專利名稱：移植用組織等價物及其制造方法
技術領域：
本發明涉及移植用組織等價物及其制造方法，特別地涉及在體外培養的，含有移植對象細胞并在培養后可向生物體移植的三維結構的移植用組織等價物及其制造方法。
作為移植用組織等價物，已知在片狀或薄膜狀的載體上播種·培養細胞得到的二維等價物、或在立體的海綿狀(多孔體)的載體上培養細胞制得的三維等價物等。這種移植用組織等價物被制作成細胞的分布狀態比較均勻。即，在為了修復如軟骨損傷等立體損傷的三維組織等價物的構筑中，與二維組織等價物的構筑不同，播種細胞、進行組織培養以便使細胞也分布在組織等價物的厚度方向。
但是，對于三維組織等價物，在使細胞比較均勻地分布的狀態下形成組織是非常困難的。特別是在構筑具有一定厚度的大型組織等價物時，營養物大多不能充分擴散至內部。因此，制作這種細胞分布比較均勻的大型組織等價物時，需要長的培養期間，或以高的細胞密度播種細胞。
另一方面，由于組織等價物的硬度與細胞密度或產生基質密切相關，即使在使細胞達到均勻狀態來培養的情況，根據移植部位，存在細胞密度過高、組織等價物過硬的情況。這種過硬的組織等價物，柔軟性差、即使移植入生物體內與移植周圍部分的融合性也不充分、有可能脫落。反之，若細胞密度過低，由于在組織修復時消耗時間、而且向移植周圍部分的固定也消耗時間，因此在固定前的期間內有可能脫落。
本發明鑒于上述現有技術的問題，目的在于提供一種可制造比較大型的移植用組織等價物，可迅速進行移植后的向組織周圍部分的固定，抑制脫落的移植用組織等價物和這種移植用組織等價物的制造方法。
這樣的本發明的移植用組織等價物，由于在表面的至少一部分上具有移植對象細胞或細胞基質豐富的細胞層，移植時該細胞層與移植面接觸，移植后向組織周邊部分的親和性升高。而且，本發明的移植用組織等價物，由于在其內部具有比該細胞層更低的移植對象細胞或細胞基質濃度，且主要由細胞培養載體構成的載體層，因此可以賦予移植用組織等價物適當的柔軟性，能夠確保與移植周圍部分的融合性。由此，可獲得在移植用組織等價物總體中未均勻地分布移植對象細胞，對生物體的親和性良好、且與移植周圍部分的融合性優異的組織等價物。在移植用組織等價物在組織周圍部分固定后，細胞培養載體成為細胞增殖的基礎，在體內(生物體內)進行組織重建，移植部分被同種組織重建。
另外，本發明提供一種在體外培養的，含有移植對象細胞并且培養后可向生物體移植的三維結構的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于包括，在構筑上述三維結構的細胞培養載體上包埋移植對象細胞的包埋工序，和將可培養上述移植對象細胞的培養基供給包埋了上述移植對象細胞的細胞培養載體的供給工序，和在上述細胞培養載體的表面的上述移植對象細胞的增殖率比上述細胞載體內部高的條件下培養，并在該細胞培養載體的至少一部分表面上，上述移植對象細胞密度比上述細胞培養載體的內部更高，形成細胞密度不同的兩層的培養工序。
在這樣的本發明的移植用細胞等價物的制造方法中，由于在包埋了移植對象細胞的細胞培養載體的表面上移植對象細胞的增殖率升高的條件下培養、形成細胞密度不同的兩層，因此通過進行培養，可以分別在細胞培養載體的表面上形成移植對象細胞多的層、在內部形成移植對象細胞少的層。
進一步，本發明提供一種在體外培養的，含有移植對象細胞且培養后可向生物體移植的三維結構的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于包括，混合在培養基中可以維持立體結構的流動性載體和移植對象細胞的混合工序，和將通過上述混合工序得到的混合物播種在預先被載置的三維載體的至少一部分表面上的播種工序，和在上述流動性載體的至少一部分中、培養細胞達到實質上移植對象細胞成為密集狀態的培養工序。
這樣的本發明的移植用組織等價物的制造方法，由于在細胞培養載體表面的至少一部分播種移植對象細胞、形成細胞密度不同的兩層，因此可以容易地在細胞培養載體的表面側形成移植對象細胞豐富的層。
