Vii因子多肽和ix因子多肽的聯合應用的制作方法

專利名稱：Vii因子多肽和ix因子多肽的聯合應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的藥物組合物。本發明還涉及用于治療出血發作的、由多部分組成的試劑盒，其含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品。本發明還涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品用于制備藥物的用途。另外，本發明涉及治療出血、縮短凝血時間、增強止血、減少完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥次數、減少完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥量、延長血塊裂解時間、增加血塊強度和增強血纖蛋白塊形成的方法。
背景技術：
血液凝結因子VII(FVII)是血漿凝結因子。活化的VII因子(FVIIa)通過與因血管壁受損而暴露在外的組織因子(TF)形成復合物來起始正常的止血過程，隨后，將IX和X因子(FIX和FX)激活為其活化形式，即IXa和Xa因子(FIXa和FXa)。在攜有組織因子的細胞上，Xa因子將有限量的凝血酶原轉變為凝血酶。凝血酶活化血小板，并將V和VIII因子活化為Va和VIIIa因子(FVa和FVIIIa)，在隨后的過程中，這兩種輔因子導致凝血酶完全裂解。該過程包括由(與VIIIa因子形成復合物的)IXa因子產生Xa因子，且發生于活化的血小板表面。凝血酶最終將血纖蛋白原轉變為血纖蛋白，導致形成血纖蛋白塊。
VII因子主要作為單鏈酶原存在于血漿中，由FXa將其裂解為雙鏈的活化形式FVIIa。已將重組的活化VIIa因子(rFVIIa)開發成前止血劑。給因抗體形成而不能用凝結因子產物治療的出血的血友病受試者施用rFVIIa可提供快速而高效的前-止血反應。FVIIa可成功治療VII因子缺乏的出血受試者或雖具有正常凝結系統但遭遇過度失血的受試者。在這些研究中，未遇到rFVIIa不利的副作用(特別是血栓栓塞的出現)。
血液凝結因子IX(IX因子)是參與活化X因子(FX)的血漿凝結因子。血流中IX因子的存在量或活性的降低會導致B型血友病。IX因子活性降低的水平與疾病的嚴重程度直接成比例。目前的B型血友病療法就是用得自血漿的或重組的IX因子重新替換缺失的蛋白質(即所謂的FIX替代或替換療法)。
凝結因子缺乏(例如FIX缺乏)反映了不同類型的基因缺損。當基因損害較嚴重時，例如存在缺失或移碼時，無法產生mRNA，會導致凝結因子(嚴重)缺乏。由例如非關鍵位置的點突變引起的較輕的基因損害導致生物活性有所降低的蛋白質的分泌。遺傳模式是隱性的和X-連鎖的，這意味著只有具有一個X-染色體的男人才會受影響。凝結缺損的嚴重性可以是輕度或重度。嚴重性取決于血漿中正常起作用的IX因子的濃度。替換療法的目的是將患者的凝血因子活性水平(下文稱之為“因子水平”)升高至能恢復止血的水平，并且能維持該水平直至實質上完全愈合。如果有效治療開始得晚，將有損于傷口愈合，并且需要比平常更多的治療。治療的量取決于止血所需凝結因子的血漿濃度，血液的重獲和轉輸物質的半壽期。
在一些基因缺損為雜合型的受試者(例如身為疾病載體的女人)中，IX因子的水平也可能會或多或少地降低。此類受試者出血的傾向性增加，與病情輕微的血友病患者差不多，因此，也可以對其進行治療。
一些接受IX因子替換療法的患者(患有B型血友病)產生了抗施用的IX因子的抗體。然而，出生時IX因子水平正常的人(未患有先天性的IX因子-缺乏癥)在以后的日子里會因不明原因產生抗IX因子的自身抗體(獲得性B型血友病)。在這兩種情況下，抗體可以以低、適中或高滴度存在。對于具有低或適中抑制劑-滴度的患者而言，有時可以用IX因子進行治療。
血友病以各種各樣的嚴重程度出現。檢測不到IX因子或IX因子低于1％的患者通常病情嚴重，微小的創傷會導致血液流入肌肉和關節，有時明顯是自發性出血。少量IX因子能提供相當大的保護作用，通常會使IX因子為正常水平的1-5％的患者僅在創傷后出血，而且血液流入肌肉和關節的情況也不嚴重等，通常認為患者病情為中度。IX因子超過5％的患者通常僅在大的創傷或手術后出血，可以認為患者病情較輕。必須認識到對個別的病例而言，上述分類并不總是正確的。一些IX因子水平很低的患者很少出血，而另一些IX因子超過5％的患者卻會反復出血，血液流入起初因創傷性關節積血而受損的“靶關節”中，看上去病情較嚴重。然而，一般說來，因子水平越高，出血癥狀越不明顯，IX因子水平超過正常水平的35-40％時，一般不會出現異常出血。下文顯示了因子水平和B型血友病癥狀之間的一般性關系。
與IX因子水平相關的血友病嚴重程度嚴重程度 因子水平(為正常水平的％) 表現類型重度 0-1 明顯自發性出血。嚴重出血中度 1-5 出血較少。關節積血主要為創傷性出血輕度 5-30創傷后、手術后、拔牙后出血。較少發作目前的B型血友病療法就是用得自血漿的或重組的IX因子替換缺失的蛋白質。使用IX因子產品進行靜脈內輸注(用于注射)以緊急治療急性出血。出血類型分類如下1.關節積血(關節中出血)2.威脅生命和四肢的出血(腹膜后出血、CNS出血、咽后出血、伴有隔間綜合征的肌肉出血和大量GI出血)3.與手術(矯形、選擇操作、緊急手術)有關的出血預防經驗表明如果IX因子水平維持在超過正常水平的30-40％，直至完全愈合的話，通常即可維持正常的止血。然而，其它考慮也是至關重要的。腹部手術后受影響部位(如積血關節)的移動、咳嗽或走動可促進出血。自然療法或操作法需要相當高的水平，而固定輕微損害能以相對低的因子水平控制出血。在不同情況下欲達到的靶水平大致如下所示治療標準的關節積血(第1類)正常的目的是使IX因子的起始血漿濃度達到正常水平的至少20-30％，接著，使血漿濃度為正常水平的至少10-20％達2至3天。
治療威脅生命和四肢的出血(第2類)正常的目的是使IX因子的起始血漿濃度達到正常水平的至少40％，接著，使血漿濃度為正常水平的至少10-20％達1周。
與手術有關的出血預防(第3類)正常的目的是使手術當天的IX因子血漿濃度達到正常水平的至少55-80％，接著，從第2至第7天，使血漿濃度為正常水平的至少20-30％，再將血漿濃度持續保持為正常水平的至少10-20％達1至2周。
根據上述治療方針，以下可以說是與出血類型有關的IX因子注射次數。
IX因子的平均血漿半壽期為18-24小時，在臨床實踐中，每次出血發作通常使用的IX因子平均注射次數如下關節積血(關節中出血)家庭治療，輕微關節積血1-3次注射；醫院治療，較嚴重的關節積血6-14次注射。
威脅生命和四肢的出血10-20次注射。
與手術有關的出血預防30-40次注射。
在血友病的臨床治療中，目前使用FVIIa制止具有FVIII或FIX抑制劑(能妨礙替換療法)的患者出血。然而，由于預期VIIa因子比IX因子短的半壽期(2.5小時∶18-24小時)可能需要更頻繁的VIIa因子注射才能維持某一水平的止血能力，因此，臨床醫生一般不使用FVIIa作為不含抑制劑的血友病患者(分別可以使用FVIII或FIX對其進行治療)的一線治療藥物。
歐洲專利號225.160(Novo Nordisk)涉及FVIIa組合物以及治療不是由凝結因子缺乏或凝結因子抑制劑引起的出血紊亂的方法。
歐洲專利號82.182(Baxter Travenol Lab.)涉及可用于對抗受試者的血液凝結因子缺乏或血液凝結因子抑制劑的作用的VIIa因子組合物。
Lusher等，Haemophilia，1998，4，PP.790-798涉及施用重組VIIa因子以治療含和不含抑制劑的A型和B型血友病患者的關節、肌肉和粘膜出血。
Kjalke等，Thrombosis and Haemostasis，1999(Suppl)，0951涉及施用額外的外源性FVIIa，及其在模擬A型或B型血友病的模型系統中，對活化的血小板表面的凝血酶形成的作用。
美國專利號5891,843(Immuno)涉及與具有FEIB-活性的第二種成分，如活化的凝血酶原復合物或FEIBA制品混合的FVIIa組合物。
目前，治療血友病所用的很多IX因子產品含有重組產生的IX因子。然而，所述產品也可以分離自人或豬血漿。這些純化的產品經常含有較少量的其它凝結因子或其它的血漿成分。通常，所述其它的血漿成分是不必要的(因為存在病毒感染或其它污染的風險)，據認為，用重組蛋白質(例如VIIa因子)部分替代這種產品可以改善組合物和治療，并且有利于患者。
目前，一般在止血之前幾次注射或輸注IX因子來治療經受出血發作的、IX因子水平降低的受試者(例如B型血友病患者)。此外，需要多次注射以維持止血直至導致出血的傷口完全愈合。
一般用大輸注量的液體，如靜脈內(i.v.)用的液體、注射膠體輸注產品、白蛋白、紅血細胞濃縮物等來治療出血過多的創傷受害者。需要大量輸血的過量出血可導致產生多器官衰竭，包括肺和腎功能受損。
較快地停止出血對這些受試者而言有著重要的益處。所以要減少停止出血并維持止血所需的注射次數和或減少停止出血并維持止血所用的凝結蛋白質的量。
在本領域中，仍需改善對經受出血發作的受試者，包括因凝結因子IX的水平降低而導致出血發作的受試者的治療。本領域仍需要改善的、可靠的和應用廣泛的方法，用于增強凝結、增強或確保穩定止血栓形成、提高對所治療的受試者的便利性、或使受試者，特別是凝血酶產生受損的受試者獲得完全或充分止血。仍需要獲得完全或充分止血所需的FVIIa的量或FIX的量有所減少的方法。還需要獲得完全或充分止血所需的凝結因子蛋白質的總量有所減少的方法，和停止出血所需的時間縮短的方法。
發明簡述本發明的一個目的是提供組合物，所述組合物可有效用于治療或預防出血發作和凝結紊亂。
本發明的第二個目的是提供單一劑量形式的組合物，所述組合物可有效用于治療或預防出血發作或用作前促凝劑。本發明的另一個目的是提供表現出協同作用的組合物、治療方法或試劑盒。
本發明的另一個目的是提供基本上不表現出副作用，如凝結系統高水平的全身性活化的組合物、治療方法或試劑盒。
通過閱讀本說明書的描述，本發明的其它目的是顯而易見的。
第一方面，本發明涉及含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的藥物組合物。
