專利名稱：：自體組織成纖維細胞培養植方法
技術領域：
：本發明涉及一種將功能細胞在體外構建成具有生命的組織材料，用以植入生物體內，修復或替代病損組織，恢復組織器官的形態、機構與功能；或在生物體內植入某些生物活性物質如透明質酸酶、膠原蛋白、組織干細胞等誘導自體組織再生，達到修復組織、器官功能的自體組織成纖維細胞培養植方法。
背景技術：
：隨著我國社會和經濟的發展，醫學美容市場的日益增長，美容整形已經成為我國目前發展最快的學科之一，伴隨醫學生物科技的髙速發展，細胞生物學、分子生物學產品不斷地出現于美容整形領域。組織工程學是在分子生物學、移植免疫學、細胞生物學、新型材料學等學科以及基因工程技術、分子克隆技術、體外組織構建技術等高科技迅速發展之后，出現的新興分支學科。其最終目的是將功能細胞在體外構建成具有生命的組織材料，用以植入生物體內，修復或替代病損組織，恢復組織器官的形態、機構與功能；或在生物體內植入某些生物活性物質如透明質酸酶、膠原蛋白、組織干細胞等誘導自體組織再生，達到修復組織、器官功能的目的1。這是繼20世紀科學家們解讀人類基因密碼后，具有重大科學意義的又一事件，對人類健康起到了十分重要的作用，因此，被認為是"一場意義深遠的醫學革命"，廣泛地應用于醫學的各個領域2。目前的美容除鈹方法雖有一定療效但有一定的時間限制21，由于都不是自體組織，有時會出現排異反應及局部不平整現象。社會的進步與生活水平的提高，使人們越來越注重于社會生活質量，面部創傷的修復美容治療成為人們越來越關心的話題，美容整形也取得快速發展，各種組織工程生物材料不斷應用于面部美容與創傷治療的修復3。對抗衰老是全人類共同關注的話題，研究表明對人體肌膚起支撐作用的物質大部分存在于真皮層，由膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸構成的一個纖維網絡對皮膚起著支撐作用，其含量的多少決定了皮膚的質地。這三種物質都從真皮層中的成纖維細胞分泌而來，成纖維細胞由成纖維前體細胞演化生成。她不斷分泌膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸，保持肌膚的光澤度和質感。25歲以后，成纖維前體細胞以每年1%到2%的速度減少，導致了成纖維細胞的減少，隨之而來的就是膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸的數量均下降，衰老的跡象就體現出來由此可見成纖維細胞才是導致肌膚衰老的真正原因。成纖維前體細胞(transitamplifyingfibroblast,TAF)是間充質干細胞向成纖維細胞分化過程中的過渡細胞，具有持久增殖分化為成纖維細胞的能力，是近年形領域的產品之一，具有作用持久、副作用少等優點。當前的美容醫學發展趨勢朝著簡單、微創、安全的方向發展，面部老化的治療也從過去的手術治療向生物醫學制劑注射治療轉化，當前主要的生物注射制劑有膠原蛋白、透明質酸酶、胚胎干細胞和肉毒素等4。在以上生物注射制劑中除肉毒毒素是作用于面部動態皺紋外，均是用于治療皮膚老化所致的細小鈹紋，其中膠原蛋白和透明質酸酶是真皮組織細胞外基質的主要成分，在皮膚中主要起生物替代作用，使老化皮膚逐漸減少的真皮厚度與細胞外基質得到補充，具有除皺效果明顯，起效快的特點；但這些成分多數是異體或異種成分，存在免疫排斥和過敏反應的可能，且生物代謝作用使之很快降解，效果持續時間短暫是這類產品的主要缺點5。胚胎干細胞也是近年開發的生物美容產品，具有持續的生物美容效果和免疫原性的特點，但胚胎干細胞的來源有限，提純與保存困難，不能完全排除免疫反應是其缺點6。胚胎干細胞的高分化特性使其組織分化方向誘導成為注射后值得關注的一個問題7。TAF作為成纖維細胞的來源細胞具有細胞分化活性和分化方向恒定的優點，且為自體組織，排除了免疫與過敏反應的顧慮，在臨床上有廣泛的應用前景8。自體細胞除皺的適應癥比較廣泛，不但對于所有的顏面部皺紋和凹陷性疤痕都有效，還包括頸部皺紋、手部皺紋、額頭紋、眉間紋、魚尾紋、口周和面部皺紋、妊娠紋以及痤瘡、青春痘、天花、水痘、外傷等在面部留下的凹陷性疤痕都有明顯的效果。由于細胞取自自體，較以往的除皺手段有著截然相反的醫學思路，它不是靠破壞或刺激肌膚病理性改變來除皺，也不是異物物理性填充，它是通過直接增強皮膚功能來達到治療目的，因而屬于生理性除皺。自體細胞非手術除皺技術除了可以令患者保持更久的青春外，更重要的是它無與倫比的安全性。皮膚主要是由表皮、真皮、皮下組織三部分組成，真皮組織構成了皮膚的支架結構，是影響皮膚彈性與韌性的主要成分。真皮主要由膠原蛋白構成，膠原蛋白成分的多少直接影響著皮膚組織的厚度與彈性。