究其機理。通過電子顯微鏡觀察可見用天花粉蛋白突變體治療后K562細胞發生了典型的凋亡形態學改變細胞變小，胞漿濃縮，內質網擴張，核仁消失，染色質凝聚濃縮為數個團塊，和形成有外膜包繞的凋亡小體。天花粉蛋白突變體治療組細胞還表現出DNA“階梯狀”條帶，這是凋亡的生化指標。以及利用流式細胞儀(FACS)檢測到的凋亡細胞出現的二倍體凋亡峰。這些結果表明天花粉蛋白突變體誘導了K562細胞的凋亡。
b)敏感細胞的細胞膜上存在著與天花粉蛋白突變體專一結合的部位用生物分子相互作用分析系統(Real-time BiomolecularInteraction Analysis，BIA)研究。天花粉蛋白突變體被固相化在傳感片上的葡聚糖基質中，形成一面微流細胞墻(Wall of Micro-flow Cell)。細胞膜抽提液控制地流經表面，反應所導致的任何表面濃度的變化被作為SPR(Surface Plasmon Resonance)信號測出，并以RU(ResonanceUnit)來衡量。不同種類的敏感細胞有100至300不等的RU變化，表明天花粉蛋白突變體與細胞膜蛋白結合甚強。而同樣測試的正常細胞如人子宮羊膜細胞則無明顯結合發生。
c)通過激光共聚焦掃描顯微鏡研究，觀察到天花粉蛋白突變體可以通過受體介導形式被內吞到K562細胞內。
d)在[35S]GTPγS的結合實驗里，天花粉蛋白突變體激活敏感細胞的G蛋白介導的信號轉導。不敏感細胞觀察不到此激活現象。
e)通過激光共聚焦掃描顯微鏡，觀察到天花粉蛋白突變體誘導敏感細胞細胞內鈣庫中游離鈣離子的釋放和濃度變化。
以上研究得出的結論為敏感細胞的細胞膜上存在著天花粉蛋白突變體的受體，能介導天花粉蛋白突變體進入細胞內，發揮致核糖體失活作用。同時，天花粉蛋白突變體還干擾了細胞的信號轉導。上述雙重作用導致了敏感細胞的凋亡。敏感細胞極大多數是腫瘤細胞，因而天花粉蛋白突變體治療腫瘤與細胞毒型和細胞抑制型的化療藥物使腫瘤和正常組織兩敗俱傷的殺傷機理完全不同。為天花粉蛋白突變體作為新抗腫瘤藥物的臨床應用提供了理論基礎。
如上所述，本發明的天花粉蛋白突變體與天然天花粉蛋白相比大大降低了免疫原性，而基本保留了天然天花粉蛋白的生物活性。低免疫原性使之可以被多次安全地使用，能更好地治療天然天花粉蛋白的適應癥。更具體地，這些適應癥包括但不局限于以下項目。
1.白血病和其它種類的實體腫瘤。由于天花粉蛋白突變體選擇性地進入靶細胞的機理，臨床上使用天花粉蛋白突變體只需少次數地小劑量給藥。在一定的劑量范圍內，天花粉蛋白突變體對腫瘤細胞有強烈毒性作用，而不損傷正常細胞，故不良反應極微。
2.病毒性疾病，特別是艾滋病。在艾滋病的治療上天花粉蛋白突變體較天然天花粉蛋白毒副反應低，對病人更安全。
3.宮外孕和中期引產。與天花粉蛋白作為引產藥物時每個個體一生中只能使用一次不同，因其低免疫原性，可以多次安全地使用天花粉蛋白突變體。
本發明的天花粉蛋白突變體可以與藥學上可接受的載體或賦型劑一起形成藥物組合物。相應地，本發明還提供了這樣的藥物組合物，其包括治療有效量的天花粉蛋白突變體和藥學上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體或賦型劑的實例包括但不局限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油及乙醇等或其組合。這樣的藥物組合物的劑型與所選擇的給藥方式相適應。
本發明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，包括一個或多個裝有一種或多種本發明的藥物組合物的成分的容器。根據本發明的天花粉蛋白突變體及其片段或其衍生物也可與其它的治療化合物組合使用。
根據本發明的藥物組合物可用多種方式，諸如口服、局部、靜脈內、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、皮下、鼻內或真皮內途徑，給藥于哺乳動物宿主，例如人類。這些藥物組合物用于治療或預防具體疾病或癥狀時，應按根據該疾病或癥狀的特性的有效劑量使用。本發明天花粉蛋白突變體的使用劑量可以參照天然天花粉蛋白的有效劑量確定。
以下實施例的目的是舉例說明，但無意限制本發明。
本領域的技術人員可按照常規的方法，方便地獲得天然天花粉蛋白基因。例如以天然天花粉蛋白為探針，從植物栝蔞的cDNA庫中篩選(Shaw PC，Yung MH，Zhu RH，Ho WK，Ng TB，Yeung HW，et al.，Cloning of Trichosanthin cDNA and its Expression in Escherichia Coli，Gene，97(2)267-72，1991)；又例如設計合適的DNA探針，從植物栝蔞的基因文庫中篩選(Chow TP，Feldman RA，Lovett M，Piatak M，etal.，Isolation and DNA Sequence of a Gene EncodingAlpha-trichosanthin，a Type I Ribosome-inactivating Protein，J.Biol.Chem.265(15)8670-8674，1990)；再例如設計合適的DNA引物，利用PCR方法吊取(聶慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及結構分析，第四次中國基因結構、克隆與表達學術討論會，海口，A-32，1991)。
