生物堿的反應方法、反應產物及其應用的制作方法

專利名稱：生物堿的反應方法、反應產物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物堿和磷衍生物進行反應的方法，以及獲得的反應產物及其應用。
若將細胞抑制劑和/或制癌的磷衍生物加入生物堿中，合成的產物較起始物質毒性低，但對于某些癌細胞株具有細胞毒性。
DE 2 028 330與US 3 865 830公開了由白屈菜中選擇的生物堿及三(1-吖啶基)硫化膦(tris(1-aziridinyl)phosphinesulphide)于有機溶劑中反應而制備三胺硫磷-異奎寧的加成物。
AT 354 644與AT 377 988公開了通過與制癌的磷化合物反應以制備生物堿的磷衍生物，并利用轉換成鹽的方式，提供水溶性的型式。此方法的缺點為轉換反應產物成水溶性鹽類不完全，且反應產物的主要成分保持在不溶于水的狀態。
US 5 987 51公開了在AT 377 988及AT 354 644中公開的物質在輻射損傷治療中的應用。
上述的專利中所公開的化合物具有不同的細胞抑制活性與制癌性。生物堿的混合物，尤其是白屈菜中的總生物堿，于療效上被證實為有效的，且一些研究表明其對癌細胞治療具有藥學活性，此外，也發現所制備的化合物在臨床功效上十分重要。根據植物化學與植物療法，可假設除了個別的成份外，其反應生物堿的總混合物也具有藥學活性。
反應后，需將未反應試劑的殘留物從合成混合物中除去。由于三(1-氮丙啶基)硫化膦能溶于有機溶劑中，如苯、醚或氯仿，因此可根據現有技術所公開的方法，利用醚沖洗反應產物以從合成混合物中除去未反應的三(1-氮丙啶基)硫化膦。
為達成上述目的，本發明的制備方法，包括使生物堿或生物堿混合物與磷衍生物于有機溶劑中反應，隨后以水沖洗反應產物，其中磷衍生物優選包括至少一個氮丙啶基。該經過水洗的反應產物可隨后轉換成水溶性狀態。尤其是如果具有毒性時，磷衍生物為水溶性狀態較佳。
以水沖洗反應產物，實際上簡化了制備方法，原因在于不再需要由于醚爆炸的危險而設置復雜的安全性預防措施，因此，該制備方法可于工業規模下進行而不帶來任何問題。此外，決定藥學活性的反應產物的組份，會于沖洗步驟中改變，原因在于液態-液態分配使得水溶性成份發生溶解而從反應產物移除。令人意外的發現是，水于反應產物中還具有催化作用，并因此影響產物的結構和組成。該產物中可轉換為水溶性狀態的反應產物的量，為用有機溶劑沖洗的產物中的10至15倍。
利用水沖洗，將反應產物轉換至一個隨后便于轉換成水溶性型的狀態。此方式適用于白屈菜的生物堿以及產生于其它來源的生物堿。該制備方法適用于例如AT 377 988權利要求1所提及的生物堿與制癌磷化合物的反應，而對圖3中所示的磷衍生物，特別是含氮丙啶基的磷衍生物尤為適用。
合適的有機溶劑為可溶解反應生物堿的任何溶劑，例如，生物堿可溶于二氯甲烷或氯仿中。
生物堿的反應可于升高的溫度下進行，優選在溶劑的沸點下進行。
用水沖洗后，反應產物優選轉換成水溶性狀態，根據AT 377 988與AT 354644描述的方法，可轉換成水溶性鹽類，尤其是鹽酸鹽型式，例如，利用通過HCl氣體或加入鹽酸溶液至水洗后的反應產物有機溶液中，隨后進行鹽酸鹽沉淀出來，所得的反應產物水溶性鹽可用于注射溶液。