隨著皮膚的衰老，真皮組織中成纖維細胞與其所分泌的膠原蛋白的減少，是皮膚出現各種皺紋的主要原因，為皮膚提供足夠數量的成纖維細胞是應用TAF進行生物除皺的主要機制9。然而，成熟的成纖維細胞增殖與分泌活力有限，研究發現成纖維細胞是由TAF成熟演化而來10。在通常情況下，人體皮膚的彈性與光澤就是由真皮組織中TAF的含有量決定，隨著年齡的增長皮膚組織內TAF逐漸減少。在皮膚組織中補充TAF可以持續地增加成纖維細胞的含量，促進膠原蛋白的增生，使真皮的厚度增加，恢復皮膚的彈性，從而消除皮膚的皺紋或使凹陷的瘢痕得到填充11。TAF的采集與培養在這項組織工程技術的應用中具有關鍵作用。首先需要解決的是TAF的純化與鑒定，研究發現，有增殖活性的TAF較成熟的成纖維細胞幼稚、飽滿，缺乏成熟細胞的特征性細胞胞質的突起。在組織學鑒定上，采用常規的細胞免疫學方法12。培養液的配制對細胞的生長有重要影響，美國Hyclone公司針對TAF的生長特性，設計生產了這一產品13。TAF技術在面部美容修復中主要應用于生物美容除皺和凹陷性瘢痕的治療14。美國Isolagen研究機構于1995年開始應用組織工程技術培養自體成纖維前體細胞，并用于面部皺紋和瘢痕的治療，此后法國、英國、澳大利亞等都開展了這一研究[12][20][16]，取得了豐富的經驗，基本形成了產業化生產規模。Keller15等應用此技術為20例年齡為3761歲的中老年人進行了面部除皺治療，產生了明顯的療效。Watson等運用攝像及硅膠模型技術，選擇10例年齡在2429歲之間的人，同時在耳后注射相同細胞進行病理實驗，經36個月隨訪，用注射前后的硅膠模型比較局部皮膚表面的改善情況，對耳后注射部位的樣本標本進行了組織學分析。結果表明10例中有9人在治療后感覺有60%100%的改善，臨床醫師也給出了同樣的觀察結果；對每例的硅膠模型檢査證實，美容者面部的皺紋和瘢痕有10%85%的減少；經顯微鏡觀察，真皮層膠原蛋白的厚度和密度均有所增加[16]。Boss等17對94例中的老年人進行除皺治療，經3648個月的隨訪，美容者的皺紋自主滿意率為92%,長期療效達70%。通過大量的臨床實驗可以看出，TAF是一種面部美容修復安全有效的方法。國內學者18在對82例接受手術的美容者分析中，觀察隨訪時間為6個月，結果自我感覺對皺紋、瘢痕明顯消失滿意，皮膚蒼白狀況明顯改善者為70例，其滿意率為85.4%。在采用硅膠皺紋模型方法觀察的10例中，有9例達到60%100%的改善程度，每例有IO%85%皺紋和瘢痕的減少，在所有觀察者中，經過治療前后血、尿、便常規檢査以及肝腎功能和心電圖檢査，未出現異常反應和全身的不良反應，極少數人在術后24h內注射部位有輕度腫脹、麻木等感覺，未經處理均自然消失。l例在注射部位出現紅斑，于3d后自行消失。有醫療機構]對135例美容者行自體成纖維細胞回植除皺術，術后經6個月至1年的隨訪，改善者100%、醫患均滿意者91%。且不同年齡的患者其除皺效果及對術后的滿意度是不同的，年輕患者的皺紋淺而少，自體細胞活性強，增殖分化多，除皺效果好；年長患者與之相比則較差。年輕患者一般只需回植注射1次即達到除皺效果；年長患者則需2、3次的補充回植注射方可達到除鈹效果19。[l]楊志明，主編.組織工程.北京:化學工業出版社,2002.15-30.BrooksN.Aforeignbodygranulomaproducedbyaninjectablecollagenimplantatatestsite.JDermatolSurg，1982,8:111-114.BurkeKE，NaugtonG,CassaiN,etal.Histological,immunologicalandelectronmicroscopystudyofbovinecollagenimplantsinthehuman.AnnPlastSurg，1985,14:515-522.[4]CoopermanS，MackinnonV,BechlerG，etal.Injectablecollagen:asixyearclinicalinvestigation.AesthPlastSurg,1985,9:145-151.ClarkP,HankerD,WilliamC,etal.Safetyofproductsinjectedforsofttissueaugmentation.JAmAcedDermatology,1989,21:992—998.McClellandM,EgbertB,HankoV，etal.Evaluationofartecollpolymethylmethacrylateimplantforsoftaugmentation,biocompatibilityandchemicalcharacterization.PlastReconstrSurg,1997,100:1466-1474.PiacquadioD,JarchoM.Evalutionofhylaformgelasasofttissueaugmentationimplant.JTAmDermatol,1997,36:543-544.BossWK,Marko0.Tissueaugmentationinclinicalpracticeproceduresandtechniques.NewYork:MarcelDekker,1998,335-347.ElsonML.Softtissueaugmentationwithallogenichumantissuematrix.CosmeticDermatology,1998,11:23—24.KleinAW.Indicationsandimplantationtechniquesforthevariousformulationsofinjectablecollagen.JDermatolSurg,1998,14:27-28.TobinHA,KarasWD,CaleelRT，etal.lipaugmentationusinganallodermgraft.JOralMaxillofacSurg,1998,56:722-723.WestTB,AlsterTS.Autologoushumancollagenanddermalfibroblastsforsofttissueaugmentation.DermatolSurg,1998,24(5):510-512.ElsonML.Softtissueaugmentationwithallogenichumantissuematrix.CosmeticDe腿tology，1998,11:24-25.ElsonML.Softtissueaugmentationtechniques,updateonavailablematerials.CosmeticDermatology,1999,12:13—14.KellerG,SebastianJ,LacombeU,etaLSafetyofinjectableautologoushumanfibroblasts.BulletinofExperimentalBiologyandmedicine,2000,8:786-789.BossWK，UsaJH，ChernoffG,etal.Autologousculturesfibroblastsascellulartherapyinplasticsurgery.[J]ClinicsinPlasticSurgeryofNorthAmerica,2000，27(4):613-626BossWK，UsalH，ChernoffG,etal.Autologousculturesfibroblasts,aProteinrepairsystem.AnnPlastSurg,2000,5:44-45.胡洋紅，劉文閣，胡瓊華等。中華醫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發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種自體組織成纖維細胞培養方法，采用美容者的自體皮膚細胞，運用當今世界先進的"組織工程技術"，進行細胞分離、純化、培養，并擴增成足量的成纖維細胞注射液，再回輸到受術者的皺紋、凹陷性疤痕等皮膚缺損部位的真皮層內。會輸的成纖維細胞在真皮層內繼續生長，逐步替換和補充自身已經衰亡的細胞，源源不斷地產生屬于自己的膠原蛋白、透明質酸和彈性纖維，使皮膚真皮層的厚度和密度增加，直接修復治療部位的皺紋和凹陷性疤痕等皮膚缺損疾病，恢復皮膚彈性，撫平皺紋，祛除凹陷性疤痕，達到預防、延緩衰老的目的。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是該自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于依次進行皮膚標本處理步驟和成纖維細胞培養步驟，所述皮膚標本處理步驟包括無菌條件下切取的皮膚標本，立即放入裝有基礎培養液的離心管中封存并運輸至實驗室，置于4。