第二方面，本發明涉及含有治療出血發作的藥物的、由多部分組成的試劑盒，其含有a)以第一種單位劑量形式存在的、有效量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和藥物可接受載體；b)以第二種單位劑量形式存在的、有效量的IX因子或IX因子-相關多肽制品和藥物可接受載體；和c)含有所述第一和第二種劑量形式的容器裝置。
另一方面，本發明涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備治療受試者出血發作的藥物的用途。
另一方面，本發明涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備縮短凝血時間的藥物的用途。
另一方面，本發明涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備延長血塊裂解時間的藥物的用途。
另一方面，本發明涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備增加血塊強度的藥物的用途。
另一方面，本發明涉及治療受試者的出血發作的方法，所述方法包括給需要治療的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效治療出血。
另一方面，本發明涉及縮短受試者的凝血時間的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效縮短凝血時間。
另一方面，本發明涉及增強受試者止血能力的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強止血。
另一方面，本發明涉及減少使受試者停止出血并維持止血所需凝結因子蛋白質的給藥次數的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效停止出血和維持止血。
另一方面，本發明涉及減少使受試者停止出血并維持止血所需凝結因子蛋白質的給藥量的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效停止出血和維持止血。
另一方面，本發明涉及使受試者的血塊裂解時間延長的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效延長血塊裂解時間。
另一方面，本發明涉及增加受試者的血塊強度的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增加血塊強度。
另一方面，本發明涉及增強受試者的血纖蛋白塊形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強血纖蛋白塊形成。
另一方面，本發明涉及含有治療出血發作的藥物的、由多部分組成的試劑盒，其含有a)以一個單位劑量形式存在的、有效量的VII因子或VII因子-相關多肽和有效量的IX因子或IX因子-相關多肽制品和藥物可接受載體；和b)含有所述一個單位劑量形式的容器裝置。
在本發明的一系列實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子-相關多肽。在另一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子多肽。在本發明的一系列實施方案中，所述VII因子-相關多肽是VII因子氨基酸序列變體。在一個實施方案中，當按照本說明書中描述的“體外水解試驗”檢測時，VII因子-相關多肽的活性與天然人VIIa因子(野生型FVIIa)的活性之間的比率至少約為1.25。
在本發明的一系列實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子多肽。在一個實施方案中，VII因子是人VII因子。在一個實施方案中，VII因子是牛、豬、犬、馬、鼠或鮭魚的VII因子。在另一個實施方案中，VII因子多肽是重組VII因子。在另一個實施方案中，VII因子多肽是得自血漿的VII因子。在另一個實施方案中，VII因子多肽是得自血漿的人VII因子。在另一個實施方案中，VII因子多肽是重組人VII因子。在本發明的一系列實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽為其活化形式。在本發明的一個實施方案中，VII因子多肽是重組人VIIa因子。
在本發明的一系列實施方案中，IX因子或IX因子-相關多肽是IX因子-相關多肽。在一個實施方案中，IX因子-相關多肽是IX因子氨基酸序列變體。在一個實施方案中，當按照本說明書中描述的“生色試驗”檢測時，IX因子-相關多肽的活性與天然人IX因子(野生型FIX)的活性之間的比率至少約為1.25。在一個實施方案中，IX因子或IX因子-相關多肽是IX因子多肽。在一個實施方案中，IX因子是人IX因子。在一個實施方案中，IX因子是牛、豬、犬、馬、鼠或鮭魚的IX因子。在另一個實施方案中，IX因子多肽是重組的IX因子。在另一個實施方案中，IX因子多肽是得自血漿的IX因子。在另一個實施方案中，IX因子多肽是得自血漿的人IX因子。在另一個實施方案中，IX因子多肽是重組人IX因子。在本發明的一系列實施方案中，IX因子或IX因子-相關多肽為其活化形式。
在一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽以質量比約為100∶1至1∶100VII因子∶IX因子的比率存在。
在一個實施方案中，VII因子-相關多肽是氨基酸序列變體，與野生型VII因子(即具有美國專利號4,784,950中公開的氨基酸序列的多肽)相比，所述變體有不超過20個的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一個實施方案中，VIIa因子變體有不超過15個的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一個實施方案中，VII因子變體有不超過10個的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一個實施方案中，VII因子變體有不超過8個的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一個實施方案中，VII因子變體有不超過6個的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一個實施方案中，VII因子變體有不超過5個的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一個實施方案中，VII因子變體與野生型VII因子相比，有不超過3個的氨基酸被取代、缺失或插入。在一個實施方案中，VII因子變體選自L305-FVIIa，L305V/M306D/D309S-FVIIa，L305I-FVIIa，L305T-FVIIa，F374P-FVIIa，V158T/M298Q-FVIIa，V158D/E296V/M298Q-FVIIa，K337A-FVIIa，M298Q-FVIIa，V158D/M298Q-FVIIa，L305V/K337A-FVIIa，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII和S336G-FVII。
另一方面，與天然人凝結因子VIIa相比，VII因子或VII因子-相關多肽具有增加的不依賴于組織因子的活性。另一方面，增加的活性并不伴隨著底物特異性的改變。在本發明的另一方面，VII因子或VII因子-相關多肽與組織因子的結合應該未受損害，當與組織因子結合時，VII因子或VII因子-相關多肽應該至少具有野生型VIIa因子的活性。
在一個優選的實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽是重組人VIIa因子和重組人IX因子。
在一個實施方案中，哺乳動物血液的凝血時間縮短。在另一個實施方案中，哺乳動物血液中的止血增強。在另一個實施方案中，哺乳動物血液中的血塊裂解時間延長。在另一個實施方案中，哺乳動物血液的血塊強度增加。在另一個實施方案中，哺乳動物血液中的血纖蛋白塊形成有所增強。在一個實施方案中，哺乳動物血液是人血液。在另一個實施方案中，哺乳動物血液是正常的血液；在另一個實施方案中，哺乳動物血液是具有正常水平的凝結因子蛋白質的血液；在另一個實施方案中，哺乳動物血液是具有正常水平的IX因子的血液；在另一個實施方案中，血液是正常的人血液；在另一個實施方案中，血液是凝血酶產生受損的受試者的血液。在一個實施方案中，血液是缺乏一種或多種凝結因子的受試者的血液；在另一個實施方案中，血液是含有抗一種或多種凝結因子的抑制劑的受試者的血液。在一個實施方案中，血液是血纖蛋白原濃度有所降低的受試者的血液。在一個實施方案中，血液是IX因子-缺乏的人血液。
在本發明的一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽是所使用的唯一的止血劑。在另一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽是所使用的唯一有活性的止血劑。在另一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽是所使用的唯一的凝結因子。在本發明的一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽是所使用的唯一有活性的藥劑。本文所用的“唯一的”藥劑或因子指的是以下情況，其中VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽合起來是藥物組合物或試劑盒中所含的、可以使用的僅有的止血劑、有活性的止血劑或凝結因子，或是在特定療程，如特定出血發作療程中可用于給患者施用的僅有的止血劑、有活性的止血劑或凝結因子。應理解這些情況還包括可使用的其它止血劑或凝結因子不以足以顯著影響一個或多個凝結參數的量或活性存在的情況。
在另一個實施方案中，將藥物組合物配制成供靜脈內給藥使用。在一個實施方案中，組合物還含有藥物可接受的賦形劑。