在本發明的一種實施方式中，以三(1-氮丙啶基)硫化膦(CAS No.52-24-4)進行反應，三(1-氮丙啶基)硫化膦于藥典中稱為噻替派(thiotepa，一種腫瘤抑制劑)，而同義字為ledertepa、onco噻替派(onco thiotepa)、TESPA、tespamin、硫代磷酰胺(thiophosphamide)、硫代-TESPA(thio-TESPA)、硫代三乙烯磷酰胺(thiotriethylenephosphoramide)、tifosyl、三氮丙啶基硫化磷(triaziridinylphosphine sulphide)、N，N’，N’-三-1，2-乙二基硫磷三胺(N，N’，N’-tri-1，2-ethanediylphosphorothioine triamide)、N，N’，N’-三乙烯硫代磷酰氨(N，N’，N’-triethylenethiophosphoramide)、三-(乙烯亞氨基)硫代-磷酰氨(tri-(ethyleneimino)thio-phosphoramide)、m-三乙烯硫代磷酰胺(m-triethylenethiophosphoramide)、m-三-(氮丙啶-1-基)硫化膦(m-tris(aziri din-1-yl)phosphine sulphide)、三乙烯基硫代磷酰銨(triethylenethiophosphoramide)、三(1-氮丙啶基)-硫化膦(tris(l-aziridinyl)phosphine sulphor)、三(乙烯一亞氨基)硫代磷酸鹽(tris(ethylene-imino)thiophosphate)、TSPA.、WR 45312。
本發明進一步的實施方式中，由白屈菜的生物堿，任選總生物堿的萃取物，于有機溶劑中與三(1-氮丙啶基)硫化膦反應，所得的反應產物可隨意存在，如一復合物，隨后以水沖洗至少一次。而且三(1-氮丙啶基)硫化膦可于水中分解，反應后未轉換的三(1-氮丙啶基)硫化膦的過剩殘留物可利用此方式由有機相中移除。較好的方式是將包含反應產物的有機溶劑水洗數次，且每一次皆須浸透水。特別優選地，重復沖洗直至過量的高毒性三(1-氮丙啶基)硫化膦完全從反應產物中除去。
此外，利用水相從合成混合物中除去會造成藥學應用上不良反應或肝硬化的毒性生物堿，或使其濃度降低。然而，以致突變測試法(Ames test，安氏試驗)測試，結果表明根據本發明所制備具體實施例的反應產物不具有致突變性。
此反應產物為生物堿，三(1-氮丙啶基)硫化膦和生物堿的高分子量反應產物，以及三(1-氮丙啶基)硫化膦分解物的復雜混合物。合成方法的結果，使得生物堿的溶解性改變，三級生物堿的濃度增加，而一種四級生物堿的濃度減少。反應產物包含一復合物，此復合物為60％至70％的白屈菜生物堿及30至40％的三(1-氮丙啶基)硫化膦反應產物。
三級白屈菜生物堿為組分的主要部分，如下列三級生物堿包含于合成混合物中白屈菜堿(chelidonine)、前鴉片堿(protopin)、次罌粟堿(stylopin)、別隱品堿(allocryptopin)、α-高白屈菜堿(α-homochelidonine)、chelamidine、chelamine、L-司巴丁(L-sparteine)、二聚體白屈菜默堿(chelidimerine)、二氫血根堿(dihydrosanguinarine)、oxysanguarine、氧化白屈菜堿(oxychelidonine)、甲氧基白屈菜堿(methoxychelidonine)。
大部分的四級白屈菜堿(如小檗堿)可通過水以液態-液態分配的方式從合成混合物中除去，在所敘述的反應條件下，小檗堿與三(1-氮丙啶基)硫化膦不會形成化合物。
本實施方式的反應產物與以醚沖洗的反應產物相比，具有較佳的藥物作用范圍，可利用編程性細胞死亡毀壞癌細胞-而與已知的細胞生長抑制劑相比-其不會攻擊到健康的細胞。這種制劑于治療上具有良好的耐受性，并且廣泛適用于預防治療。操作簡單且于治療用量上并沒有明顯的不良反應。其藥物效用是合成混合物中物質相互作用的結果。