利用突變引物1和2對天花粉蛋白包含信號肽和尾肽的前體蛋白的cDNA(序列見圖1)進行定點突變，使得編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前引入起始密碼子，并在3’端后引進終止密碼子。然后編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA被克隆進一個表達載體。為本實驗設計了兩個引物。
引物1 5’GTG CAG GCC ATG GAT GTT AGG 3’(SEQ IDNO.3)引物2 5’AAC AAT ATG GCA TAG GAT CCC ATG GAT GAC3’(SEQ ID NO.4)引物1的特點是含限制性內切酶NcoI位點(CCATGG)，同時引進起始密碼子(ATG)，并在成熟天然天花粉蛋白的-1位加了一個Met。
引物2的特點是含限制性內切酶BamHI位點(GGATCC)，結果在編碼成熟天然天花粉蛋白的3’端后引進終止密碼子(TAG)。
選用Bio-Rad公司提供的利用噬菌粒進行的體外突變藥盒(Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，目錄號170-3576)，按藥盒中所附的說明進行操作。通過DNA序列分析驗證所獲突變。詳見該藥盒廠家說明。
簡言之，該方法包括以下步驟。
含Uracil的模板DNA的抽提編碼天花粉前體蛋白的原始基因先被克隆進噬菌粒載體pTZ-19U，得到模板DNA pTZ-19U-TCS′(聶慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及結構分析，第四次中國基因結構、克隆與表達學術討論會，海口，A-32，1991)。在含氯霉素培養液里生長的大腸桿菌CJ236用pTZ-19U-TCS′轉化，然后鋪在含青霉素的平板上挑選單菌落。含噬菌粒的轉化子在含青霉素的50ml培養液培養至O.D.600為0.3左右。接著加入M13K07輔助噬菌體(Halper Phage)1×1010pfu(噬斑形成單位)后，在37℃振蕩培養1小時，再加入卡那霉素3.5mg。繼續培養4-6小時后離心，上清液中加入100ug Rnase并保溫30分鐘，在冰浴中用醋酸銨/PEG沉淀30分鐘后離心。沉淀用高鹽緩沖液200ul再懸浮一次，冰浴中放置30分鐘后再次離心。取含Uracil的模板DNA的上清液，先后用酚、酚/氯仿、氯仿抽提。最后該含Uracil的模板DNA用醋酸銨/乙醇在-70℃沉淀，用70％乙醇洗沉淀，并溶解于10-20ul的TE緩沖液。
突變鏈的合成上述含Uracil的模板DNA與0.1到0.3pmol突變引物、退火緩沖液和水混合，混合物先加熱至70℃，在40分鐘時間內緩緩冷卻到30℃。如此冷卻后的混合物放入冰浴中，加入3單位的T4 DNA連接酶和1單位的T4 DNA聚合酶。該合成混合物在冰浴中放置5分鐘，然后在25℃放置5分鐘，最后在37℃放置90分鐘。加入90ul終止緩沖液終止合成反應。用該經突變后的DNA產物轉化用氯化鈣處理的感受態大腸桿菌MV1190。將轉化子鋪板于含青霉素的平板上，37℃培養過夜。挑選數個單菌落，分別抽提質粒，最后經DNA序列測定證實符合突變設計。在本實施例情況下該質粒為pTZ-19U-TCS，即其5’端含有NcoI位點，3’端含有BamHI位點的編碼成熟天花粉蛋白的DNA序列。
用引物1和引物2突變后得到的質粒pTZ-19U-TCS可用于作為實施例2至6中的模板DNA。另一方面，質粒pTZ-19U-TCS接著經NcoI和BamHI在37℃雙酶解2小時，通過低熔點瓊脂醣凝膠電泳分離和回收長度約750bp的天花粉蛋白基因片段。然后該片段利用T4 DNA連接酶在4℃與事先同樣經NcoI和BamHI雙酶解的表達型質粒pET-2d連接過夜，得到可供表達用的pET-2d-TCS。
實施例2編碼MTCS(M177)的DNA的突變和克隆利用Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid in vitro MutagenesisKit進行突變。按廠家說明的步驟操作。使用實施1中得到的質粒pTZ-19U-TCS作為模板DNA。使用引物3進行定點突變。簡言之，用pTZ-19U-TCS轉化大腸桿菌CJ236。然后在輔助噬菌體存在下抽提出含Uracil的突變模板DNA。接著通過一系列的操作合成突變鏈。這些操作包括混合含Uracil的模板DNA和突變引物、加T4 DNA連接酶、加T4 DNA聚合酶等。如此突變了的DNA被用來轉化感受態大腸桿菌MV1190。最后挑選突變體克隆并經DNA序列測定證實突變位點，得到pTZ-19U-MTCS(M177)。
為本實驗設計了突變引物3。
引物3 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA 3’(SEQ ID NO.5)引物3的特點是將天然天花粉蛋白177位的Lys的密碼子置換成Glu的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的密碼子還可以用其它編碼Glu的堿基替代，如GAG。