在本發明的一個實施方案中，組合物是單一劑量形式，其中單一劑量形式含有兩種凝結因子。在本發明的一個實施方案中，組合物為由多部分組成的試劑盒形式，其含有VII因子或VII因子-相關多肽制品作為第一種單位劑量形式，含有IX因子或IX因子-相關多肽制品作為第二種單位劑量形式，并含有包含所述第一和第二種劑量形式的容器裝置。在一個實施方案中，可以使用的組合物或試劑盒還分別含有施用組合物或獨立組分的說明。
在本發明的一個實施方案中，以單一劑量形式施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。在本發明的一個實施方案中，以含有VII因子或VII因子-相關多肽制品的第一種單位劑量形式和含有IX因子或IX因子-相關多肽制品的第二種單位劑量形式施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。
在本發明的一個實施方案中，同時施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。在另一個實施方案中，依次施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。在一個實施方案中，以不超過15分鐘，優選為10，更優選為5，更優選為2分鐘的時間間隔施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。在一個實施方案中，以2小時，優選為1至2小時，更優選為1小時，更優選為30分鐘至1小時，更優選為30分鐘，更優選為15至30分鐘的時間間隔施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。
在一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽的有效量為約0.05mg/天至約500mg/天(70-kg受試者)。在一個實施方案中，IX因子或IX因子-相關多肽制品的有效量為約0.01mg/天至約500mg/天(70-kg受試者)。
在一個實施方案中，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽以質量比約為100∶1至1∶100VII因子∶IX因子的比率存在。
在本發明的一個實施方案中，藥物組合物為單一劑量形式，它實質上由VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品，以及一種或多種選自藥物可接受賦形劑或載體，穩定劑，去污劑，中性鹽，抗氧化劑，防腐劑和蛋白酶抑制劑組成。
在另一個實施方案中，受試者是人；在另一個實施方案中，受試者的凝血酶產生受損；在一個實施方案中，受試者的血纖蛋白原的血漿濃度有所降低(例如多次輸血的受試者)；在一個實施方案中，受試者的IX因子的血漿濃度有所降低。
在一個實施方案中，藥物組合物用于家庭治療。
另一方面，本發明涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療患有IX因子-反應性綜合征的受試者的出血。
另一方面，本發明涉及VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療IX因子水平有所降低的受試者的出血。
另一方面，本發明涉及與用IX因子作為唯一的凝結蛋白質來治療患有IX因子反應性綜合征的受試者時相比，能增強所述受試者的止血能力的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強止血。
另一方面，本發明涉及與用IX因子作為唯一的凝結蛋白質來治療IX因子水平有所降低的受試者時相比，能增強所述受試者的止血能力的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強止血。
另一方面，本發明涉及增強受試者的凝血酶形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強凝血酶形成。
另一方面，本發明涉及與用IX因子作為唯一的凝結蛋白質來治療患有IX因子反應性綜合征的受試者時相比，能增強所述受試者的凝血酶形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強凝血酶形成。
另一方面，本發明涉及與用IX因子作為唯一的凝結蛋白質來治療IX因子水平有所降低的受試者時相比，能增強所述受試者的凝血酶形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強凝血酶形成。
另一方面，本發明涉及與以IX因子作為唯一的凝結蛋白質施用給患有IX因子反應性綜合征的受試者時所需的給藥次數相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥次數的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效減少凝結因子蛋白質的給藥次數。
另一方面，本發明涉及與以IX因子作為唯一的凝結蛋白質施用給IX因子水平有所降低的受試者時所需的給藥次數相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥次數的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效減少凝結因子蛋白質的給藥次數。
另一方面，本發明涉及與以IX因子作為唯一的凝結蛋白質施用給患有IX因子反應性綜合征的受試者時所需的給藥量相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥量的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效減少凝結因子蛋白質的給藥量。
另一方面，本發明涉及與以IX因子作為唯一的凝結蛋白質施用給IX因子水平有所降低的受試者時所需的給藥量相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥量的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效減少凝結因子蛋白質的給藥量。
另一方面，本發明涉及治療患有IX因子反應性綜合征的受試者的出血的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效治療出血。
另一方面，本發明涉及治療IX因子水平有所降低的受試者的出血的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效治療出血。
在一個實施方案中，受試者具有水平有所降低的IX因子。在一個實施方案中，受試者患有IX因子反應性綜合征。在一個實施方案中，IX因子反應性綜合征是B型血友病。
在一個實施方案中，降低的IX因子水平為正常水平的90％或以下，在另一個實施方案中，IX因子水平為正常水平的80％或以下，在另一個實施方案中，為50％或以下，在另一個實施方案中，為40％或以下，在另一個實施方案中，為30％或以下，在另一個實施方案中，為20％或以下，在另一個實施方案中，為10％或以下，在另一個實施方案中，為5％或以下，在另一個實施方案中，為2％或以下。適當時，術語可互換使用。在優選的實施方案中，IX因子水平為正常水平的30％以下。
另一方面，本發明涉及治療患有IX因子反應性綜合征的受試者的出血的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效治療出血。
在一個實施方案中，VII因子是人重組VIIa因子(rFVIIa)。在另一個實施方案中，rFVIIa是NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
在一個實施方案中，IX因子是人重組IX因子(rFIX)。在另一個實施方案中，IX因子產品是BeneFix(AHP/Genetics Institute)，Mononine(Aventis)，Proplex(Baxter)，Bebulin VH(Baxter)，FACTEUR IX-LFB(Laboratoire Francaisdu Fractionnement et des Biotechnologies(LFB))，Immunine(Baxter/Immuno)，Octanyne(Octapharma)，Octanine F(Octapharma)，Mono FIX-VF(CSL)，NovactM(Kaketsuken)。
在一個實施方案中，將藥物組合物配制成靜脈內給藥。在一個實施方案中，組合物還含有纖溶系統的抑制劑，包括但不限于抑蛋白酶肽、ε-氨基己酸或凝血酸。


圖1圖1顯示了缺乏和存在FIX時，rFVIIa縮短凝血時間的效果。
發明詳述與未遭受任何出血的受試者相比，因手術或嚴重創傷而出血過多因此需要輸血的受試者會產生更多的并發癥。然而，如果需要施用人血液或血液制品(用于治療凝結因子缺乏的血小板、白細胞、得自血漿的濃縮物等)，這會有轉移人病毒(例如肝炎病毒、HIV、細小病毒或其它迄今為止仍不為人所知的病毒)以及非病毒病原體的風險，因此，中度出血也會導致并發癥。需要大量輸血的過度出血可導致產生多器官衰竭，包括肺和腎功能受損。一旦受試者產生這些嚴重的并發癥，就會引起與多個細胞因子和炎性反應有關的級聯事件，使得任何治療都變得十分困難，而且不幸地是，所述治療經常不能成功。因此，手術以及治療嚴重組織損傷的主要目的是避免出血或使出血量最少。為了避免或最少化不合乎需要的出血，重要的是確保形成穩定和固體狀的止血栓，所述止血栓不易于被纖溶酶溶解。另外，重要的是確保快速而有效地形成止血栓或血塊。
患有血小板減少癥(血小板的數目減少或活性降低)的受試者凝血酶產生受損，并且血纖蛋白栓的穩定性較差，導致止血栓易于過早溶解。另外，遭受嚴重創傷或器官損害，因此需頻繁輸血的受試者的血小板數目降低，血纖蛋白原、VIII因子和其它凝結蛋白的水平也會降低。這些受試者的凝血酶產生受損(或減少)。因此，這些受試者的止血功能有缺陷，或止血效果較差，導致形成易于過早被蛋白酶溶解的血纖蛋白栓，在以深度創傷和器官損害為特征的情況下，所述酶還會大量釋放。
遭遇大量失血的患者在臨床上不穩定。所述患者有遭受心房纖維性顫動的風險，這會導致心臟活性的致命性停止；腎功能受損；或肺部液體外滲(所謂的“濕肺”或ARDS)。