這種組織等價物10具有后述的由培養載體構成的三維結構。組織等價物10的大小雖然根據移植場所的大小而有所不同，但是一般地具有1～10mm的厚度、優選為2～5mm。
組織等價物10具備內側的載體部分12和表面側的細胞層14。
載體部分12雖然由構建組織等價物10的三維結構的培養載體、和在移植組織中適合的移植細胞構成，但是主要由培養載體構成，移植細胞的分布比后述細胞層14少。
培養載體還具有適合移植細胞培養的組成，因此，在培養載體中可以成長·增殖移植細胞。作為這種培養載體，雖然可以使用具有適于在生物體內移植的組成的載體、但是優選為生物體吸收性材料或生物體親和性材料。特別地可以列舉，膠原、透明質酸、多聚輪烷(polyrotaxane)、明膠、纖連蛋白、肝素、甲殼質、殼聚糖、昆布氨酸、褐藻酸鈣、多聚輪烷水凝膠，它們可以單獨或者兩種或以上組合使用。
培養載體構筑組織等價物10的三維結構，決定組織等價物10總體的結構。這樣的培養載體的三維結構不僅提供移植細胞增殖的基礎，也提供與生物體相近的培養環境。因此，特別是在軟骨組織或骨組織的再生中使用的培養載體，雖然有必要顯示三維結構，但是只要是可以構筑三維結構，可以為任何形態的載體，特別優選為凝膠狀或海綿狀。
細胞層14連續地在載體部分12的外側，被配置在組織等價物10的大約整個周圍。細胞層14和載體部分12相同，雖然都是由培養載體和移植細胞或產生基質構成，但是比載體部分12含有更多的移植細胞。在細胞層14的移植細胞的細胞密度和載體部分12內部的細胞密度相比，只要是實質上密就可以，優選實質的密集狀態、即、密集相鄰的細胞之間是連續的。
若在組織等價物10的表面上形成移植細胞層，則細胞層14的厚度多厚都可以，但是優選為20～500μm、特別優選為100～200μm。若比20μm薄，由于不能充分發揮作為含有移植細胞的組織等價物10的功能，所以不優選。另外，比500μm厚的細胞層，考慮到作為移植物過硬的情況、或者由于培養時間被延長、制作時費時而沒有效率，所以不優選。
可在組織等價物10的細胞層14和載體部分12兩方面都存在的移植細胞是成為移植對象的細胞，可以根據組織等價物10的移植目的地進行適宜的選擇。在這種移植細胞中，雖然只要是可向生物體移植的細胞都可以，但是優選通過組織等價物10的三維結構能有效地增殖的細胞，可以列舉軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、肝細胞和它們的前體細胞。這些細胞可以單獨使用，或者根據成為移植目的地的生物體部位組合2種或以上使用。
這些移植細胞，可以根據細胞的種類用對應的公知的采集方法從生物體進行采集。雖然可以將采集的細胞原樣使用，但是根據情況，可以在適當的培養基中培養規定的時間后，包埋入培養載體中。
移植細胞在組織等價物10中，由于產生與移植適應性細胞的增殖或移植環境的適應性等相關的細胞基質，所以組織等價物10除了移植細胞外、也可以含有由細胞產生的細胞基質。該細胞基質的濃度由于和移植細胞的基質產生能力及細胞數相關，因此與載體部分12相比細胞層14中的濃度更高。細胞基質可以是由密集的移植細胞產生的，也可以是從外部添加的細胞基質。該移植細胞和細胞基質都是賦予組織等價物10向生物體的生著能力和組織等價物10的硬度的物質。
因此，由于組織等價物10在最外層具有含有豐富的移植細胞或移植細胞及細胞基質的細胞層14，向生物體的生著率高，而且即使經過很長時間也不脫落、可以原樣固定。在內側的載體部分12中，由于細胞數和細胞基質的量都比細胞層14少，組織等價物10的柔軟性與細胞數和細胞基質的量成比例地富有，因此從生物體適應性的觀點來看，可以將組織等價物10總體的硬度·柔軟性調整為良好的值。進一步，組織等價物10由于周圍具有細胞和細胞基質豐富的細胞層14，在移植后迅速被固定，固定后、被移植的組織等價物10作為基礎在體內(生物體內)可以良好地再生組織。
