專利名稱：得自纖毛蟲類的酶作為促進消化的藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療消化性病癥的含有得自纖毛蟲類(Ciliaten)的酶的藥物。
消化性病癥在一般的醫療和內科中所占的比重正不斷增大。在許多病例中，這樣的消化性病癥是由于或多或少顯著缺乏所謂的胰酶所致。在健康狀態下，這些酶是由高度特異性的細胞-所謂的腺泡細胞在胰腺中合成的，并且通過胞吐作用經由涎腺和主要的胰腺管分泌到十二指腸內。胰腺每天的分泌量約為2升。除了消化脂肪的脂肪酶以外，胰腺分泌物還含有消化蛋白的酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶)以及消化碳水化合物的酶(α-淀粉酶)。胰酶的分泌是由內源性控制機制通過激素例如胃泌素、胰泌素和促胰酶素精確控制的。該控制系統可被多種原因擾亂，導致胰酶分泌減少或者外分泌胰腺功能完全平息。這會引起食糜在小腸中沒有被消化，并發生消化性病癥。還稱為外分泌胰腺機能不全的這種消化道疾病可具有不同原因。除了由藥物引起的消化不良以外，慢性萎縮性胃炎和慢性的通常由酒精消耗引起的胰腺炎、由手術(例如Billroth I和II、迷走神經切斷術、胰腺切除術)引起的病癥和囊性纖維變性是胰腺機能不全的病因學因素。無論如何，慢性消化性病癥是嚴重的社會醫療問題，并由此引起經濟損失，因為該病癥經常引起患者工作能力受到限制或不能工作，并且預期壽命縮短。
胰原性消化性病癥在患者中引起多種疾病例如腹瀉、糞便結塊、充滿感、上腹部病、體重減輕等。
不論胰原性消化性病癥或胰腺機能不全的原因和表現，用酶進行的替代治療總是減輕消化性病癥所必需的。這意味著缺乏的酶，主要是脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶以及其它酶必須從外面補充。在這樣的治療中，酶是由患者口服攝取的-主要是在吃飯中間服用，并經由胃到達小腸，在小腸中它們將食糜消化，并由此行使所缺乏的內源性胰酶的功能。所采用的制劑必須含有足量的酶。此外，酶必須在腸制劑中提供，具有小的粒徑，并且可被消化道完全生物吸收。
為了治療基于胰酶、尤其是主要的酶-脂肪酶和蛋白酶缺乏的消化道病癥，市場上已經有了多種不同的酶制劑。這些酶制劑是部分基于得自豬的胰酶，例如制劑Combizym、Festal、Pankreon、Kreon、Panzytrat、Meteozym或Enzym-Lefax N，或基于胃酶例如Citrapepsin。部分地，酶制劑還含有得自霉菌提取物的酶例如Combizym和Festal。此外，現有技術中已描述了得自魚或其它海洋動物的酶的應用(FR 1015566)，以及得自磷蝦(磷蝦目的甲殼綱動物)和毛鱗魚胃腸道的酶制劑(US 4,695,457)。含有胰酶的制劑大部份是得自屠宰場廢料例如豬的胰腺。制劑加工的終產品是胰酶。胰酶是得自胰腺組織(通常是豬的胰腺組織)的細胞的均化物。由于大量腺泡細胞被破裂，所以除了胰酶之外，其還含有多種其它酶和蛋白以及另外的高分子量和低分子量化合物。胰酶的組成取決于其工業化制備過程。為了獲得胰酶，在屠宰后將豬的胰腺盡可能快地深度冷凍，收集并機械破碎。為了穩定和激活酶，向勻化物中加入各種添加劑。然后用有機溶劑例如丙酮脫脂，除去纖維性物質，脫水并通過凍干來干燥。為了制備特定劑型，將進行蓋侖加工，將其制成微丸劑、片劑、膠囊、糊劑、霜劑、凝膠劑、油質制劑或其它制劑。通常將胰酶與各種載體材料和緩沖物質混合。此外，用酸穩定的膜或漆將粒狀胰酶包衣以保護它們抗人胃液的低pH值。后兩個加工步驟是為了保證酸不穩定的胰酶可在靶位點-十二指腸(小腸)實現其消化功能。