組織出血也可導致血腫的形成。(特別是頭內和脊髓)血腫的大小與神經功能喪失的程度、康復困難、和/或康復后的永久性神經功能損傷的嚴重性和程度密切相關。當血腫位于腦部時，結果最為嚴重，甚至會導致患者死亡。所謂的區室綜合征是由體內嚴重出血流至肢端而導致的臨床病癥。在胳膊和腿中，肌肉和骨的外部受被稱為筋膜的幾乎無彈性的膠原層束縛。受筋膜束縛的腔隙出血導致該區室的壓力增加，繼而壓迫神經、血管和肌肉組織，如果得不到及時治療即會導致大面積組織壞死。壞死組織一旦形成，即會在治愈過程中在很大程度上轉化至與原先的肌肉組織相比有所收縮的結締組織。這種攣縮使受試者受影響關節易于遭受運動性損害，又會需要矯正手術。嚴重血腫還會導致假囊腫形成，假囊腫看上去象良性腫瘤，因為這種腫瘤樣囊腫侵蝕受影響的肌肉或骨組織。需要進行手術以除去這種假囊腫。
血腫的形成還增加了受試者被感染的頻率。輸入血液制品，如紅血細胞也是如此。輸入紅血細胞導致在受試者體內形成抗體的風險。當已形成抗血型抗原的抗體時，就很難給受試者輸血，因為尋找合適血型的難度將會不斷增加。
因此，治療出血的主要目的是以最短的時間達到止血，從而使血液的損失最少。
因此，本發明提供了用于給需要治療的受試者治療出血發作的有益的組合物、用途和方法。所述組合物、用途和方法與有益的效果有關，例如在止血之前血液損失較小，手術過程中需要的血液較少，能將血壓維持在可接受的水平直至止血，血壓能較快地穩定下來，經治療患者的恢復時間較短，經治療患者的康復時間較短，減少血腫形成或形成較小的血腫，包括腦部血腫，較少形成假囊腫，較少形成肌肉攣縮，較快停止出血，停止出血并維持止血所需的注射次數減少，停止出血并維持止血所用凝結蛋白的量減少。
與單獨施用VIIa因子或IX因子時的凝血時間相比，聯合施用VII因子或VII因子-相關多肽，如VIIa因子制品與IX因子或IX因子-相關多肽制品提供了較短的凝血時間。
與單獨施用VIIa因子或IX因子時的蛋白質用量相比，聯合施用VII因子或VII因子-相關多肽，如VIIa因子制品與IX因子或IX因子-相關多肽制品使需要這種治療的受試者停止出血并維持止血所用凝結因子的總量減少。
與單獨施用VIIa因子或IX因子時的情況相比，聯合施用VII因子或VII因子-相關多肽，如VIIa因子制品與IX因子或IX因子-相關多肽制品使停止出血所需的時間縮短，并使維持止血所需的注射次數減少。與單獨施用IX因子或VIIa因子時的情況相比，聯合施用VII因子或VII因子-相關多肽，如VIIa因子制品與IX因子或IX因子-相關多肽制品使確保完全止血所需的注射次數減少。
對于患有B型血友病的患者而言，本發明提供了同時或依次服用IX因子或IX因子-相關多肽制品和VII因子或VII因子-相關多肽制品的有益效果。凝結因子IX代用品和VII因子或VII因子-相關多肽制品都可以在這些患者群體中誘導止血，但它們具有不同的生化作用機制。同時服藥可增加止血效果。
本發明提供了藥物組合物，其為含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合物。該組合物可以是單一組合物的形式，也可以是多-組分試劑盒(由多部分組成的試劑盒)的形式。本發明的組合物可用作哺乳動物，包括靈長類動物如人的治療和預防性前止血劑。本發明還提供了治療(包括預防性治療或預防)受試者，包括人的出血發作的方法。
不論何時，本說明書上下文中提及的第一或第二或第三等單位劑量都不表示給藥的優選次序，這樣做僅是為方便表述而已。
VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合是有利的產品，它能確保較短的凝血時間和止血栓的快速形成。本發明人將會證明與單獨施用VIIa因子或IX因子相比，聯合施用VIIa因子和IX因子可更加有效地縮短正常人血漿的凝血時間。因此，通過縮短凝血時間，即可獲得更加有效的治療受試者出血的方法。另外，可以用總量較少的VII因子和IX因子或IX因子-相關多肽來治療患者。
VII因子多肽在實施本發明時，可以使用任何能有效預防或治療出血的VII因子多肽。包括得自血液或血漿的、或通過重組方法產生的VII因子多肽。
本發明包括VII因子多肽，例如具有美國專利號4784950所公開的氨基酸序列的VII因子多肽(野生型人VII因子)。在一些實施方案中，VII因子多肽是公開于例如美國專利號4784950中的人VIIa因子(野生型VII因子)。在一系列實施方案中，VII因子多肽包括表現出至少約10％，優選至少約30％，更優選至少約50％，最優選至少約70％人VIIa因子特定生物活性的多肽。在一系列實施方案中，VII因子多肽包括表現出至少約90％，優選至少約100％，優選至少約120％，更優選至少約140％，最優選至少約160％人VIIa因子特定生物活性的多肽。在一系列實施方案中，VII因子多肽包括與美國專利號4784950中公開的野生型VII因子序列至少約70％，優選至少約80％，更優選至少約90％，最優選至少約95％相同的多肽。
本文所用“VII因子多肽”包括但不限于VII因子以及VII因子-相關多肽。術語“VII因子”欲包括但不限于具有野生型人VII因子(公開于美國專利號4784950)以及得自其它物種的野生型VII因子，如牛、豬、犬、鼠和鮭魚VII因子的氨基酸序列1-406的多肽，所述VII因子得自血液或血漿，或是通過重組方法產生的。VII因子還包括可能在不同個體中出現和產生的VII因子天然等位基因變異體。糖基化或其它翻譯后修飾的水平和位置隨著所選擇的宿主細胞和宿主細胞環境特性的不同而不同。術語“VII因子”也欲包括未裂解(酶原)形式的VII因子多肽，以及經蛋白酶解加工，產生其各自的生物活性形式(被稱為VIIa因子)的VII因子多肽。VII因子一般在殘基152和153之間被裂解，產生VIIa因子。
“VII因子-相關多肽”包括但不限于相對于人VII因子而言已被化學修飾和/或相對于人VII因子而言含有一個或多個氨基酸序列改變(即VII因子變體)，和/或相對于人VII因子而言含有截短的氨基酸序列(即VII因子片段)的VII因子多肽。所述VII因子-相關多肽可表現出不同于人VII因子的特性，包括穩定性、磷脂結合、改變的比活性等。術語“VII因子-相關多肽”欲包括未裂解(酶原)形式的多肽，以及經蛋白酶解加工，產生其各自的生物活性形式(被稱為“VIIa因子-相關多肽”或“活化的VII因子-相關多肽”)的多肽。
本文所用“VII因子-相關多肽”包括但不限于相對于野生型人VII因子而言，表現出基本上相同或有所改良的生物活性的多肽，以及相對于野生型人VIIa因子的活性而言，VIIa因子生物活性實質上被修飾或降低的多肽。這些多肽包括但不限于VII因子或經化學修飾的VIIa因子以及導入了特定的氨基酸序列改變的VII因子變體，所述改變可修飾或破壞多肽的生物活性。
所述多肽還包括氨基酸序列略有修飾的多肽，例如具有經修飾的N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或添加的多肽，和/或相對于人VIIa因子而言已被化學修飾的多肽。
VII因子-相關多肽，包括VII因子變體，無論其與野生型VII因子相比，表現出基本上相同或更好的生物活性，還是相對于野生型VII因子而言表現出實質上被修飾或降低的生物活性，都包括但不限于因一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型VII因子序列的氨基酸序列的多肽。
VII因子-相關多肽，包括變體包括那些經上文所述的一個或多個凝血試驗、蛋白酶解試驗或TF結合試驗檢測，可表現出至少約10％，至少約20％，至少約25％，至少約30％，至少約40％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約75％，至少約80％，至少約90％，至少約100％，至少約110％，至少約120％，或至少約130％在相同細胞類型中產生的野生型VIIa因子的比活性的多肽。
相對于野生型VIIa因子而言，具有基本上相同或有所改良的生物活性的VII因子-相關多肽，包括變體包括那些經上文所述的一個或多個凝血試驗、蛋白酶解試驗或TF結合試驗檢測，可表現出至少約25％，優選至少約50％，更優選至少約75％，更優選至少約100％，更優選至少約110％，更優選至少約120％，最優選至少約130％在相同細胞類型中產生的野生型VIIa因子的比活性的多肽。
相對于野生型VIIa因子而言，具有實質上有所降低的生物活性的VII因子-相關多肽，包括變體包括那些經上文所述的一個或多個凝血試驗、蛋白酶解試驗或TF結合試驗檢測，可表現出低于約25％，優選低于約10％，更優選低于約5％，最優選低于約1％在相同細胞類型中產生的野生型VIIa因子的比活性的多肽。相對于野生型VII因子而言，具有實質上被修飾的生物活性的VII因子變體包括但不限于表現出不依賴于TF的X因子蛋白酶解活性的VII因子變體，和與TF結合但不裂解X因子的VII因子變體。
在一些實施方案中，VII因子多肽是VII因子-相關多肽，特別是變體，其中，當在“體外水解試驗”(參見下文“試驗”)中檢測時，所述VII因子多肽活性和天然人VIIa因子(野生型FVIIa)活性之間的比率至少約為1.25；在其它實施方案中，該比率至少約為2.0；在其它實施方案中，該比率至少約為4.0。在本發明的一些實施方案中，VII因子多肽是VII因子-相關多肽，特別是變體，其中，當在“體外水解試驗”(參見下文“試驗”)中檢測時，所述VII因子多肽活性和天然人VIIa因子(野生型FVIIa)活性之間的比率至少約為1.25；在其它實施方案中，該比率至少約為2.0；在其它實施方案中，該比率至少約為4.0；在其它實施方案中，該比率至少約為8.0。
在一些實施方案中，VII因子多肽是公開于例如美國專利號4784950中的人VII因子(野生型VII因子)。在一些實施方案中，VII因子多肽是人VIIa因子。在一系列實施方案中，VII因子多肽是表現出至少約10％，優選至少約30％，更優選至少約50％，最優選至少約70％人VIIa因子特定生物活性的VII因子-相關多肽。在一些實施方案中，VII因子多肽具有因一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代而不同于野生型VII因子序列的氨基酸序列。