下面，對于組織等價物10的制造方法進行說明。
組織等價物10可以通過下述工序得到，該工序包括將上述移植細胞在培養載體中包埋的工序，和將培養基供給包埋后的培養載體的工序，和在培養基中培養的培養工序。
在包埋工序中，移植細胞和培養載體通過常規方法被混合(以下，指細胞-載體混合物)。此時，移植細胞的播種密度雖然依賴于預定的培養期間或培養載體的種類、培養基的組成，但是一般地，適合為1×104個/ml～1×108個/ml、優選為約2×104個/ml～2×107個/ml、進一步優選為約2×105個/ml～約2×106個/ml。另外，除非另有說明，播種密度表示在培養載體中包埋的狀態下的密度。在此范圍外高效率地形成細胞密度或基質密度高的細胞層14是困難的，而且，特別是若比此范圍的播種密度少，則由于增殖率不充分，到形成雙層結構為止的時間變長，所以不優選。
在供給工序中，可培養移植對象細胞的培養基被提供給在培養載體中包埋得到的細胞-載體混合物中。
在培養中使用的基礎培養基，優選為液體培養基，培養使用的中成為培養基基礎的基礎培養基中，可使用任何在移植細胞通常的培養中使用的公知的培養基。在這種培養基中，可以列舉例如杜爾貝科改良的伊格爾極限必需培養基(DMEM)等。培養基的供給，在液體培養基的情況下，如通常一般進行的，通過注入充分量的液體培養基以使具有三維結構的細胞-載體混合物總體成為液面下來進行。在培養載體中包埋得到的細胞-載體混合物原樣被載置在適當的培養器中后，將培養基供給該細胞-培養混合物。
培養工序是在包埋入載體的移植細胞的增殖率在載體的表面升高的條件下進行的。這樣的高增殖率條件通過移植細胞的細胞種類、播種密度、培養基的組成、相對于載體培養基的浸透能等、或它們的組合來進行選擇。
作為高增殖率條件的一例，可以列舉，對應于移植細胞種類選擇在基礎培養基中添加胎牛血清(FBS)等特定種類的血清、增殖因子等。例如，在兔軟骨細胞的情況下優選胎牛血清(FBS)。另外，通過適宜選擇在可迅速轉換為對數增殖期的播種密度、或該播種密度和對載體的浸透率高的培養基的組合可以實現高增殖率。
另外，在向作為高增殖率條件的基礎培養基中添加的物質中，可以列舉抗壞血酸。通過向基礎培養基中添加抗壞血酸，可以提高細胞的基質產生能力或增殖能力。其結果，與組織等價物10的內側相比，在多數培養基容易浸透的表面側，由于通過抗壞血酸的作用能產生很多的基質，因此可以形成比載體部分12的產生基質量多的細胞層14。
這里使用的抗壞血酸，若是通常該領域中使用的L型的話，只要是未失去生理活性，可以使用鹽、水合物等任何形態。可以列舉例如，L-抗壞血酸-2-磷酸、L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽、抗壞血酸-2-硫酸鈉鹽、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸(維生素C-2-葡糖苷)等穩定型的抗壞血酸。作為在基礎培養基中添加的抗壞血酸，在以L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物的形態添加時，可以10～300μg/ml、優選50～200μg/ml的量添加。
特別是在基礎培養基中添加的抗壞血酸，由于在液體中分解的性質，優選維持在冷凍保存的狀態下，被混合在基礎培養基中的狀態下冷凍保存，優選例如被保存在-5～-20℃下的抗壞血酸。
培養工序可以只在至少在細胞-載體混合物中細胞增殖，在組織等價物10的表面側和內側形成細胞數不同的雙層的期間內進行，優選到構成細胞層14的細胞成為在表面連續的大致密集的狀態為止。由于培養工序在高增殖率條件下進行，組織等價物10的細胞層14迅速形成。在組織等價物10的表面部分中，由于與培養基全面接觸，例如，通過選擇增殖率高的培養基，可以縮短培養期間。成為該狀態的時間根據播種密度和培養基的組成而不同，例如，在2×106個/ml的播種密度時，為2～3周。