如此取得的pTZ-19U-MTCS(M177)接著被NcoI和BamHI雙酶解，得到編碼MTCS(M177)的DNA片段。然后該片段與事先經NcoI和BamHI雙酶解后的質粒pET-2d連接，從而得到pET-2d-MTCS(M177)。
實施例3編碼MTCS(M203)的DNA的突變和克隆除根據實驗設計和使用了一個不同的引物4外，突變和克隆的操作步驟均按實施例2中所描述的方法進行，從而得到pET-2d-MTCS(M203)。
為本實驗設計了突變引物4。
引物4 5’ATT CAG ATA GCGGGTACT AAT AAT GGA 3’(SEQ ID NO.6)引物4的特點是將天然天花粉蛋白203位的Ser的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGC和GGG。即共有4種替代方式。
實施例4編碼MTCS(M236)的DNA的突變和克隆除根據實驗設計和使用了一個不同的引物5外，突變和克隆的操作步驟均按實施例2中所描述的方法進行，從而得到pET-2d-MTCS(M236)。
為本實驗設計了突變引物5。
引物5 5’GTT GTA ACC TCCGGCATC GCG TTG CTG3’(SEQ ID NO.7)引物5的特點是將天然天花粉蛋白236位的Asn的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGG和GGT。
實施例5編碼MTCS(M177，203)的DNA的突變和克隆除根據實驗設計和使用了兩個不同的引物3和4外，突變和克隆的操作步驟均按實施例2中所描述的方法進行，從而得到pET-2d-MTCS(M177，203)。
引物3 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA 3’(SEQ ID NO.5)引物4 5’ATT CAG ATA GCGGGTACT AAT AAT GGA 3’(SEQ ID NO.6)引物3的特點是將天然天花粉蛋白177位的Lys的密碼子置換成Glu的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的密碼子還可以用其它編碼Glu的堿基替代，如GAG。
引物4的特點是將天然天花粉蛋白203位的Ser的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGC和GGG。
實施例6編碼MTCS(M177，203，236)的DNA的突變和克隆除根據實驗設計和使用了三個不同的引物3、4和5外，突變和克隆的操作步驟均按實施例2中所描述的方法進行，從而得到pET-2d-MTCS(M177，203，236)。
引物3 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA3’(SEQ ID NO.5)引物4 5’ATT CAG ATA GCGGGTACT AAT AAT GGA3’(SEQ ID NO.6)引物5 5’GTT GTA ACC TCCGGCATC GCG TTG CTG3’(SEQ ID NO.7)引物3的特點是將天然天花粉蛋白177位的Lys的密碼子置換成Glu的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的密碼子還可以用其它編碼Glu的堿基替代，如GAG。
引物4的特點是將天然天花粉蛋白203位的Ser的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGC和GGG。
引物5的特點是將天然天花粉蛋白236位的Asn的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGG和GGT。
實施例7天花粉蛋白的表達按常規操作步驟，用實施例1中所得含天花粉蛋白基因的質粒pET-2d-TCS轉化經氯化鈣處理過的感受態大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。簡言之，輕輕混合1-100ng pET-2d-TCS和100ul感受態細胞。經在冰浴中放置30-60分鐘，該混合物在42℃熱休克90秒后，再放回冰浴中。5分鐘后在該混合物中加入0.5ml的LB培養液，接著在37℃振蕩培養1小時。取1/10該培養后的混合物用0.1ml LB培養液稀釋后鋪在含青霉素和氯霉素的LB培養板上。這些板在37℃培養過夜，然后挑取大小形態均勻的單菌落。轉化子在37℃用含青霉素和氯霉素的LB培養液培養過夜后，再用含青霉素和氯霉素的M9ZB培養液在同樣溫度放大培養至A570＝0.8。加IPTG至終濃度為0.5mM，繼續培養3小時后離心收集菌體。菌體經超聲破碎后，離心取上清液加載于CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析。用含0.1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱，直至A280下降到基線，然后用0.1-0.4M線性梯度的NaCl洗脫液洗脫。其主峰即為表達的重組天花粉蛋白。重組天花粉蛋白的氨基酸序列在圖1中如氨基酸殘基1至247所示，在其-1位加上了一個Met。