白屈菜總生物堿的反應產物對代謝調控具有生物活性，適用于預防與治療新陳代謝疾病，如骨質疏松，而且還適用于風濕病、過敏、病毒感染、癲癇癥、多發性硬化癥、瘢痕、皮膚癌與手術后傷口。
優選白屈菜干燥根的萃取物作為合成反應的起始物質，白屈菜的根與葉及莖相比，具有較高的生物堿含量。
常規的藥物賦形劑，尤其是用溶液，如注射液或輸注液，或用軟膏、敷布或懸吊繃帶，都適用于包含了本發明反應產物的藥物。
a.25克的生物堿鹽混合物懸浮于水中并轉移到分液漏斗內，在加入100ml的二氯甲烷之后，搖晃分液漏斗，分離有機相并過濾至玻璃瓶中。
b.將1 N的NaOH(pH8-9)加入液相直到產生混濁。在加入100ml的二氯甲烷之后，搖晃混合物。隨后有機相會分離且與步驟a中的二氯甲烷相結合在一起，重復此步驟，如重復3次。有機相都過濾出來并與二氯甲烷相結合。
c.加入NaOH調整液相pH值為10，在加入二氯甲烷之后，搖晃混合物，隨后分離有機相、過濾并與其它的有機相混合。用NaOH將液相pH調整至13，并利用二氯甲烷重復萃取。
d.將結合的有機相蒸發至一油質的、棕色物質。
B.與三(1-氮丙啶基)硫化膦反應生物堿殘留物溶解于二氯甲烷中，加入三(1-氮丙啶基)硫化膦，此混合物于80℃回流2小時，在冷卻至室溫以后，澄清反應混合物。隨后進行過濾且以250ml的水于分液漏斗中沖洗濾出物數次，如3次或更多次。
C.與HCl反應將水洗的溶液轉換至玻璃燒杯中，攪拌下充入HCl氣體至飽和，鹽酸鹽復合物逐步沉淀，過濾沉淀產物且用二乙醚沖洗，干燥后溶解在水中。
在大鼠中，測定實施例1反應產物的LD50(半數致死量測試)為485mg/kg。于小鼠與大鼠中的研究表明，本發明的產物調節胸腺荷爾蒙且在移除胸腺的動物中誘導具有類似胸腺素活性的物質的合成，此效果與劑量有直接關系。此制劑于動物實驗中，可增加周圍血液中的T淋巴細胞的數量達50％(處理前4.04±0.43×109/l，處理后6.24±0.73×109/l)、調節對滲透抗原與脾臟細胞的自然殺傷性細胞活性的體液性免疫反應(198.20±17.69％，而對照組為71.50±9.10％)，且增強白血球的干擾素釋放潛能。動物試驗的結果得到了門診觀察的印證。因此，在癌癥病人中發現免疫參數得到了改善。
在預防治療及免疫的應用中，每70kg體重采用實施例1制劑5mg的劑量，在癌癥治療中，體重每20kg攝取5mg劑量較佳。
實施例2高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜以離子對反向色譜儀于剃度模式進行測定，且利用DAD檢測器以285nm進行光譜測量。相同時間下，利用參考生物堿制作色譜。此外，也進行HPLC-MSD分析，結果顯示沒有高峰從這些生物堿中分開。

圖1與圖2的HPLC圖譜基于下述的實驗數據而獲得。
色譜儀參數柱LiChrospher 60 RP Select B，5μm，125mm×4mm ID洗脫液(A)200ml(乙腈)+800ml(水)+1.5g(己磺酸(hexanesulphonic acid))+0.3ml(85％的磷酸)(B)900ml(乙腈)+100ml(水)+1.5g(己磺酸(hexanesulphonicacid))+0.3ml(85％的磷酸)梯度5分鐘等度100％A；24分鐘內達40％B1分鐘內達100％B5分鐘100％B；5分鐘利用100％A平衡檢測285nm的UV光洗脫流速1ml/min，于35分鐘后停止注入體積10μl樣品制備反應前萃取物(圖1)以超音波方式將25克的生物堿溶解在40ml的甲醇中，制成50ml且以膜過濾器過濾。