組織等價物10的細胞層14配置在載體部分12的外側的幾乎全周上。為了獲得具有沿外周的細胞層14的組織等價物10，首先，在培養期間中，從培養器剝下組織等價物10。從培養器中剝下的組織等價物10由于飄浮在培養基中，因此在該狀態下通過繼續培養工序，沿培養基接觸的外周形成細胞層14。
因此，按照本發明，不考慮內部的細胞密度，可以高效地制造對生物體的生著率和固定良好的組織等價物10，即使可以得到的細胞數量少，也可以比較容易地提供大型三維結構的組織等價物。另外，組織等價物10中，由于不需要直到內部為止細胞均勻地分布，與均勻分布的等價物相比，可以更迅速地制造。
這樣的組織等價物10，與移植周邊組織的融合性優異，被比較快地固定在移植周邊組織上，可以減少脫落的可能性。
另外，在組織等價物10中，在包埋工序中，混合移植細胞和培養載體，雖然在載體部分12中也含有移植細胞，但若在細胞層14中存在細胞或細胞基質的話，則在載體部分12中不存在細胞也可以。這樣的在載體部分12中不含有細胞的組織等價物可以通過預先在培養器中設置培養載體，然后在培養載體的表面上播種載體-細胞混合物并開始培養得到。
此時使用的載體，雖然可使用與上述相同的凝膠狀或海綿狀的載體，但是與移植細胞混合時具有流動性。通過使用這種流動性的載體，僅在預先設置在培養器中的載體的表面上配置或涂布就可以適度地被覆其表面。培養期間可以為移植細胞至少在載體的一部分密集化的時間，或從細胞到產生適當量的細胞基質為止的時間。由此，可以用比較簡單的作業和短時間形成雙層結構。因此，可以容易地制作對生物體融合性高的三維結構的組織等價物20。
另外，在組織等價物10中，雖然沿其外周具有細胞層14，但由于只有在移植時在與生物體的接觸面上形成細胞層14，就可以在組織等價物的固定性等中發揮作用，因此也可以不沿全周存在，而在表面上的至少一部分上形成細胞層14。
圖2表示其它組織等價物20。在該組織等價物20中，在外周的一部分具有未形成細胞層14的地方。該組織等價物20由于不需要沿外周全部形成細胞層14，因此可以比沿全周形成細胞層14用更短的時間制作。
這樣的組織等價物20可以通過在培養器上開始培養后，不從培養器上剝下，終止培養工序容易地得到。
另外，圖3表示成為其它變形例的組織等價物30。在該組織等價物30中，形成細胞層14的區域變得比載體部分12露出的部分小。這樣的組織等價物30被移植時使在全周的一部分形成的細胞層14與生物體接觸。由于與生物體接觸的細胞層14對向生物體的固著有貢獻，所以可以得到與上述相同的結果。
這樣的組織等價物30可以通過沿厚度方向切斷上述組織等價物20容易地得到。因此，由于可使組織等價物30的形狀與移植部位的形狀相符合，提高與生物體的密著性，所以可更迅速地實現對生物體的固定和組織再生，而且可以抑制脫落。
以下，雖然列舉一實施例對本發明的內容進行具體的說明，但是本發明并不僅限于此。
放置的混合液在5％CO2、37℃的條件下靜置0.5～1小時使其凝膠化，加入培養基，開始培養。培養基中使用調整為含有50μg/ml抗壞血酸(L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物C6H6O9P·3/2Mg·nH2O；日光ケミカルズ株式會社制)和100μg/ml透明質酸的10v/v％FBS(胎牛血清)-DMEM(杜爾貝科改良的伊格爾極限必需培養基)，在37℃、5％CO2的條件下培養3周。
在3周的包埋培養后，得到直徑約10mm、厚度約3mm的組織等價物。為了確認該組織等價物的形態，用常規方法對作為軟骨細胞產生基質的酸性粘多糖類阿爾斯藍染色，對細胞核進行Kernechtrot染色后，用顯微鏡觀察剖面時，確認形成細胞密度不同的細胞層和載體層的雙層。