與野生型VII因子相比，具有基本上相同或有所改良的生物活性的VII因子變體的非限制性例子包括S52A-FVII，S60A-FVII(Iino等，Arch.Biochem.Biophys.352182-192，1998)；L305-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；美國專利號5580560中公開的表現出增加的蛋白酶解穩定性的FVIIa變體；在殘基290和291之間或殘基315和316之間被蛋白酶裂解的VIIa因子(Mollerup等，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；和VIIa因子的氧化形式(Kornfelt等，Arch.Biochem.Biophys.36343-54，1999)。相對于野生型VII因子而言，具有實質上降低或經修飾的生物活性的VII因子變體的非限制性例子包括R152E-FVIIa(Wildgoose等，Biochem 293413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等，J.Biol.Chem.27066-72，1995)，FFR-FVIIa(Holst等，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15515-520，1998)，和缺乏Gla結構域的VIIa因子(Nicolaisen等，FEBS Letts.317245-249，1993)。經化學修飾的VII因子多肽和序列變體的非限制性例子描述于例如美國專利號5997864。
VIIa因子在凝血中的生物活性源自其(i)結合組織因子(TF)的能力和(ii)催化蛋白酶裂解IX因子或X因子以產生活化的IX因子或X因子(分別為IXa或Xa因子)的能力。
為了本發明的目的，通過按照美國專利號5997864所述，使用缺乏VII因子的血漿和促凝血酶原激酶測定制品促進凝血的能力，可以定量測定VII因子多肽的生物活性(“VII因子生物活性”)。在此試驗中，生物活性被表示為相對于對照樣品而言，凝血時間的減少，通過與含有1個單位/ml VII因子活性的集中的人血清標準比較，將所述生物活性轉化為“VII因子單位”。或者，通過下述方法定量測定VIIa因子的生物活性(i)在含有包埋于脂質膜的TF和X因子的系統中，測定VIIa因子或VIIa因子-相關多肽產生活化的X因子(Xa因子)的能力(Persson等，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；(ii)在含水系統中測定X因子水解(參見下文的“體外水解試驗”)；(iii)使用基于表面胞質基因組共振的儀器測定VIIa因子或VIIa因子-相關多肽與TF的物理結合(Persson，FEBS Letts.413359-363，1997)；和(iv)測定VIIa因子和/或VIIa因子-相關多肽對合成底物的水解(參見下文的“體外水解試驗”)；和(v)在不依賴于TF的體外系統中測定凝血酶的產生。
術語“VII因子生物活性”或“VII因子活性”欲包括產生凝血酶的能力；該術語還包括在缺乏組織因子時，在活化的血小板表面產生凝血酶的能力。
本發明可以使用的VIIa因子制品是，但不限于NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
IX因子多肽本發明包括IX因子多肽，例如具有公開于例如Jaye等，Nucleic AcidsRes.112325-2335，1983的氨基酸序列(野生型人IX因子)的IX因子多肽。
在實施本發明時，可以使用任何能有效預防或治療出血的IX因子多肽。其包括得自血液或血漿，或通過重組方法產生的IX因子多肽。
本文所用“IX因子多肽”包括但不限于IX因子以及IX因子-相關多肽。術語“IX因子”欲包括但不限于具有Jaye等，Nucleic Acids Res.1983(見上文)所述氨基酸序列(野生型人IX因子)的多肽，以及得自其它物種的野生型IX因子，例如牛、豬、犬、鼠和鮭魚IX因子。還包括可能在不同個體中出現和產生的IX因子天然等位基因變異體。糖基化或其它翻譯后修飾的水平和位置隨著所選擇的宿主細胞和宿主細胞環境特性的不同而不同。術語“IX因子”也欲包括未裂解(酶原)形式的IX因子多肽，以及經蛋白酶解加工，產生其各自的生物活性形式(被稱為IXa因子)的IX因子多肽。
“IX因子-相關多肽”包括但不限于相對于人IX因子而言已被化學修飾和/或相對于人IX因子而言含有一個或多個氨基酸序列改變(即IX因子變體)，和/或相對于人IX因子而言含有截短的氨基酸序列(即IX因子片段)的IX因子多肽。所述IX因子-相關多肽可表現出不同于人IX因子的特性，包括穩定性、磷脂結合、改變的比活性等。術語“IX因子-相關多肽”欲包括未裂解(酶原)形式的多肽，以及經蛋白酶解加工，產生其各自的生物活性形式(被稱為“IXa因子-相關多肽”或“活化的IX因子-相關多肽”)的多肽。
本文所用“IX因子-相關多肽”包括但不限于相對于野生型人IX因子而言，表現出基本上相同或有所改良的生物活性的多肽，以及相對于野生型人IX因子的活性而言，IX因子生物活性實質上被修飾或降低的多肽。這些多肽包括但不限于IX因子或經化學修飾的IXa因子以及導入了特定的氨基酸序列改變的IX因子變體，所述改變可修飾或破壞多肽的生物活性。
所述多肽還包括氨基酸序列略有修飾的多肽，例如具有經修飾的N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或添加的多肽，和/或相對于人IX因子而言已被化學修飾的多肽。
IX因子-相關多肽，包括IX因子變體，無論其與野生型IX因子相比，表現出基本上相同或更好的生物活性，還是相對于野生型IX因子而言表現出實質上被修飾或降低的生物活性，都包括但不限于因一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型IX因子序列的氨基酸序列的多肽。
IX因子-相關多肽，包括變體包括那些經本文說明書所述的IX因子活性試驗檢測，可表現出至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約40％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約100％，至少約110％，至少約120％，和至少約130％在相同細胞類型中產生的野生型IX因子的比活性的多肽。
相對于野生型IX因子而言，具有基本上相同或有所改良的生物活性的IX因子-相關多肽，包括變體包括那些經上文所述的一個或多個特定的IX因子活性試驗檢測，可表現出至少約25％，優選至少約50％，更優選至少約75％，更優選至少約100％，更優選至少約110％，更優選至少約120％，最優選至少約130％在相同細胞類型中產生的野生型人IX因子的特定生物活性的多肽。為了本發明的目的，可按照本說明書下文(“試驗部分”)所描述的方法定量測定IX因子生物活性。
相對于野生型IX因子而言，具有實質上有所降低的生物活性的IX因子-相關多肽，包括變體包括那些經上文所述的一個或多個特定的IX因子活性試驗檢測，可表現出低于約25％，優選低于約10％，更優選低于約5％，最優選低于約1％在相同細胞類型中產生的野生型IX因子的比活性的多肽。
IX因子多肽的非限制性例子包括得自血漿的人IX因子，其描述于例如Chandra等，Biochem.Biophys.Acta 1973，328456；Andersson等，Thromb.Res.1975，7451；Suomela等，Eur.J.Biochem.1976，71145。
在一些實施方案中，IX因子是IX因子-相關多肽，其中，當在“生色試驗”(參見下文)中檢測時，所述IX因子多肽活性和天然人IX因子(野生型IX因子)活性之間的比率至少約為1.25；在其它實施方案中，該比率至少約為2.0；在其它實施方案中，該比率至少約為4.0。
可商購的FIX產品(所謂的替代產品)得自正常的血漿收集物或經基因工程改造的哺乳動物細胞系。通常根據被定義為比活性(每mg蛋白質的凝血因子活性國際單位數，IU/mg)的最終純度對替代產品進行分類。中間產品具有相對較低的比活性(＜50IU/mg)，因為它們也含有無關緊要的血漿蛋白質，如血纖蛋白原，纖連蛋白和其它非-促凝劑蛋白質。高純度(＞50IU/mg)和超高純度(＞160IU/mg)除了添加有白蛋白作為穩定劑外，只含有很少或實質上不含其它的血漿蛋白質。
本發明可以使用的商購IX因子產品(濃縮物及制品)的非限制性例子是，但不限于例如AHP/Genetics Institute的BeneFix(rFIX)，Aventis的Mononine(FIX)，Baxter的Proplex(FIX復合物)，Baxter的Bebulin VH(FIX復合物)，Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies(LFB)的FACTEUR IX-LFB(基于人血漿的FIX)，Immunine(Baxer/Immuno)，Octanyne(Octapharma)，Octanine F(Octapharma)，Mono FIX-VF(CSL)，Novact M(Kaketsuken)。
高和超高活性產品的非限制性例子是Immunine(Baxer/Immuno)，Octanyne(Octapharma)，Mono FIX-VF(CSL)(皆為高純度)，BeneFix(AHP/Genetics Institute)，Mononine(Aventis)，Novact M(Kaketsuken)(皆為超高純度)。
定義
在本發明的上下文中，按照下表1所示以常規方式使用氨基酸的三字母或單字母表示法。除非另有說明，本文所提及的氨基酸是L-氨基酸。例如，應理解K337的第一個字母表示天然存在于野生型VII因子的所示位置的氨基酸，例如，K337A-FVIIa表示FVII-變體，其中由天然存在于所示位置的單字母密碼K表示的氨基酸被由單字母密碼A表示的氨基酸所取代。
表1氨基酸的簡稱

術語“VII因子”或“FVII”可以互換使用。術語“VIIa因子”或“FVIIa”可以互換使用。術語“IX因子”或“FIX”可以互換使用。