實施例8MTCS(M177)的表達用實施例2中所得含有編碼MTCS(M177)的DNA的質粒pET-2d-MTCS(M177)轉化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。基因轉化、表達和蛋白純化按實施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M177)。MTCS(M177)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置換外，與實施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實施例9MTCS(M203)的表達用實施例3中所得含有編碼MTCS(M203)的DNA的質粒pET-2d-MTCS(M203)轉化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。基因轉化、表達和蛋白純化按實施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M203)。MTCS(M203)的氨基酸序列除了第203位Ser被Gly置換外，與實施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實施例10MTCS(M236)的表達用實施例4中所得含有編碼MTCS(M236)的DNA的質粒pET-2d-MTCS(M236)轉化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。基因轉化、表達和蛋白純化按實施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M236)。MTCS(M236)的氨基酸序列除了第236位Asn被Gly置換外，與實施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實施例11MTCS(M177，203)的表達用實施例5中所得含有編碼MTCS(M177，203)的DNA的質粒pET-2d-MTCS(M177，203)轉化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。基因轉化、表達和蛋白純化按實施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M177，203)。MTCS(M177，203)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置換，且第203位Ser被Gly置換外，與實施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實施例12MTCS(M177，203，236)的表達用實施例6中所得含有編碼MTCS(M177，203，236)的DNA的質粒pET-2d-MTCS(M177，203，236)轉化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。基因轉化、表達和蛋白純化按實施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M177，203，236)。MTCS(M177，203，236)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置換、第203位Ser被Gly置換，且第236位Asn被Gly置換外，與實施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實施例13MTCS(M177)生物學活性和免疫反應能力的檢測RIP活性按Pelhem & Jackson方法測定(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67247-256，1976)。兔網織紅細胞裂解液為Promega產品。[3H]亮氨酸為New England Nuclear產品。引產活性測定按本發明人實驗室常規方法進行(Nie HL，et al.，Position 120-123，aPotential Active Site of Trichosanthin，Life Sciences，62(6)491-500，1998)，以懷孕11天的ICR小鼠為模型。動物背部注射75nmol/KgMTCS(M177)，48小時后處死。解剖記錄總胎鼠數及死亡胎鼠數(包括胎兒吸收點)，計算胎鼠死亡率。體外免疫反應能力用ELISA方法檢測。IgG抗體和單克隆抗體IgE為本發明人實驗室自行制備和純化(He XH，et al.，Acta Biochemia et Biophysica Sinica，26657-662，1994)。抗體用免疫親和層析柱純化。本實施例所有實驗均用天然天花粉蛋白作為陽性對照。結果列于表7。
表7MTCS(M177)生物學活性和免疫反應能力的檢測

*實施例13至17中的“+”、“-”等所代表的數值參見表4。