除了常規胰酶制備以外，可通過依次用氯仿、丁醇和丙酮連續萃取來提高終產品中的脂肪酶含量。按照與制備胰酶類似的方法，由磷蝦Euphausia suberba和毛鱗魚的腸獲得了酶組合物(參見US-A-4,695,457)。對于這種情況，也是首先由組織制得勻化物，然后通過離心、用氯仿萃取、冷凍干燥和色譜步驟來進一步純化。在每種情況下，加工的目的都是獲得盡可能高的胰酶例如脂肪酶、蛋白酶和α-淀粉酶含量。此外，酶組合物應當盡可能地耐胃液以治療消化性病癥。此外，酶應當盡可能快地在消化道、尤其是十二指腸中釋放，并表現出其生理活性。為了防止變應性，如果可能的話酶組合物應當不含有無效蛋白，或者具有高純度。此外，胰酶加工應當在制藥經濟方面是低成本的。
對于胰酶，一般不進行通過色譜法的進一步純化，這樣所需的酶既不是以純化的形式也不是以均一狀態獲得的。這樣的得自細胞均化物的蛋白混合物的一個缺點是，它們含有多種得自豬胰腺細胞的細胞內隔室(例如胞質溶膠、細胞核、細胞器膜)的蛋白。這些蛋白不具有酶活性或不具有需要的酶活性，并因此降低了所提供的每個劑型中的活性物質的量。如果所考慮的細胞均化物是得自磷蝦或毛鱗魚的胃腸道，情況也是如此。
得自屠宰場廢料(胰腺、魚的胃腸道)和磷蝦的酶制劑和酶組合物的另一個缺點是回收的不連續加工方式。通常是在不同的步驟中將器官(胰腺)粉碎并均化。然后將均化物脫脂和干燥。這些酶回收步驟不能連續操作，因為總是采用高含量的固體，這由于提取和離心步驟而排除了連續的進一步加工。然而，對于酶的回收，連續和半連續制備方法是最佳的，這是因為在這樣的方法中時空產率較高，并且成本因此而降低。然而，連續回收酶需要它們在細胞外和呈溶解形式，并且無需通過粉碎或均化細胞才釋放出來。因此，胰酶制備方法不適于連續回收酶。
從胰腺中獲得的酶的另一個缺點是它們的酸不穩定性。胰酶是中性或堿性水解酶。這意味著，另一方面，它們的活性在pH7至pH8之間最大，并且其活性在酸性條件下顯著下降。另一方面，低的pH值通過可逆或不可逆的變性使它們的催化功能失活。因此，必須通過包封或加入緩沖物質這樣的特殊方法將得自胰腺的酶(胰酶)保護起來以在經過胃期間抗低pH值。這樣的方法還增加了基于胰酶活性的藥物的成本。
此外，對于特定的患有消化性疾病的患者組，使用胰酶的一個缺點是胰酶的起源。通常使用的是豬的胰腺，由于宗教指令的原因其不能被猶太人或伊斯蘭教徒接受。
最后，得自豬的胰酶不能被具有豬蛋白變應性反應的消化性病癥患者使用。此外，豬被認為是人致病性流感病毒的天然儲藏者，這樣不能排除具有這樣的病毒的胰酶污染。
因此，本發明的目的是提供用于醫藥的酶或酶組合物，其中所述酶或酶組合物1)呈細胞外狀態，并且可不用將組織或細胞均化(裂解)來由不含細胞的上清液獲得和純化；2)可由沒有進行基因工程加工的無害微生物在生物技術方法中連續獲得；3)是酸性水解酶，即在酸性pH值下具有其最大活性，并且對于酸的穩定性比得自胰腺的酶強；4)不是得自豬的組織或器官。
含有選自下列的得自纖毛蟲類的酶的藥物實現了本發明目的水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、磷酸酶。
本發明特別涉及用于促進消化和用于治療消化性病癥的藥物。
本發明藥物優選含有用于在人或動物胃腸道中消化包含在食物中的大分子例如蛋白、核酸和碳水化合物以及其它食品組分例如脂肪和磷脂的酶。
本領域技術人員知道，不屬于此前應用的脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶的得自纖毛蟲類的酶也可用于依據本發明促進消化或治療消化性病癥，因為其它酶也可以通過催化裂解食物組分來促進胃腸道中的消化。
在一個本發明實施方案中，酶的最佳pH是pH 4-6。
本發明藥物優選含有源自四膜蟲屬(Tetrahymena)、豆形蟲屬(Colpidium)和草履蟲屬(Paramecium)的纖毛蟲類的酶。
本發明藥物優選含有藥物安全的輔助劑和載體。
本發明藥物特別是以片劑、微丸劑、油質制劑、汁液劑、凝膠劑、栓劑、膠囊、包衣片劑的形式使用。