在本發明的上下文中，“凝血酶產生受損的受試者”指的是不能在活化的血小板表面產生充足凝血酶的受試者，并包括相對于具有功能完全的正常止血系統，包括具有正常的凝結因子、血小板和血纖蛋白原量和功能的受試者的凝血酶產生而言，產生的凝血酶較少的受試者，包括但不限于缺乏IX因子的受試者；血小板數目減少或血小板功能有缺陷的受試者(例如血小板減少癥或Glanzmann血小板機能不全或出血過多的受試者)；凝血酶原、FX或FVII水平下降的受試者；(例如，因創傷或大手術導致出血過多而使)幾種凝結因子水平下降的受試者；和血纖蛋白原的血漿濃度有所降低的受試者(例如多次輸血的受試者)。
術語“增強止血系統”指的是增強產生凝血酶的能力。術語“增強止血”欲包括下述情況，即當以相同的凝血酶產生試驗進行檢測時，相對于分別僅含有VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子-相關多肽的對照樣品各自的凝血酶產生而言，含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的受試樣品的已測定的凝血酶產生有所延長。可以按照本說明書的凝血酶產生試驗中的描述(見“試驗部分”)檢測凝血酶產生。
血塊裂解時間、血塊強度、血纖蛋白塊形成和凝血時間是用于檢測患者止血系統狀況的臨床參數。以適當的時間間隔從患者體內取血樣，利用例如Meh等，Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001；12627-637；Vig等，Hematology，Vol.6(3)pp.205-213(2001)；Vig等，Blood Coagulation &Fibrinolysis，Vol.12(7)pp.555-561(2001)Oct；Glidden等，Clinical and appliedthrombosis/hemostasis，Vol.6(4)pp.226-233(2000)Oct；McKenzie等，Cardiology，Vol.92(4)pp.240-247(1999)Apr；或Davis等，Joumal of theAmerican Society of Nephrology，Vol.6(4)pp.1250-1255(1995)所述的凝血彈性描記法檢測一個或多個參數。
術語“延長血塊裂解時間”欲包括下述情況，即當以相同的血塊裂解試驗進行檢測時，相對于分別僅含有VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子-相關多肽的對照樣品各自的血塊裂解時間而言，含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的受試樣品的已測定的血塊裂解時間有所延長。可以按上述檢測血塊裂解時間。
術語“增加血塊強度”欲包括下述情況，即當以相同的血塊強度試驗進行檢測時，相對于分別僅含有VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子-相關多肽的對照樣品各自的血塊裂解時間而言，含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的受試樣品的已測定的血塊強度，例如機械強度有所增加。可以按照例如Carr等，1991.(CarrME，Zekert SL.Measurement of platelet-mediated force development duringplasma clot formation.AM J MED SCI 1991；30213-8)所述，或按上述通過凝血彈性描記法檢測血塊強度。
術語“增強血纖蛋白塊形成”欲包括下述情況，即當以相同的凝血試驗進行檢測時，相對于分別僅含有VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子-相關多肽的對照樣品各自的血纖蛋白塊形成的速率或水平而言，含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的受試樣品的已測定的血纖蛋白塊形成的速率或水平有所提高。可以按上述檢測血纖蛋白塊形成。
術語“縮短凝血時間”欲包括下述情況，即當以相同的凝血試驗進行檢測時，相對于分別僅含有VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子-相關多肽的對照樣品各自的凝血時間而言，含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的受試樣品的已測定的凝血塊形成時間(凝血時間)有所縮短。可通過本領域技術人員已知的標準PTog aPTT試驗檢測凝血時間。
本文所用術語“出血紊亂”反映了表現為出血發作的任何先天性、獲得性或被誘導的、源于細胞或分子水平的缺陷。出血紊亂的例子包括但不限于凝血因子缺乏癥(例如缺乏凝結因子VIII、IX、XI或VII)，凝血因子抑制劑，血小板機能不全(例如Glanzmann血小板機能不全和Bemard-Soulier綜合征)，血小板減少癥，遺傳性假血友病，以及例如因出血和/或輸血(例如遭遇手術或創傷故需多次輸血的受試者)而使凝結蛋白被稀釋，血纖蛋白溶解增加，血小板數目減少，從而導致的凝血病。
出血指的是血液從循環系統的任何組成部分中外滲。術語“出血發作”包括與手術，創傷或其它形式的組織損害相關聯的不必要的，不受控制的和經常性的過度出血，以及患有出血紊亂的受試者的不必要的出血。出血發作可發生于凝血系統基本正常，但遭遇(暫時性)凝血病的受試者，以及患有先天性或獲得性凝血或出血紊亂的受試者。在血小板機能不全的受試者中，出血可被看成是由血友病導致的出血，因為與血友病一樣，止血系統缺乏或具有異常的必需凝血“化合物”(例如血小板或von Willebrand因子蛋白)。在遭遇深度組織損害，例如與手術或大創傷有關的損害的受試者中，相對于正常的止血機制而言，對立即止血的需求占據優勢，盡管(創傷前或手術前)有基本正常的止血機制，這些受試者仍會過度出血。這些經常需要多次輸血的受試者因出血和/或輸血(例如因出血和/或輸血而使凝結蛋白被稀釋，血纖蛋白溶解增加，血小板數目減少)，會發展為(暫時性的)凝血病。出血也可發生在器官，例如腦，內耳區和眼部；這些是外科止血的可能性有限的區域，因此，成功止血成為一個難題。在從多個器官(肝臟、肺、腫瘤組織、胃腸道)取活檢樣品的過程中，以及在腹腔鏡檢查手術和根本性恥骨后前列腺切除術中也會產生類似的問題。所有這些情況的共同之處是通過手術技術(縫線、小夾子等)難以達到止血的目的，當出血擴散時(例如出血性胃炎和大量的子宮出血)，情況也是如此。出血也會發生于接受抗促凝劑療法的受試者，這些受試者所接受的療法誘導了止血缺陷；這些出血經常是急性的和過多的。給予抗促凝劑療法經常是為了預防血栓栓塞性疾病。所述療法可包括肝素，其它形式的蛋白聚糖，丙酮芐羥香豆素或其它形式的維生素K-拮抗劑以及阿斯匹林和其它血小板聚集抑制劑，例如抗體或其它GP IIb/IIIa活性抑制劑。出血發作還意味著包括但不限于與受試者的手術或創傷有關的不受控制的過度出血，所述受試者經歷了急性關節積血(關節出血)、慢性嗜血性關節病、血腫(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后血腫)、其它組織出血、血尿(腎管出血)、大腦出血、手術(例如肝切除)、拔牙和胃腸出血(例如UGI出血)。出血發作可能與抗VIII因子抑制劑；A型血友病；具有抑制劑的A型血友病；B型血友病；VII因子缺乏；XI因子缺乏；血小板減少；von Willebrand因子缺乏(遺傳性假血友病)；嚴重的組織損害；嚴重的創傷；手術；腹腔鏡檢查手術；出血性胃炎；取活檢樣品；抗促凝劑療法；上胃腸道出血(UGI)；或干細胞移植有關。出血發作可以是過多的子宮出血；發生于機械止血的可能性有限的器官中的出血；發生于腦部的出血；發生于內耳區的出血；或發生于眼的出血。術語“出血發作”和“出血”在適當時可以互換使用。
在此上下文中，術語“治療”意味著包括預防可以預見的出血(例如手術中的出血)，以及調節已發生的出血(例如創傷出血)，目的是為了抑制出血或使出血量最少。以上提及的“可以預見的出血”可以是有望發生在特定組織或器官中的出血，或者是不確定的出血。因此，術語“治療”包括預防性施用VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品。
本文所用術語“受試者”欲指任何動物，尤其是哺乳動物，如人，適當時可以與術語“患者”互換使用。
可以同時或依次施用本說明書中定義的VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。可以以含有兩種凝結因子的單一劑量形式，或以含有VII因子或VII因子-相關多肽制品作為第一種單位劑量形式，含有IX因子或IX因子-相關多肽制品作為第二種單位劑量形式的由多部分組成的試劑盒的形式提供因子。第二種單位劑量形式可以是高-，中-或低-活性IX因子產品形式。優選高-活性產品。最優選重組高-活性產品。不論何時，本說明書上下文中提及的第一或第二或第三等單位劑量都不表示給藥的優選次序，這樣做僅是為方便表述而已。
“同時”施用VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品指的是以單一劑量形式施用凝結因子蛋白質，或先施用第一種凝結因子蛋白質，接著在不超過15分鐘，優選10，更優選5，更優選2分鐘的時間間隔之后施用第二種凝結因子蛋白質。可以先施用任一種因子。
“依次”施用指的是先施用第一種凝結因子蛋白質，接著在2小時，優選1至2小時，更優選1小時，更優選30分鐘至1小時，更優選30分鐘，更優選15至30分鐘的時間間隔之后施用第二種凝結因子蛋白質。可以先施用兩種單位劑量形式或凝結因子蛋白質中的任一種。優選通過相同的靜脈內進入方式注射這兩種產品。
“IX因子水平”指的是與健康受試者水平相比較的患者IX凝血因子活性水平。該水平被表示為正常水平的百分比。適當時，該術語可以互換使用。
“IX因子水平降低”指的是與不具有凝結因子IX缺陷或凝結因子IX抑制劑的受試者群體的平均IX水平相比，血流中IX因子存在量或活性的降低。根據其從人血漿中的純化情況看，正常成年人的IX因子濃度約為300-400微克/毫升血漿。