實施例14MTCS(M203)生物學活性和免疫反應能力的檢測按實施例13同樣方法測定MTCS(M203)的RJP活性、引產活性和體外免疫反應能力。各項實驗均用天然天花粉蛋白為陽性對照。結果列于表8。
表8MTCS(M203)生物學活性和免疫反應能力的檢測

實施例15MTCS(M236)生物學活性和免疫反應能力的檢測按實施例13同樣方法測定MTCS(M236)的RIP活性、引產活性和體外免疫反應能力。各項實驗均用天然天花粉蛋白為陽性對照。結果列于表9。
表9MTCS(M236)生物學活性和免疫反應能力的檢測

實施例16MTCS(M177，203)生物學活性和免疫反應能力的檢測按實施例13同樣方法測定MTCS(M177，203)的RIP活性、引產活性和體外免疫反應能力。各項實驗均用天然天花粉蛋白為陽性對照。結果列于表10。
表10MTCS(M177，203)生物學活性和免疫反應能力的檢測

實施例17MTCS(M177，203，236)生物學活性和免疫反應能力的檢測按實施例13同樣方法測定MTCS(M177，203，236)的RIP活性、引產活性和體外免疫反應能力。各項實驗均用天然天花粉蛋白為陽性對照。結果列于表11。
表11MTCS(M177，203，236)生物學活性和免疫反應能力的檢測

實施例18MTCS(M177)對K562細胞的毒性用MTT(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物細胞毒試驗測定MTCS(M177)對人慢性髓細胞型白血病K562細胞和正常人淋巴細胞的毒性。每種細胞，以在含有10％小牛血清的RPMI-1640培養液內培養的200000數量級細胞，于37℃、5％CO2條件下接種細胞。分別加入1、5、10、20、50、100ug/ml的MTCS(M177)進行培養。培養48小時后每孔加入25ulMTT(購自Sigma)(5mg/ml)終止反應，繼續培養2小時后每孔加入裂解緩沖液以裂解細胞。37℃放置過夜，用分光光度計測定培養板各孔A570值。經計算MTCS(M177)對K562的LC50＜30ug/ml。對正常人外周血淋巴細胞對MTCS(M177)不敏感，因為在MTCS(M177)的濃度高達1000ug/ml條件下，測不出LC50值。
實施例19MTCS(M203)對K562細胞的毒性用實施例18相同方法測定MTCS(M203)對人慢性髓細胞型白血病K562細胞和正常人淋巴細胞的毒性。經計算MTCS(M203)對K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細胞不敏感，因為在MTCS(M203)的濃度高達1000ug/ml條件下，測不出LC50值。
實施例20MTCS(M236)對K562細胞的毒性用實施例18相同方法測定MTCS(M236)對人慢性髓細胞型白血病K562細胞和正常人淋巴細胞的毒性。經計算MTCS(M236)對K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細胞不敏感，因為在MTCS(M236)的濃度高達1000ug/ml條件下，測不出LC50值。
實施例21MTCS(M177，203)對K562細胞的毒性用實施例18相同方法測定MTCS(M177，203)對人慢性髓細胞型白血病K562細胞和正常人淋巴細胞的毒性。經計算MTCS(M177，203)對K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細胞不敏感，因為在MTCS(M177，203)的濃度高達1000ug/ml條件下，測不出LC50值。
實施例22
MTCS(M177，203，236)對K562細胞的毒性用實施例18相同方法測定MTCS(M177，203，236)對人慢性髓細胞型白血病K562細胞和正常人淋巴細胞的毒性。經計算MTCS(M177，203，236)對K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細胞不敏感，因為在MTCS(M177，203，236)的濃度高達1000ug/ml條件下，測不出LC50值。
序列表序列表<110>北京翔天牧生物科技有限公司柯一保聶慧玲<120>天花粉蛋白突變體<130>US0158<150>CN00119553.0<151>2000-08-02<150>CN01103102.6<151>2001-01-18<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>289<212>PRT<213>栝樓<400>1Met Ile Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu1 5 10 15Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala20 25 30Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu35 40 45Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu50 55 60Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp65 70 75 80Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly85 90 95Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr100 105 110Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu115 120 125Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile130 135 140Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr145 150 155 160Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val165 170 175Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln180 185 190Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile195 200 205Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile210 215 220Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn225 230 235 240Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val245 250 255Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met260 265 270Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala275 280 285Leu<210>2<211>870<212>DNA<213>栝樓<400>2atgatcagat tcttagacct ctctttgcta attctcaccc tcttcctaac aactcctgct 60gtggagggcg atgttagctt ccgtttatca ggtgcaacaa gcagttccta tggagttttc120atttcaaatc tgagaaaagc tcttccaaat gaaaggaaac tgtacgatat ccctctgtta180cgttccagtc ttccaggttc tcaacgctac gcattgatcc atctcacaaa ttacgccgat240gaaaccattt cagtggccat agacgtaacg aacgtctata ttatgggata tcgcgctggc300gatacatcct attttttcaa cgaggcttct gcaacagaag ctgcaaaata tgtattcaaa360gacgctatgc gaaaagttac gcttccatat tctggcaatt acgaaaggct tcaaactgct420gcaggcaaaa taagggaaaa tattccgctt ggactccctg ctttggacag tgccattacc480actttgtttt actacaacgc caattctgct gcgtcggcac ttattgtact cattcagtcg540acgtctgagg ctgcgaggta taaatttatt gagcaacaaa ttgggaagcg tgttgacaaa600accttcctac caagtttagc aattataagt ttggaaaata gttggtctgc tctctccaag660caaattcaga tagcgagtac taataatgga cagtttgaaa gtcctgttgt gcttataaat720gctcaaaacc aacgagtcac gataaccaat gttgatgctg gagttgtaac ctccaacatc780gcgttgctgc tgaatagaaa caatatggca gccatggatg acgatgttcc tatgacacag840agctttggat gtggaagtta tgctatttag 870<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3gtgcaggcca tggatgttag g21<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4aacaatatgg cataggatcc catggatgac 30<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5aagcgtgttg acgaaacctt cctacca 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6attcagatag cgggtactaa taatgga 27<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7gttgtaacct ccggcatcgc gttgctg 2權利要求