C冰箱中，24小時內處理皮膚標本，所述基礎培養液采用DMEM低糖培養液，含重量百分比為20%的胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素；所述成纖維細胞培養步驟包括原代成纖維細胞培養步驟，所述原代成纖維細胞培養步驟包括在超凈工作臺無菌條件下將皮膚標本移入3.5cm培養皿中，用基礎培養液沖洗，修剪皮膚標本并去除皮下組織、脂肪，剪切皮膚標本成lmm3小塊，小塊皮膚標本真皮層緊貼培養瓶底部置于50ml培養瓶中并使其均勻分布，翻轉培養瓶使得瓶底朝上，加入基礎培養液2ml并保持基礎培養液與小塊皮膚標本不接觸，擰緊瓶塞，將培養瓶倒置于37'C，5%C02培養箱中，1小時后緩慢將培養瓶翻轉讓基礎培養液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標本，再倒置培養，2小時后正放培養瓶，使基礎培養液與小塊皮膚標本接觸，每35天更換基礎培養液一次，每次2ral，使得成纖維細胞大量繁殖。本發明所述成纖維細胞培養步驟在原代成纖維細胞培養步驟后還可設置成纖維細胞傳代步驟，所述成纖維細胞傳代步驟包括吸棄舊培養液，加入2ml的PBS溶液，輕輕清洗細胞后吸棄PBS溶液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液1ml，將培養瓶置于37'C，5%C02培養箱中消化5分鐘；以細胞突起縮回、細胞之間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎培養液終止消化；吸取培養瓶內的培養液，反復吹打，使已經消化的細胞脫離瓶底壁；收集帶有細胞的含酶溶液于離心管，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，吸棄上清;用1ml基礎培養液將細胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎培養液吹打均勻，將細胞分裝于3個新的50ml培養瓶內，每瓶2ml;將培養瓶置于37°C,5%C02培養箱中繼續培養，使原代成纖維細胞分化為成纖維細胞并大量增殖。本發明所述成纖維細胞傳代步驟可根據需要重復進行，使得成纖維細胞大量增殖。本發明所述成纖維細胞培養步驟在原代成纖維細胞培養步驟后或者成纖維細胞傳代步驟后還設置有成纖維細胞凍存步驟，所述成纖維細胞凍存步驟包括吸棄培養瓶內舊培養液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液2ml,于37°C，5%C02條件下消化35分鐘；以細胞突起縮回、細胞之間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入加基礎培養液終止消化；吸取培養瓶內的基礎培養液，反復吹打培養皿底壁，使已經消化的細胞脫離瓶底壁；收集帶細胞培養液，離心以IOOO轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清；加35ml基礎培養液重懸細胞，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清溶液；加1ml凍存液重懸并吹勻細胞，并將細胞轉移至凍存管，蓋緊密封后，將凍存管封包，所述凍存液包括重量百分比為50%的胎牛血清、1(^的DMS0溶液、40%的基礎培養液；將凍存管儲存到4'C冰箱，2小時后轉移到-20'C冰箱，再2小時后轉移到-80'C冰箱凍存。本發明所述成纖維細胞培養步驟在成纖維細胞凍存步驟后還設置有成纖維細胞解凍復蘇步驟，所述成纖維細胞解凍復蘇步驟包括將含成纖維細胞的凍存管從-80'C冰箱中取出，直接置于37'C水浴中解凍；解凍后將凍存管離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清；加基礎培養液2ml重懸細胞，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清；加基礎培養液lml重懸細胞并吹打均勻，再加基礎培養液lml并吹勻細胞，將細胞轉入50ml培養瓶培養；在37°C，5XC02培養箱中培養，每35天更換基礎培養液一次，每次2ml。本發明所述超凈工作臺超凈空氣的流速為2430米/分鐘。本發明通過自體的成纖維前體細胞的體外培養、擴增方法大量培養自體組織成纖維細胞，簡單方便、安全性好，使用時不會出現排異反應，效果顯著。圖1為本發明實施例自體原代成纖維細胞示意圖。具體實施例方式本發明實施例自體組織成纖維細胞培養植方法操作步驟如下1皮膚標本處理無菌條件下切取的皮膚標本，立即放入裝有基礎培養液(DMEM低糖培養液，含20%(本發明所述比例均指重量百分比，下同)胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)的離心管中封存、運輸至實驗室，置于4'C冰箱中，24h內處理皮膚標本。