反應產物(圖2)將反應產物轉換為鹽酸鹽，以1mg/ml的濃度溶解于水中，并將pH調整至2.5至6.5。
下述的實施例描述了由實施例1方法制備化合物(以下稱之為Ukrain)的各種應用。
實施例3I及II型骨質疏松30個I及II型骨質疏松的病人接受Ukrain治療，經靜脈給藥，劑量5mg/次，濃度1mg/ml，每星期一次，治療超過10星期。利用檢測血液和生化參數，以及測量血清中促卵泡生成激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)與泌乳激素(prolactin)的濃度以監控正在進行的治療，并測量血清與尿液中的鈣與磷。在治療三個月后，所有病人在臨床表現上有改善，且生理活性增加，治療時沒有發現任何不良反應。
實施例4骨形成不全癥
14歲的女性病人，診斷為I型骨形成不全癥。X-射線圖顯示發生了彌漫骨質疏松、藍鞏膜(blue sclera)、乳齒(齒質形成不全)、圓錐形的胸腔、脊椎側凸、肌肉低血壓。經靜脈提供Ukrain治療，劑量5mg/次，每星期一次，做三個治療循環，循環間有三個月間歇。治療使肌肉功能發生重大改善；且鞏膜及牙齒變白。脊椎側凸改善，且由于較高的荷重能力，治療的物理運動程度顯著增加。病人的身體又變得均衡，體重與體型對本年齡來說變為正常。X-射線圖顯示骨結構修復；且X-射線圖中觀察不到任何骨質疏松癥狀。
實施例5脊椎關節炎一位71歲的女性病人抱怨于腰背部，于L1至L3部分有嚴重疼痛，且移動性受到限制。經靜脈提供Ukrain治療，劑量5mg/次，每星期一次，且利用敷布敷于表面超過4個星期。病人的情況獲得改善且移動性完全恢復。
實施例6皮膚病灶潰瘍形成一位7歲的男孩，于肩胛骨左部手術后的皮膚病灶有大潰瘍形成，由于瘢痕太大以致于需要整形手術。以包含Ukrain的敷布敷于表面超過12個星期，瘢痕獲得明顯的感善，潰瘍減低且無任何發炎產生。
實施例7氣喘過敏癥一位12歲的男病人，患有嚴重的過敏、咳嗽及氣喘發作。每日以Ukrain5mg的劑量治療超過3個星期，病人情況有明顯的改善，現認為已治愈。
實施例8牛乳過敏癥一位12歲的男病人，患有嚴重的牛乳過敏癥，過敏發生的原因是包含有牛乳的食品，如巧克力。經肌肉以每兩天5mg劑量的Ukrain提供治療2個星期。病人情況有明顯的改善，現認為已治愈。
實施例9對貓過敏癥一位9歲的女性病人對于貓過敏，會造成嚴重氣喘發作。以Ukrain5mg的劑量治療，每個星期兩次。病人情況具有明顯的改善且認為已治愈。
實施例10帶狀庖疹一位64歲的女性病人，診斷為帶狀庖疹感染復發，Th3-Th4部分有典型的庖疹撕裂且形成潰瘍。以Ukrain經靜脈治療，劑量5mg/次，每星期兩次，治療超過8星期。病人四年沒有再復發的情形。
實施例11C型肝炎一位患有慢性的C型肝炎的42歲男性病人，其HCV-RNA(C型肝炎病毒核糖核酸)結果呈陽性，且HCV基因型(病毒基因型)為1b，病人抱怨疲倦、且伴隨著疼痛，體力虛弱。以Ukrain經靜脈給藥，劑量5mg/次，每星期兩次，治療超過5星期。治療的結果為，病人感覺不再疼痛，且整體情況獲得改善，體力增進，病人如今的HCV-RNA結果呈陰性。
實施例12過敏病人A.N.，12歲，患有嚴重的過敏發作，伴隨咳嗽并有氣喘。口服Ukrain，劑量5mg/天，4星期治療之后，病人有顯著改善且發作減少。
實施例13手術后的傷口(皮膚病灶潰瘍)病人S.D.，7歲，手術后于左肩部位有大的皮膚潰瘍，此皮膚潰瘍太大而需要整形重建。以Ukrain敷布局部治療3個月。皮膚潰瘍大面積減少，并且沒有潰瘍，也沒有發炎。