1.一種低免疫原性的天花粉蛋白突變體，其含有天然天花粉蛋白的氨基酸序列，且在以下三個區域有至少一個氨基酸殘基的修飾氨基酸殘基第174位到180位，203位到226位，和230位到244位；或包含所述修飾并基本保留天花粉蛋白生物活性的所述天花粉蛋白突變體的片段或衍生物。
2.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述修飾是選自缺失、插入、添加、置換，和化學修飾。
3.根據權利要求2的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述置換選自用疏水性氨基酸殘基置換親水性氨基酸殘基、用親水性氨基酸殘基置換疏水性氨基酸殘基、用堿性氨基酸殘基置換酸性氨基酸殘基，和用酸性氨基酸殘基置換堿性氨基酸殘基。
4.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述修飾能引起被修飾氨基酸位點的電荷改變。
5.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自174位精氨酸、177位賴氨酸、222位精氨酸、和243位精氨酸的至少一個氨基酸殘基被相互獨立地用谷氨酸、門冬氨酸或甘氨酸置換。
6.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自176位門冬氨酸、205位門冬酰胺、206位門冬酰胺、208位谷氨酰胺、210位谷氨酸、217位門冬酰胺、219位谷氨酰胺、220位門冬酰胺、221位谷氨酰胺、236位門冬酰胺、242位門冬酰胺和244位門冬酰胺的至少一個氨基酸殘基被相互獨立地用賴氨酸或甘氨酸置換。
7.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自178位蘇氨酸、203位絲氨酸、204位蘇氨酸、211位絲氨酸、224位蘇氨酸、226位蘇氨酸、234位蘇氨酸，和235位絲氨酸的至少一個氨基酸殘基被相互獨立地用甘氨酸或丙氨酸置換。
8.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自175位纈氨酸、179位苯丙氨酸、180位亮氨酸、207位甘氨酸、209位苯丙氨酸、212位脯氨酸、213位纈氨酸、214位纈氨酸、215位纈氨酸、223位纈氨酸、216位異亮氨酸、225位異亮氨酸、218位丙氨酸、230位丙氨酸、238位丙氨酸、231位甘氨酸、232位纈氨酸、233位纈氨酸、237位異亮氨酸、239位亮氨酸、240位亮氨酸和241位亮氨酸的至少一個氨基酸殘基被相互獨立地缺失。
9.根據權利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述三個區域的二個或三個中的每一個區域中至少一個氨基酸殘基被修飾。
10.根據權利要求9的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中177位賴氨酸被谷氨酸置換，且203位絲氨酸被甘氨酸置換。
11.根據權利要求9的蛋白突變體或片段或衍生物，其中177位賴氨酸被谷氨酸置換，203位絲氨酸被甘氨酸置換，且236位谷氨酰胺被甘氨酸置換。
12.編碼權利要求1至11之任一項的蛋白突變體或其片段或其衍生物的核酸。
13.包含根據權利要求12的核酸的載體。
14.用根據權利要求12的核酸或根據權利要求13的載體轉化的宿主細胞。
15.一種制備權利要求1至11之任一項的蛋白突變體或其片段或其衍生物的方法，包括在有利于所述蛋白突變體表達的條件下培養根據權利要求14的宿主細胞，并從培養物中回收所述蛋白突變體。
16.包含權利要求1至11之任一項的蛋白突變體或其片段或其衍生物和制藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
17.作為藥物的根據權利要求1至11之任一項的蛋白突變體或其片段或其衍生物。
18.權利要求1至11之任一項的蛋白突變體或其片段或其衍生物在制備治療病毒性疾病、治療腫瘤、引產和/或治療宮外孕的藥物中的應用。
19.根據權利要求18的應用，其中所述藥物為用于引產的藥物。
20.根據權利要求18的應用，其中所述藥物為用于治療艾滋病的藥物。
21.根據權利要求18的應用，其中所述藥物為用于治療白血病的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種天花粉蛋白突變體(MTCS)產品及其制備方法。本發明的產品相比天然天花粉蛋白顯著地降低了過敏原性，而保留了天然天花粉蛋白的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、引產、及核糖體失活蛋白活性。根據本發明的天花粉蛋白突變體能用于作為高效低毒地治療腫瘤、艾滋病、宮外孕和中期引產等的藥物。其低免疫原性允許天花粉蛋白突變體安全多次使用。
文檔編號A61K38/16GK1468257SQ01816701
公開日2004年1月14日 申請日期2001年7月18日 優先權日2000年8月2日
發明者柯一保, 聶慧鈴 申請人:北京翔天牧生物科技有限公司