本發明還涉及選自水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶和/或磷酸酶的得自纖毛蟲類的酶在制備用于治療消化性病癥的藥物中的應用，所述消化性病癥尤其是由藥物引起的消化不良、慢性萎縮性胃炎、慢性胰腺炎、急性胰腺炎、由手術引起的消化性病癥(消化不良)或由囊性纖維變性引起的消化性病癥。
由纖毛目原生動物產生的用于本發明藥物中的酶非常適于治療消化性病癥。此外，包含在本發明藥物中的得自纖毛蟲類的酶和酶組合物及其制備不具有上述胰酶或得自毛鱗魚或磷蝦的酶的缺點。
酶由纖毛蟲類釋放到其周圍的培養基內。例如，表1顯示了不同酶纖毛蟲類在培養基中的酶活性。表1所示的酶活性是用文獻中描述的常規方法測定的。為了測定脂肪酶，使用偶氮酪蛋白試驗(Muricane，1986)。脂肪酶和淀粉酶的測定是通過類似于FIP有關真菌淀粉酶和微生物脂肪酶的方法進行的(Demeester等人，“Pharmaceutical En-zymes”，A.Lauwers和S.Scharpé[編者]，Marcel Dekker，NewYork，1997，第372-382頁)。為了測定酸性磷酸酶和β-氨基己糖苷酶，如Kiy等人(1996)所述，分別使用磷酸對硝基苯酯底物和對硝基苯基-N-乙酰基-β-D-葡糖胺底物。磷脂酶A1活性是用放射性酶試驗(Hartmann等人，2000)測定的。
把酶釋放到培養基中的纖毛蟲類可以以低成本在便宜的發酵培養基中以高細胞密度連續發酵。可經由灌注組件(微濾器)將酶從發酵器中過濾出來以除去細胞，因此可將酶連續地從發酵培養基中取出。可通過不斷補充便宜的營養培養基(組分脫脂乳培養基和酵母提取物)來在延長的時間內維持發酵過程。
實施例1附
圖1顯示了纖毛蟲類的分泌動物學，是用14天的發酵時間代表的。對于具有灌注組件的連續發酵，采用下列操作生物反應器系統是基于具有數字式DCU控制部件和泵部件的處理器控制的2升發酵器(Biostat MD，Braun Diessel Biotech，Melsungen，Germany)。通過灌注組件收獲不含細胞的上清液，使用槳式葉輪作為攪拌器。使用濃度為1ml/l的硅油。將攪拌器的每分鐘轉數限制為800rpm以防止破壞細胞。通過級聯控制將溶解的氧的濃度保持在60％的恒定值。選擇換氣速度作為第一優先的控制量，選擇攪拌器的每分鐘轉數作為第二優先的連續控制。通過安培O2電極(Ingeld Messtechnik，Steinbach)來測定氧濃度。通過雙壁容器和恒溫器將發酵器的溫度保持在30℃，并且在連續發酵期間，通過使用4M乙酸的DCU控制校正劑泵來將pH調控為pH7。在連續的培養期中，向發酵器中補充脫脂乳培養基，并且從發酵過程中取出含有酶的消耗的培養基。通過使用電導探針來控制的泵，將工作體積保持在2升的恒定值。經由具有孔徑為約0.3μm的膜的灌注組件收獲不含細胞的上清液以除去顆粒。灌注組件由纏繞在載體上的S 6/2聚丙烯毛細管(Enka，Wuppertal)組成，其外直徑和內直徑分別為2和1mm，并且長度為2.8m。將每單位時間交換的培養基體積定義為灌注速度。可通過蠕動泵的轉數以下述方式控制脫脂乳的補充速度，使得調節每天一個發酵器體積(2升)的灌注速度。在高壓滅菌之前，用泡沫捕集器將發酵器完全固定，加入沒有葡萄糖的1.8 l脫脂乳培養基。高壓滅菌后，經由入口泵入200ml 10％葡萄糖。在無菌柜中通過快速連接將培養基與收獲罐連起來。在無菌柜中，將接種培養基轉移到具有底部排放口的500ml Erlenmeyer燒瓶中，并經由易彎曲的管和獨立的接種片泵送到生物反應器內。
纖毛蟲類在發酵中保持未損害，這樣培養基僅含有纖毛蟲類分泌的蛋白，并不含任何細胞內組分。因此，可通過較少的色譜純化步驟將得自發酵或培養基的酶純化至高純度。