實施例14骨質疏松病人H.J.，68歲，行走困難、疲勞，通過臨床與實驗室研究，診斷為I型骨質疏松。以Ukrain經靜脈治療，劑量5mg/星期，10星期后，病人主觀上認為有改善，且實驗室結果證實骨密度、鈣及荷爾蒙的水平都有明顯的改變。
實施例15帶狀庖疹病人K.R.，37歲，7歲時患有水痘，如今沿著肋骨有典型的皮膚疼痛發疹-帶狀庖疹(Herpes zoster)。以Ukrain經靜脈治療，劑量5mg/次，每星期兩次，共4星期。病人6年內沒有再復發。
實施例16B型肝炎病人G.H.，48歲，虛弱、疲勞、活力減少，通過臨床與實驗室的研究，診斷為慢性B型肝炎，HBs-Ag(表面抗原)為陽性反應，血液中酶增加。以Ukrain經靜脈治療，劑量5mg/次，每星期一次，共三個月。病人主觀上認為改善且活力增加，實驗室實驗結果顯示病毒負荷量(viral load)明顯減少，且酶含量恢復正常化。
實施例17風濕病，骨關節炎病人I.N.，71歲，于L1-L3部位患有嚴重背痛，且移動性受限制，通過臨床與實驗室的研究，診斷為骨關節炎(關節退化)。治療以Ukrain經靜脈治療，劑量5mg/次，每星期兩次，治療6星期。病人疼痛明顯減低，與參考范圍相比，移動范圍增加。
實施例18癲癇癥病人D.R.，46歲，患有復雜性局部癲癇發作，且癥狀有惡化傾向。然而用高劑量的苯妥英(phenytoin)會伴隨有腺病的副作用。以Ukrain經靜脈治療，劑量10mg/次，每星期兩次，治療6星期，觀察到癥狀減輕相當多，發作稀少且診斷減少。可減少施用抗癲癇藥的劑量。
實施例19多發硬化癥病人M.G.，36歲，感覺腿部無名虛弱，且隨后會有頭昏現象，發病的間隔變短，研究后診斷為多發硬化癥，使用物理治療不成功。經靜脈以Ukrain治療，劑量5mg/次，每星期兩次，共4個月。病人發作的間隔變長，感覺腿更有力且不會頭昏。
實施例20瘢痕病人I.N.，腹部手術后于腹部上留下較大硬瘢痕。經靜脈以Ukrain治療，劑量5mg/次，每星期兩次，共4星期，并配合局部敷布，有明顯的修飾效果。
實施例21流行性感冒病人B.N.，24歲，周年流行性感冒，于一些情況下還會伴隨肺炎。用Ukrain作預防處理，經靜脈用藥，劑量5mg/次，每星期兩次，在流行病發生期之前總劑量為50mg。此病人如今四年沒有患過疾病。
實施例22II型糖尿病病人B.L.，62歲，患有II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)，每日使用10mg劑量的格列吡嗪(glipizide)(包含磺酰尿的抗糖尿病藥物)治療，病人顯示高血壓、不論如何節食都超重、不耐煩、容易疲勞且活力低等癥狀。以Ukrain進行靜脈內治療，劑量5mg/次，每星期兩次。治療2個月后，病，人整體的情況獲得改善，活力增加，體重減少。逐漸地中斷格列吡嗪，病人感覺良好。
實施例23復原病人O.L.，74歲，左髖關節骨折。在持續數小時的植入關節大手術后，病人臥床，靜脈注射Ukrain，劑量5mg/次，每星期兩次，治療6個星期后，整體的情況獲得改善，復原時間明顯縮短。
實施例24巧克力過敏癥病人V.P.，8歲，對巧克力過敏。口服Ukrain，劑量5mg/次，每星期3次，治療4星期，沒有進一步的過敏發生。
實施例25復原病人J.R.，78歲，接受膽石及膽囊炎(膽囊切除)外科手術。手術后，口服Ukrain5mg/次，每星期3次，治療2星期。病人復原快速且少痛苦，并且無任何的并發癥。病人比預期更快地離開了醫院。
實施例26痔瘡病人J.N.，64歲，于典型的3及7點鐘位置患有外部疼痛的痔瘡，且糞便中帶血。施用含有0.5％Ukrain的栓劑，每日一次整夜治療，持續用藥兩星期。病人痔瘡縮小，且兩年內沒有更多的疼痛。