2成纖維細胞培養設備和材料超凈工作臺是一種層流局部空氣凈化設備，采用可調風量風機系統，將空氣通過由特制的微孔泡沫塑料片層疊合組成的"超級濾清器"后吹送出來，形成連續不斷的無塵無菌的超凈空氣層流，即所謂"高效的特殊空氣"，它除去了大于0.3nm的塵埃、真菌和細菌孢子等等。超凈空氣的流速為2430m/min,已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒。工作人員就在這樣的無菌條件下操作，保證無菌材料在轉移接種過程中不受污染。基礎培養液DMEM低糖培養液(含20%胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)；胎牛血清(四季青)；0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液;DMSO(Dimethylsulfoxide:二甲基砜)溶液；PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)；一次性吸管；眼科剪刀；眼科鑷子；細玻棒；50ml培養瓶；3.5cm培養皿。2.1原代成纖維細胞培養(組織塊貼壁法)2.1.1在超凈工作臺無菌條件下，將皮膚標本移入3.5cm培養皿中，用lml基礎培養液沖洗皮膚標本3次，用眼科剪刀修剪皮膚標本，去除皮下組織、脂肪，盡可能剪到皮膚真皮層。2.1.2用剪刀剪切皮膚標本成lmm3小塊，小塊皮膚標本的真皮層緊貼培養瓶底部置10于50ml培養瓶中(可用彎細玻棒移小塊皮膚標本到培養瓶中)并使其均勻分布(小塊皮膚標本之間的間距0.30.5cm間隔放置)。2.1.3輕輕翻轉，瓶底朝上，加入基礎培養液2ml并保持基礎培養液與小塊皮膚標本不接觸，擰緊瓶塞，將培養瓶倒置于37'C,5劣C02培養箱中。2.1.4lh后緩慢將培養瓶翻轉讓基礎培養液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標本，再倒置培養。2.1.52h后正放培養瓶，使基礎培養液與小塊皮膚標本接觸。2.1.6每35天更換基礎培養液(2ral/次)一次。14天左右可以長出細胞，當成纖維細胞大量繁殖單層成纖維細胞相互融合，出現密集的細胞集落或成纖維細胞基本上鋪滿瓶底(融合率達70-80%)時可以傳代。從成纖維細胞長出到可以傳代一般需要培養46個星期。2.2成纖維細胞傳代2.2.1吸棄舊培養液，加入2mlPBS溶液，輕輕清洗細胞后吸棄PBS溶液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液1ml,將培養瓶置于37'C，5%C02培養箱中消化5min;2.2.2以細胞突起縮回、細胞之間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎培養液終止消化；2.2.3用一次性吸管吸取培養瓶內的培養液，反復吹打，使已經消化的細胞脫離瓶底壁；2.2.4收集帶有細胞的含酶溶液于離心管，離心1000r/min轉速轉6min，吸棄上清；2.2.5用1ml基礎培養液將細胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎培養液吹打均勻，將細胞分裝于3個新的50ral培養瓶內，每瓶2ml;2.2.6將培養瓶置于37°C,5%C02培養箱中繼續培養，使原代成纖維細胞分化為成纖維細胞并大量增殖；2.2.7—般3天左右可以再次傳代，即如果需要的話可重復2.2.12.2.6步驟，一瓶可傳3瓶。2.3成纖維細胞凍存(2.3成纖維細胞凍存步驟和2.4成纖維細胞解凍步驟可以在2.1原代成纖維細胞培養步驟后也可以在2.2成纖維細胞傳代步驟后進行)當成纖維細胞大量繁殖單層成纖維細胞相互融合，出現密集的細胞集落或成纖維細胞基本上鋪滿瓶底(融合率達70-80%)時可以凍存。配制凍存液50%胎牛血清，10%DMSO溶液，40%基礎培養液，三種成分按比例混勻后置于4'C冰箱冷藏。