在正常的健康個體中，IX因子活性和抗原水平在50至160％于正常的血漿收集物之間變化。臨床上，通過促凝劑或免疫學試驗即可測定循環的IX因子水平。通過患者血漿校正IX因子-缺乏的血漿的凝血時間的能力測定IX因子前促凝劑活性(例如APTT試驗，參見下文；也可參見本說明書的“試驗部分”)。
一個單位的IX因子被定義為1毫升正常(收集的)人血漿中存在的IX因子的量(相當于100％的IX因子水平)。
一個單位的VII因子被定義為1毫升正常(收集的)血漿中存在的VII因子的量，相當于約0.5μg蛋白質。活化后，50個單位相當于約1μg蛋白質。
“缺乏”指的是與正常健康個體相比，血漿中IX因子的存在量或活性有所降低。適當時，該術語可與“IX因子水平降低”互換使用。
“APTT”或“aPTT”指的是活化的部分組織促凝血酶原激酶時間(描述于例如Proctor RR，Rapaport SIThe partial thromboplastin time with kaolin；a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiencies.Am JClin Pathol 36212，1961)。
“IX因子-反應性綜合征”指的是給需要治療的受試者施用外源性IX因子即可預防、治愈或緩解由綜合征引起的可預見的或已存在的任何癥狀、病癥或疾病的綜合征。包括但不限于由IX因子水平降低引起的綜合征，例如出血紊亂(例如但不限于B型血友病)或者由IX因子抑制劑引起的綜合征。
“VII因子-反應性綜合征”指的是給需要治療的受試者施用外源性VII因子，優選VIIa因子即可預防、治愈或緩解由綜合征引起的可預見的或已存在的任何癥狀、病癥或疾病的綜合征。包括但不限于因凝血因子VIII，IX，XI或VII水平降低，凝血因子抑制劑，血小板機能不全(例如G1anzmann血小板機能不全和Bernard-Soulier綜合征)，血小板減少，遺傳性假血友病和凝血病，例如(遭遇手術或創傷故需多次輸血的受試者)因出血和/或輸血而使凝結蛋白被稀釋，血纖蛋白溶解增加，血小板數目減少所導致的凝血病而引起的綜合征。
“半壽期”指的是VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子-相關多肽的血漿濃度從一個特定的值降低至該值的一半所需的時間。
“初級止血”指的是起初由FXa和TF:VIIa因子產生凝血酶，隨后激活血小板，形成最初的由活化的粘附血小板構成的松散血栓，所述血栓尚未被血纖蛋白(最終被交聯的血纖蛋白)穩定化。如果未被止血過程的第二個步驟(維持止血)所形成的血纖蛋白穩定化，血栓容易被纖溶系統溶解。
“次級止血”或“維持止血”指的是發生于活化的血小板表面、并由IXa因子和IXa因子催化的次級、完全和較多的凝血酶突增或產生，隨后形成血纖蛋白，最初的血小板栓被穩定化。血纖蛋白對血栓的穩定化導致完全止血。
“完全止血”指的是在受傷部位形成穩定的固體血纖蛋白塊或栓，它們能有效止血，并且不易被纖溶系統溶解。在本發明的上下文中，使用術語止血表示上述的完全止血。
本文所用凝結因子，如IX因子的“制品”是IX因子占絕對優勢的制品。在一個實施方案中，凝結因子以占蛋白質總量20％(w/w)以上，更優選30％，更優選40％，更優選50％，更優選60％，更優選70％，更優選80％，更優選90％，更優選95％，更優選98％，更優選99％的量存在于制品中。
在優選的實施方案中，凝結因子以占凝結因子蛋白質總量50％(w/w)以上，更優選80％，更優選90％，更優選95％，更優選98％，更優選99％的量存在。
通過公知方法，例如通過測定光密度即可測定所述制品中蛋白質的總量。通過公知方法，例如標準的ELISA免疫測定法即可測定IX因子凝結蛋白的量。一般說來，通過下述方法可進行這種試驗，即使含有IX因子蛋白質的制品溶液與固定于ELISA板上的抗-FIX抗體接觸，隨后使固定化的抗體-IX因子復合物與攜有標記的第二抗-FIX抗體接觸，第三步，可測定標記的量。可以使用適當的抗體，以類似的方法測定每種凝結因子的量。通過將每一種凝結因子蛋白質的量加在一起，即可測定制品中存在的凝結因子蛋白質的總量。在一個實施方案中，制品含有分離的凝結因子。在另一個實施方案中，制品不含凝結因子II和凝結因子IIa。
本文所用術語“分離的”指的是已從合成凝結因子的細胞，或凝結因子天然存在的介質(例如血漿或血液)中分離出來的凝結因子，例如IX因子或IX因子-相關多肽。可通過本領域已知的任何方法，從其來源細胞中分離多肽，所述方法包括但不限于從貼壁細胞培養物中取出含有所需產物的細胞培養基；離心或過濾以除去未-貼壁的細胞等。可通過本領域已知的任何方法，從其天然存在的介質中分離多肽，所述方法包括但不限于親和層析，如分別在抗-VII因子或抗-IX因子抗體柱上進行的親和層析；疏水作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳方法(例如制備性等電聚焦(IEF))，差別溶解性(例如硫酸銨沉淀)，或提取等。
縮寫
TF 組織因子FVII 單鏈，未活化形式的VII因子FVIIa活化形式的VII因子rFVIIa 活化形式的重組VII因子IX因子 酶原，未活化形式的IX因子IXa因子 活化形式的IX因子rFIX 重組IX因子rFIXa重組IXa因子化合物的制備優選通過DNA重組技術，例如描述于Hagen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832412-2416，1986或歐洲專利號200,421(ZymoGenetics，Inc.)中的技術制備適用于本發明的純化的人VIIa因子。
也可通過Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)1242-1247，1980以及Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.711836-1841，1983所述的方法制備VII因子。這些方法生產出VII因子，其中不含可測量的其它凝結因子。通過包括額外的凝膠過濾作為最終的純化步驟，甚至可以獲得進一步純化的VII因子制品。然后通過已知方法，例如通過幾種不同的血漿蛋白質，如XIIa、IXa或Xa因子，將VII因子轉變為活化的VIIa因子。或者，按Bjoem等(ResearchDisclosure，269 September 1986，pp.564-565)所述，通過使VII因子流經離子交換層析柱，如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等而使其被活化。
通過修飾野生型VII因子或通過重組技術，可以生產VII因子-相關多肽。通過例如位點特異性誘變改變編碼天然VII因子的核酸中的氨基酸密碼子或除去其中的一些氨基酸密碼子，即可修飾編碼野生型VII因子的核酸序列，從而產生與野生型VII因子相比，氨基酸序列有所改變的VII因子-相關多肽。
本領域技術人員清楚地知道可在對VIIa因子或IX因子-分子的功能無關緊要的區域進行取代，仍然會得到有活性的多肽。可根據本領域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸-掃描誘變(參見例如Cunningham and Wells，1989，Science 2441081-1085)，鑒定出對VII因子或VII因子-相關多肽或IX因子或IX因子相關多肽的活性至關重要，因此優選不對其進行取代的氨基酸殘基。在后一技術中，在分子中的每一個帶正電的殘基處導入突變，檢測所得突變分子各自交聯的促凝劑活性，以鑒定出對分子的活性至關重要的氨基酸殘基。通過分析按照如核磁共振分析，晶體學或光親和性標記(參見例如de Vos等，1992，Science 255306-312；Smith等，1992，Journal ofMolecular Biology 224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 30959-64)之類的技術測定的三維結構，也可以測定底物-酶相互作用的位點。
通過使用本領域已知的任何方法進行定點誘變，可以在核酸序列中導入突變以用一個核苷酸交換另一個核苷酸。特別有用的方法利用了含有所需插入物的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個含有所需突變的合成引物。在溫度循環過程中，各與載體的相反鏈互補的寡核苷酸引物利用pfu DNA聚合酶延伸。引物摻入之后，即可產生含有交錯切口的突變質粒。溫度循環之后，用特異于甲基化和半甲基化DNA的DpnI處理產物，以消化親代DNA模板并選擇出含有突變的合成DNA。也可以使用本領域已知的其它產生、鑒定和分離變體的方法，例如基因改組或噬菌體展示技術。
可通過本領域已知的任何方法從其來源細胞中分離多肽，所述方法包括但不限于從貼壁細胞培養物中取出含有所需產物的細胞培養基；離心或過濾以除去未-貼壁的細胞等。
任選進一步純化VII因子或VII因子-相關多肽。可以使用本領域已知的任何方法進行純化，所述方法包括但不限于親和層析，如在抗-VII因子抗體柱上進行的親和層析(參見例如Wakabayashi等，J.Biol.Chem.26111097，1986；和Thim等，Biochem.277785，1988)；疏水作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳方法(例如制備性等電聚焦(IEF))，差別溶解性(例如硫酸銨沉淀)，或提取等。一般可參見Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，New York，1982；和Protein Purification，J.C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989。純化后，優選制品含有低于約10％重量，更優選低于約5％，最優選低于約1％重量的得自宿主細胞的非-VII因子或VII因子相關多肽。