實施例2附圖2示例性顯示了用于從四膜蟲屬纖毛蟲類的培養基純化磷脂酶的柱色譜步驟。顯示了3個依次柱色譜步驟的洗脫情況。附圖2a詳細地顯示了作為步驟1的疏水相互作用色譜的洗脫情況，附圖2b顯示了作為步驟2的陰離子交換色譜的洗脫情況，附圖2c顯示了作為步驟3的尺寸排阻色譜的洗脫情況。對于隨后的色譜，使用各個前面色譜的活性級分。因此，在最后一個步驟之后，可將酶純化至幾乎完全均一(沒有外來活性、低的外來蛋白含量)。通過與該純化方案類似的方法，也可以純化其它得自纖毛蟲類的酶例如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶或β-氨基己糖苷酶。
除了一個兼性致病代表(結腸小袋蟲(Balantidium coli))以外，纖毛蟲類是自由生長的(非寄生的)非致病微生物。因此，例如文獻中(Tiedtke，1994)陳述了四膜蟲屬纖毛蟲類的GRAS狀態(“通常認為是安全的”)。此外，肯定纖毛蟲類不藏匿任何可轉移到其它生物體上的內寄生物。另外，對于在生物技術上有重要價值的纖毛蟲類例如四膜蟲屬或豆形蟲屬，不存在任何病毒或其它內寄生物。因此，可排除毒性或致熱性雜質對酶組合物的污染。
附圖3顯示了得自四膜蟲屬纖毛蟲類的培養基的3種酶在不同pH值的相對酶活性(a-磷脂酶A1，b-三酰基甘油-脂肪酶，c-β-氨基己糖苷酶)。
作為酸性水解酶，得自纖毛蟲類的酶在酸性pH具有最佳活性。附圖3顯示了得自四膜蟲屬纖毛蟲類的培養基的3種酶在不同pH值的酶活性。具體地說，呈現了磷脂酶A1的相對酶活性(附圖3a)和β-氨基己糖苷酶的相對酶活性(附圖3b)以及脂肪酶的絕對酶活性(附圖3c)。
從中可清楚看出，得自纖毛蟲類的酶的最佳pH在pH4.1至6.5之間。得自纖毛蟲類的蛋白酶甚至在低至3的pH值也表現出高的酶活性。在下表2中，顯示了與pH值有關的得自不含細胞的上清液(培養基)的纖毛蟲類蛋白酶的活性。如上所述，酶活性是通過類似于FIP有關真菌淀粉酶和微生物脂肪酶的方法測定的。
表2
因此，纖毛蟲類酶對于酸的穩定性也比胰酶強。所以，與胰酶相比，通過胃之后，它們在十二指腸中的活性要高得多。
附圖4顯示了在如胃液中存在的典型pH值(pH1.5)下作用10分鐘后，與胰酶相比，得自四膜蟲屬纖毛蟲類的蛋白酶的酸穩定性。該低的pH值是通過高體積摩爾濃度的酸性緩沖液(1M甘氨酸/HCl，pH1.5)在37℃的作用來模擬的。
權利要求
1.含有選自下列的得自纖毛蟲類的酶的藥物水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、磷酸酶。
2.按照權利要求1的藥物，其特征在于，所述酶的最佳pH為pH4-6。
3.按照權利要求1和/或2的藥物，其特征在于，所述酶源自四膜蟲屬、豆形蟲屬和草履蟲屬纖毛蟲類。
4.按照權利要求1-3任一項的藥物，其特征在于，所述藥物還含有可藥用輔料和載體。
5.按照權利要求1-4任一項的藥物，其特征在于，所述藥物呈片劑、微丸劑、油質制劑、汁液劑、凝膠劑、栓劑、膠囊、包衣片劑的形式。
6.選自下列的得自纖毛蟲類的酶在制備用于治療消化性病癥的藥物中的應用水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶和/或磷酸酶。
7.按照權利要求6的應用，其特征在于，所述消化性病癥是由藥物引起的消化不良、慢性萎縮性胃炎、慢性胰腺炎、急性胰腺炎、手術引起的消化性病癥(消化不良)或囊性纖維變性引起的。
全文摘要
本發明涉及含有得自纖毛蟲類的酶的藥物，所述酶選自水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶和磷酸酶。
文檔編號A61K9/14GK1484530SQ01821710
公開日2004年3月24日 申請日期2001年11月2日 優先權日2000年11月2日
發明者M·哈特曼, M 哈特曼 申請人:茨利安公司