圖5A和B是經過了3周包埋培養的軟骨組織剖面的阿爾斯藍染色圖像。觀察圖5，產生的酸性粘多糖類密集在膠原凝膠表面，在凝膠內部只形成幾個菌叢。此時細胞層的厚度大約為100～200μm。而且，從作為軟骨的特征產生基質的II型膠原的染色像(圖6A和B)也可以觀察到同樣的結果。
得到的組織等價物在表面上豐富地存在軟骨組織細胞密集的細胞基質，與此相對，在內部不存在細胞數和細胞基質量，因此若在厚度方向施加負荷會產生適度的變形，可知有適宜的硬度。
在表1中，分別用×表示幾乎看不到雙層結構的情況，△表示可以看到一部分雙層結構的情況，○表示可以看到雙層結構的情況。
由該結果可知，在任何播種密度，在規定期間的培養后都可以提供組織等價物。另外，以2×105個/100μl載體播種的情況下從10天左右開始，以2×106個/100μl載體播種的情況下在10天以內開始，在組織等價物表面的一部分上形成雙重結構，表示可迅速作為移植片使用。表1
實施例7、比較例1～2除了作為基礎培養基使用10v/v％FBS-DMEM，只添加50μg/ml抗壞血酸(L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物)的培養基(實施例7)、只添加100μg/ml透明質酸的培養基(比較例1)、不添加添加物的基礎培養基(比較例2)作為培養用培養基外，與實施例1相同地進行培養操作。
圖8為在實施例1、圖9為在實施例7、
圖10為在比較例1、圖11為在比較例2的條件下培養3周的軟骨組織剖面的阿爾斯藍染色圖像。從這些剖面染色圖像可以明確，在作為添加物加入抗壞血酸的實施例1和7(圖8和9)中，在培養軟骨組織的表面形成細胞層，成為雙層結構。與此相反，在比較例1和2(圖10和11)中不形成細胞層。
表2是以實施例1制作的培養軟骨細胞為基準來表示實施例1和7、比較例1和2的培養軟骨組織的雙重結構的有無、基質產生和細胞數的表。表中“基準”表示實施例7，比較例1和2的基質產生和細胞數與實施例1的這些方面相比時作為基礎。
表2
由這些實驗結果可知，在實施例1的培養條件下，通過在基礎培養基中添加抗壞血酸，可以在培養軟骨組織表面上有效地形成細胞層。
培養操作雖然和實施例1相同地進行，但低溫保存或冷凍保持在培養開始時配制的上述培養用培養基，在培養基交換時，僅分別將必要量從保存狀態返回可使用狀態來使用，培養3周。另外，實施例1中每次培養基交換要配制新的培養基，進行培養基交換。圖12為在冷凍保存培養基中培養的軟骨組織剖面(實施例8)的阿爾斯藍染色圖像，圖13為在低溫保存培養基中培養的軟骨組織剖面(比較例3)的阿爾斯藍染色圖像。
表3是以實施例1制作的培養軟骨細胞為基準來表示實施例8和比較例3的培養軟骨組織的雙重結構的有無、基質產生和細胞數的表。表中“基準”表示實施例8和比較例3的基質產生和細胞數與實施例1的該方面相比時作為基礎。表3
由這些實驗結果可以明確，雖然在冷凍保存培養基中形成了細胞層，但在低溫保存培養基中細胞層的形成非常少。這可推測為由于抗壞血酸在液體中具有氧化分解或加水分解的特性，如果在液體的狀態下低溫保存，其活性緩慢地降低，不形成細胞層。與此相反，認為在冷凍保存中被保存在固體的狀態下，由于可以抑制抗壞血酸的活性降低，形成了細胞層。
由于即使是這種含抗壞血酸的培養基，根據保存方法其活性(效果)變化，因此有可能形成沒有細胞層的培養軟骨組織。由此可知，在培養基中抗壞血酸的活性與細胞層的形成密切相關。
圖14為測定實施例1和實施例7～8，以及比較例1～3的活細胞數的圖。在形成了細胞層的實施例1、實施例7和實施例8中，可以明確活細胞數多，細胞增殖活性升高。
發明的實用性本發明的移植用組織等價物可以容易地提供在短時間內可移植、富具與移植周邊組織的融合性的大型移植用組織等價物。由此，在可用的細胞數量少的情況，或必須由少數細胞數迅速形成大型三維結構的組織等價物時，特別地有用。該組織等價物10，富具與移植周邊組織的融合性，比較快地被固定在移植周邊組織中，可以減少脫落的可能性。