實施例27痤瘡病人R.G.，14歲，患有孩童型痤瘡/青春痘(Acne Juvenilis)，進行了超過4個月的阻礙療程。施用包含0.1％Ukrain的藥膏，每日兩次，治療10天后，痤瘡永久脫除。
實施例28扁桃腺炎病人H.D.，10歲，患有扁桃腺炎，伴隨咽喉疼痛，吞咽困難，且發燒至38.2°。扁桃體上包覆有白色薄層。服用口服Ukrain溶液5ml，每日兩次，在治療5天后，病人完全康復。
即使使用AT377988中公開的化合物在某些案例中功效較小，但實施例3-25中所有的應用都是成功的。
權利要求
1.一種生物堿的反應方法，包括以下步驟(a)至少一種生物堿與包含至少一個氮丙啶基的磷衍生物于有機溶劑中在升高的溫度下進行反應，制備反應產物，且(b)沖洗由步驟(a)所得的反應產物，其特征在于，在步驟(b)中用水沖洗反應產物。
2.根據權利要求l或2所述的方法，其特征在于，所述升高的溫度為溶劑的沸點。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磷衍生物為三(1-氮丙啶基)硫化膦。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物堿選自包含于白屈菜(Chelidonium majus L.)中的生物堿。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，反應使用生物堿混合物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，反應使用白屈菜(Chelidonium majus L.)的全部生物堿混合物。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述溶劑為二氯甲烷。
8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反應產物在沖洗步驟之后轉換成鹽類，尤其是水溶性鹽類。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述鹽類為氯化物。
10.根據權利要求1或2所述的方法得到的反應產物。
11.根據權利要求10所述的反應產物，其特征在于，所述的反應產物為混合物，其包含生物堿、生物堿及磷衍生物的反應產物，以及磷衍生物的分解物。
12.根據權利要求10所述的反應產物，其特征在于，所述的反應產物為混合物，其包含生物堿、生物堿及三(1-氮丙啶基)硫化膦的反應產物，以及三(1-氮丙啶基)硫化膦的分解物。
13.根據權利要求10所述的反應產物，其特征在于，該反應產物包含至少一種生物堿，該生物堿選自白屈菜堿、前鴉片堿、次罌粟堿、別隱品堿、高白屈菜堿、血根堿、chelamidine、chelamine、L-司巴丁或氧化白屈菜堿。
14.根據權利要求10所述的反應產物在制備用于預防及治療選自癌癥、免疫疾病與新陳代謝疾病或有機障礙的藥物中的應用。
15.根據權利要求14所述的應用，其特征在于，所述的疾病選自過敏、骨質疏松、皮膚癌、病毒感染、風濕病、瘢痕、手術后傷口、癲癇與多發性硬化癥中的一種或多種。
全文摘要
本發明涉及一種生物堿的反應方法,將磷衍生物加入一含有生物堿的有機溶液中,隨后將此包含生物堿反應產物及磷衍生物未反應殘留物的有機溶液以水沖洗,所得的反應產物可做為藥劑使用。
文檔編號A61P17/02GK1422859SQ02151338
公開日2003年6月11日 申請日期2002年11月15日 優先權日2001年11月15日
發明者挪威奇·華茲 申請人:挪威奇·華茲