2.3.1吸棄培養瓶內舊培養液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液2ml，于37°C,5%C02條件下消化35min;2.3.2以細胞突起縮回、細胞之間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入加基礎培養液終止消化；2.3.3用一次性吸管吸取培養瓶內的基礎培養液，反復吹打培養皿底壁，使已經消化的細胞脫離瓶底壁；2.3.4收集帶細胞培養液，離心1000r/min轉速轉6min,除去上清；2.3.5加35ml基礎培養液重懸細胞，離心1000r/min轉速轉6min,除去上清溶液；2.3.6加lml凍存液重懸并吹勻細胞，并將細胞轉移至凍存管，蓋緊密封后，用衛生紙將凍存管層層封包(約15層左右)；2.3.7將用衛生紙包裹的凍存管儲存到4'C冰箱，2小時后轉移到-20'C冰箱，再2小時后轉移到-80'C冰箱凍存。2.4成纖維細胞解凍2.4.1將含成纖維細胞的凍存管從-80'C冰箱中取出，直接置于37'C水浴中約20分鐘解凍；2.4.2解凍后將凍存管離心1000r/min轉速轉6min，除去上清；2.4.3加基礎培養液2ml重懸細胞，離心IOOOr/min轉速轉6min,除去上清；2.4.4加基礎培養液1ml重懸細胞并吹打均勻，再加基礎培養液1ml并吹勻細胞，將細胞轉入50ml培養瓶培養；2.4.537°C，5%C02培養箱中培養，每3~5天更換基礎培養液(2ml/次)一次；2.4.6如果需要的話可繼續成纖維細胞傳代，即轉至2.2成纖維細胞傳代步驟。本發明實施過程如下首先進行皮膚取材(1)局部麻醉常規PVP-I溶液消毒，鋪巾后用2%利多卡因針1ml于耳后取皮部位局部皮下注射。(2)耳后取皮耳后切取約0.8x0.3cm大小梭形皮膚(包括表皮，真皮，以及少量皮下組織)。(3)封存、運輸至實驗室。將獲取的皮膚組織至于無菌器皿運輸至實驗室，然后采用本發明實施例的方法進行自體組織成纖維細胞培養；最后進行注射(1)皮試，(2)局部麻醉或全身麻醉，(3)使用專用注射器注射，選用410代的細胞進行移植。注射細胞的數量根據需注射的面積而定。每毫升含約1-2千萬個自體成纖維細胞的懸浮液，2-5ml每次，真皮內注射，一個療程注射3次，每次間隔2周。本發明實施范圍嬌嫩肌膚、潤唇、祛除凹陷性疤痕，治療頸紋、妊娠紋、眉間紋、眼周紋、鼻唇溝、鼻背紋、口周紋、魚尾紋等。試驗表明，自體細胞注射后1、2、4、6月的組織填充效果分別約57%、79.6%、77.1%、81.6%。突出的特點是隨著時間推移，組織填充效果增加，普通充填劑的填充效果隨著時間推移遞減。本發明實施例回植的成纖維前體細胞來源于自體，安全性非常高，不會出現排異反應。通過自體的成纖維前體細胞的體外培養、擴增，首先從數量上得到滿足，而且回植后易于成活，能迅速分泌膠原蛋白，由于機體代謝功能的調節作用，并不會出現膠原蛋白過度增生的現象，因此除皺的效果十分自然。自體成纖維細胞美容術不僅可以治療各個部位已經形成的皺紋、凹坑，對沒有進入衰老的肌膚，也有很好的嬌嫩肌膚作用。最重要的特點是完全不留痕跡，使用以后，細胞適應母體需要一個周期，之后逐漸顯效，潛移默化地使肌膚質地得到改善。還可以建立"自體細胞庫"，不論是為美容或者作為創傷治療，凍存細胞都可以實現。該技術的幾大特點在國內整形美容界具有唯一性，是目前市場上最有效祛除皺紋、疤痕的手段。并且在絕對安全的前提之下，把全面嬌嫩肌膚、改善膚質的技術提高到一個新的境界。1權利要求1、一種自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于依次進行皮膚標本處理步驟和成纖維細胞培養步驟，所述皮膚標本處理步驟包括無菌條件下切取的皮膚標本，立即放入裝有基礎培養液的離心管中封存并運輸至實驗室，置于4℃冰箱中，24小時內處理皮膚標本，所述基礎培養液采用DMEM低糖培養液，含重量百分比為20％的胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100單位/毫升鏈霉素；所述成纖維細胞培養步驟包括原代成纖維細胞培養步驟，所述原代成纖維細胞培養步驟包括在超凈工作臺無菌條件下將皮膚標本移入3.5cm培養皿中，用基礎培養液沖洗，修剪皮膚標本并去除皮下組織、脂肪，剪切皮膚標本成1mm3小塊，置小塊皮膚標本于50ml培養瓶并使真皮層緊貼培養瓶底部并均勻分布，翻轉培養瓶使得瓶底朝上，加入基礎培養液2ml并保持基礎培養液與小塊皮膚標本不接觸，擰緊瓶塞，將培養瓶倒置于37℃，5％CO2培養箱中，1小時后緩慢將培養瓶翻轉讓基礎培養液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標本，再倒置培養，2小時后正放培養瓶，使基礎培養液與小塊皮膚標本接觸，每3～5天更換基礎培養液一次，每次2ml，使得成纖維細胞大量繁殖。