權利要求
1.一種在體外培養的，含有移植對象細胞并且培養后可向生物體內移植的三維結構的移植用組織等價物，其特征在于，具備主要以構筑三維結構的細胞培養載體構成的載體層、和在上述移植用組織等價物表面的至少一部分上、在上述載體層上局部連續存在、上述移植對象細胞或細胞基質比上述載體層更豐富的細胞層。
2.如權利要求1記載的移植用組織等價物，其特征在于，上述細胞層由密集的上述移植對象細胞構成，或者進一步含有由密集的移植對象細胞產生的細胞基質。
3.如權利要求1記載的移植用組織等價物，其特征在于，在上述細胞層中存在的移植對象細胞的密度相對于上述載體層內部的細胞密度實質的密。
4.如權利要求1記載的移植用組織等價物，其特征在于，上述細胞層的厚度為20～500μm。
5.如權利要求1記載的移植用組織等價物，其特征在于，上述細胞培養載體是生物體吸收性材料或生物體親和性材料。
6.如權利要求1記載的移植用組織等價物，其特征在于，上述細胞培養載體是膠原、透明質酸和多聚輪烷(polyrotaxane)中的至少一種。
7.如權利要求1記載的移植用組織等價物，其特征在于，上述細胞是軟骨細胞、成骨細胞或它們的前體細胞。
8.一種在體外培養的，含有移植對象細胞并且培養后可向生物體移植的三維結構的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于包括，在構筑上述三維結構的細胞培養載體上包埋移植對象細胞的包埋工序，和將可培養上述移植對象細胞的培養基供給包埋了上述移植對象細胞的細胞培養載體的供給工序，和在上述細胞培養載體的表面的上述移植對象細胞的增殖率比上述細胞載體內部高的條件下培養，并在該細胞培養載體的至少一部分表面上，上述移植對象細胞密度比上述細胞培養載體的內部更高、形成細胞密度不同的兩層的培養工序。
9.如權利要求8記載的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于，上述培養基含有抗壞血酸。
10.如權利要求9記載的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于，含有上述抗壞血酸的培養基是被冷凍保存的培養基。
11.如權利要求8記載的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于，以1×104～1×108個/ml的播種密度在上述細胞培養載體中包埋上述移植對象細胞。
12.一種在體外培養的，含有移植對象細胞并且培養后可向生物體移植的三維結構的移植用組織等價物的制造方法，其特征在于包括，混合在培養基中可以維持立體結構的流動性載體和移植對象細胞的混合工序，和將通過上述混合工序得到的混合物播種在預先被載置的三維載體的至少一部分表面上的播種工序，和在上述流動性載體的至少一部分中，培養細胞達到實質上移植對象細胞成為密集狀態的培養工序。
全文摘要
本發明的移植用組織等價物，是在體外培養的含有移植對象細胞并且培養后可向生物體內移植的三維結構的移植用組織等價物，其特征在于具備主要以構筑三維結構的細胞培養載體構成的載體層，和在上述移植用組織等價物表面的至少一部分上、在上述載體層上局部連續存在、上述移植對象細胞或細胞基質比上述載體層更豐富的細胞層。本移植用組織等價物適合成為比較大型的移植用組織等價物。本移植用組織等價物，可以實現移植后向組織周邊部分的早期固定和抑制脫落。
文檔編號A61L27/38GK1477979SQ01819903
公開日2004年2月25日 申請日期2001年12月4日 優先權日2000年12月6日
發明者越智光夫, 內尾祐司, 河崎賢三, 加藤雅一, 山本剛之, 福島里佳, 久留島豐一, 一, 三, 豐一, 之, 佳, 司 申請人:越智光夫, 株式會社日本組織工程, 科學技術振興事業團