2、根據權利要求l所述的自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于所述成纖維細胞培養步驟在原代成纖維細胞培養步驟后還設有成纖維細胞傳代步驟，所述成纖維細胞傳代步驟包括吸棄舊培養液，加入2mlPBS溶液，輕輕清洗細胞后吸棄PBS溶液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液1ml，將培養瓶置于37'C，5%C02培養箱中消化5分鐘；以細胞突起縮回、細胞之間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎培養液終止消化；吸取培養瓶內的培養液，反復吹打，使己經消化的細胞脫離瓶底壁；收集帶有細胞的含胰蛋白酶溶液于離心管，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，吸棄上清；用1ml基礎培養液將細胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎培養液吹打均勻，將細胞分裝于3個新的50ml培養瓶內，每瓶2ml;將培養瓶置于37'C，5%C02培養箱中繼續培養，使原代成纖維細胞大量增殖。3、根據權利要求2所述的自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于所述成纖維細胞傳代步驟重復進行，使得成纖維細胞大量增殖。4、根據權利要求13任一權利要求所述的自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于所述成纖維細胞培養步驟在原代成纖維細胞培養步驟后或者成纖維細胞傳代步驟后還設置有成纖維細胞凍存步驟，所述成纖維細胞凍存步驟包括吸棄培養瓶內舊培養液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%￡0丁八溶液21111，于37'C，5%C02條件下消化35分鐘；以細胞突起縮回、細胞之間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入加基礎培養液終止消化；吸取培養瓶內的基礎培養液，反復吹打培養皿底壁，使已經消化的細胞脫離瓶底壁；收集帶細胞培養液，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清；加35ml基礎培養液重懸細胞，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清溶液;加lml凍存液重懸并吹勻細胞，并將細胞轉移至凍存管，蓋緊密封后，將凍存管封包，所述凍存液包括重量百分比為50%的胎牛血清、1(W的DMSO溶液、40%的基礎培養液；將凍存管儲存到4'C冰箱，2小時后轉移到-20'C冰箱，再2小時后轉移到-80'C冰箱凍存。5、根據權利要求4所述的自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于所述成纖維細胞培養步驟在成纖維細胞凍存步驟后還設置有成纖維細胞解凍步驟，所述成纖維細胞解凍步驟包括將含成纖維細胞的凍存管從-80'C冰箱中取出，直接置于37'C水浴中解凍；解凍后將凍存管離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清；加基礎培養液2ml重懸細胞，離心以1000轉/分鐘的轉速轉6分鐘，除去上清；加基礎培養液lml重懸細胞并吹打均勻，再加基礎培養液lml并吹勻細胞，將細胞轉入50ml培養瓶培養；在37'C,5%C02培養箱中培養，每35天更換基礎培養液一次，每次2ml。6、根據權利要求13任一權利要求所述的自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于所述超凈工作臺超凈空氣的流速為2430米/分鐘。全文摘要本發明涉及一種自體組織成纖維細胞培養植方法，其特征在于依次進行皮膚標本處理步驟和成纖維細胞培養步驟，所述成纖維細胞培養步驟包括原代成纖維細胞培養步驟，還可根據實際需要設置成纖維細胞傳代步驟、成纖維細胞凍存步驟和成纖維細胞解凍復蘇步驟。本發明通過自體的成纖維細胞的體外培養、擴增方法大量培養自體組織成纖維細胞，用于回輸治療皮膚膠原缺損性疾病或變性疾病，簡單方便、安全性好，使用時不會出現排異反應，效果顯著。文檔編號C12N5/08GK101597593SQ200910101280公開日2009年12月9日申請日期2009年7月27日優先權日2009年7月27日發明者燁呂,王培科,趙可佳申請人:杭州安倍生物科技有限公司