通過使用XIIa因子或其它具有胰蛋白酶樣特異性的蛋白酶，例如IXa因子、激肽釋放酶、Xa因子和凝血酶進行蛋白酶裂解，可以活化VII因子或VII因子-相關多肽。參見例如Osterud等，Biochem.112853(1972)；Thomas，美國專利號4,456,591；和Hedner等，J.Clin.Invest.711836(1983)。或者，通過使VII因子或VII因子-相關多肽流經離子交換層析柱，如MonoQ(Pharmacia)等而使其被活化。然后可按下文所述配制所得的活化VII因子或VII因子-相關多肽并給藥。
可根據已知方法，從血漿中分離本發明中使用的IX因子，所述方法公開于例如Chandra等，Biochem.Biophys.Acta 1973，328456；Andersson等，Thromb.Res.1975，7451；Suomela等，Eur.J.Biochem.1976，71145。然而，優選使用重組IX因子以避免使用存在傳播疾病之風險的源自血液或組織的產品。優選通過DNA重組技術制備適用于本發明的純化的人IX因子，所述技術描述于例如EP107278(British Technology Group)，US5171569(Nat.res.Dev.Corp.)，EP430930(British Technology Group)。
通過修飾野生型IX因子或通過重組技術，可以生產IX因子-相關多肽。通過已知方法，例如上文詳細描述的位點特異性誘變改變編碼天然IX因子的核酸中的氨基酸密碼子或除去其中的一些氨基酸密碼子，即可修飾編碼野生型IX因子的核酸序列，從而產生與野生型IX因子相比，氨基酸序列有所改變的IX因子-相關多肽。可通過本領域已知的任何方法從其來源細胞中分離多肽，所述方法包括但不限于從貼壁細胞培養物中取出含有所需產物的細胞培養基；離心或過濾以除去未-貼壁的細胞等。任選進一步純化IX因子或IX因子-相關多肽。可以使用本領域已知的任何方法進行純化，所述方法包括但不限于上文詳細描述的親和層析，如在抗-IX因子抗體柱上進行的親和層析；疏水作用層析；離子交換層析(例如描述于US6034222)；大小排阻層析；電泳方法(例如制備性等電聚焦(IEF))，差別溶解性(例如硫酸銨沉淀)，或提取等。純化后，優選制品含有低于約10％重量，更優選低于約5％，最優選低于約1％重量的得自宿主細胞的非-IX因子或IX因子相關多肽。然后可按下文所述配制所得的活化IX因子或IX因子-相關多肽并給藥。
本領域技術人員懂得優選使用與受試者同源的IX因子多肽和VII因子多肽，以降低誘導免疫應答的風險。非人IX因子的制備和鑒定描述于例如Fujikawa等，Biochemistry 1973，124938(牛FIX)。本發明還包括在獸醫方法中使用所述IX因子多肽和VII因子多肽。
藥物組合物和使用方法可以使用本發明的制品治療任何IX因子反應性綜合征，例如出血紊亂，包括但不限于因缺乏凝血因子(如B型血友病)或由(低或中等滴度的)IX因子抑制劑所導致的疾病。
可以使用本發明的制品治療任何VII因子反應性綜合征，例如出血紊亂，包括但不限于因凝血因子VIII，IX，XI或VII水平降低，凝血因子抑制劑，血小板機能不全(例如Glanzmann血小板機能不全和Bernard-Soulier綜合征)，血小板減少，遺傳性假血友病和凝血病，例如(遭遇手術或創傷故需多次輸血的受試者)因出血和/或輸血而使凝結蛋白被稀釋，血纖蛋白溶解增加，血小板數目減少所導致的凝血病而引起的綜合征。
主要打算將含有本發明的VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的藥物組合物供非腸道給藥使用，以進行預防和/或治療性治療。優選非腸道施用藥物組合物，即靜脈內、皮下或肌內給藥；最優選靜脈內給藥。也可以通過連續或脈沖式灌注給藥。
本發明的藥物組合物或制劑含有混合于，優選溶解于藥物可接受載體，優選為含水載體或稀釋劑中的VII因子或VII因子-相關多肽制品的制品，或IX因子或IX因子-相關多肽制品的制品，或VII因子或VII因子-相關多肽制品的制品與IX因子或IX因子-相關多肽制品的制品的組合物。可以使用多種含水載體，如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。也可以使用不含水的載體，例如凝膠形式或脂質體制品形式配制本發明的制品，以傳遞或靶向至受傷部位。脂質體制品一般描述于例如美國專利號4837028，4501728和4975282。可通過常規的眾所周知的滅菌技術對組合物進行滅菌。將所得的水溶液包裝待用或在無菌條件下過濾并凍干，給藥前將凍干制品與無菌水溶液混合。
組合物可含有藥物可接受的輔助物質或佐劑，包括但不限于pH調節和緩沖劑和/或張力調節劑，例如醋酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣等。
制劑可進一步包括一種或多種稀釋劑、乳化劑、防腐劑、緩沖液、賦形劑等，可以以液體、粉末、乳劑、控釋等方式提供制劑。本領域技術人員可以按照公認的常規作法，例如描述于Remington’s PharmaceuticalSciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990的方法，以適當的方式配制本發明的組合物。因此，可以制備靜脈內灌注所用的典型藥物組合物，使其含有250ml無菌的Ringer’s溶液和10mg制品。
可以施用含有本發明制品的組合物以進行預防和/或治療性治療。在治療應用中，可按上文所述，以足以治愈、緩解或部分終止疾病及其并發癥的臨床表現的量給已患病的受試者施用組合物。將足以達到此目的的量定義為“治療有效量”。針對每個目的的有效量取決于疾病或創傷的嚴重程度，以及受試者的體重和一般狀況。應懂得通過構建數值矩陣并檢測矩陣中的不同點，使用常規實驗即可測定適當的劑量。
例如，利用噴霧、灌注、雙球囊導管、摻入血管移植物的一個或多個斯滕特氏印模、用于包被球囊導管的水凝膠，或其它已成熟建立的方法可以進行本發明制品的局部傳遞，例如局部應用。在任何事件中，藥物組合物應該提供足以有效治療疾病的大量制品。
在這些配制品中，VII因子或VII因子-相關多肽，IX因子或IX因子-相關多肽，或VII因子或VII因子-相關多肽與IX因子或IX因子-相關多肽的組合物的濃度可以有很大的不同，即從低于約0.5％重量，通常為或至少約為1％重量至高達15或20％重量，主要根據所選擇的特定給藥模式，液體的體積，粘度等選擇所述濃度。優選通過注射或灌注，特別是注射進行給藥。因此，以適于靜脈內給藥的方式制備VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽，例如制備成含有VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽的單一劑量形式的可溶解凍干粉末或液體制劑制品，或制備成含有VII因子或VII因子-相關多肽的單一劑量形式的可溶解凍干粉末或液體制劑制品，以及含有IX因子或IX因子-相關多肽的另一劑量形式的可溶解凍干粉末或液體制劑制品。
應理解VII因子或VII因子-相關多肽的量和IX因子或IX因子-相關多肽的量合起來含有可用于治療出血發作的集合有效量。
必須記住本發明的物質一般用于嚴重的疾病或創傷，即威脅生命或對生命有潛在威脅的狀況。在這種情況下，考慮到外來物質的最少化以及人一般缺乏VIIa因子和IX因子的免疫原性，可以，并且治療醫生也認為需要施用實質上過量的這些組合物。
在預防性的應用中，給容易患病或要不然有患病或受傷風險的受試者施用含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合物，以增強受試者自身的凝血能力。所述量被定義為“預防有效劑量”。應理解VII因子或VII因子-相關多肽的量和IX因子或IX因子-相關多肽的量合起來含有可用于預防出血發作的集合有效量。
可根據治療醫生選擇的劑量水平和模式進行組合物的單次或多次給藥。每天或每周可以單次或多次施用組合物。所述藥物組合物的有效量是能提供抗出血發作的顯著臨床效果的量。所述量部分取決于受試者欲治療的特定病癥、年齡、體重和一般健康狀況以及本領域技術人員熟知的其它因素。
一般在預期的出血之前或在開始出血時以單一劑量施用本發明的組合物。然而，也可以重復(以多劑量)給藥，優選的時間間隔為2-4-6-12小時，這取決于給藥劑量和受試者的病情。
為了進行與審慎的干預相關聯的治療，一般在進行干預之前的約24小時內施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽，隨后持續給藥多達7天或更長時間。可通過本文描述的多種途徑施用促凝劑。
組合物可以是單個制品的形式(單-劑量形式)，其含有適當濃度的VII因子或VII因子-相關多肽制品的制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的制品。組合物也可以是由多部分組成的試劑盒的形式，所述試劑盒由第一種單位劑量形式和第二種單位劑量形式組成，前者含有VII因子或VII因子-相關多肽制品的制品，后者含有IX因子或IX因子-相關多肽制品的制品。在此情況下，VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽應該依次給藥，優選彼此間隔約15分鐘，例如彼此間隔10分鐘，或優選間隔5分鐘，或更優選彼此間隔2分鐘。可以先施用兩種單位劑量形式中的任一種。
試劑盒包括至少兩種獨立的藥物組合物。試劑盒包括盛裝獨立組合物的容器，例如分開的瓶子或分開的小包裝袋。試劑盒一般包括施用獨立成分的說明書。當優選以不同的劑量形式施用獨立的組分，以不同的劑量間隔施用獨立的組分時，或當開處方的醫生需要滴定組合物中的各個組分時，試劑盒形式特別有利。
根據本發明施用的VII因子或VII因子-相關多肽的量和IX因子或IX因子-相關多肽的量的比例在約1∶100至約100∶1(w/w)之間變化。因此，VII因子與IX因子的比例是例如約1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1，或在約1∶90至約1∶1之間，或在約1∶80至約1∶2之間，或在約1∶70至約1∶5之間，或在約1∶60至約1∶10之間，或在約1∶50至約1∶25之間，或在約1∶40至約1∶30之間，或在約90∶1至約1∶1之間，或在約80∶1至約2∶1之間，或在約70∶1至約5∶1之間，或在約60∶1至約10∶1之間，或在約50∶1至約25∶1之間，或在約40∶1至約30∶1之間。
就70-kg受試者的荷載和維持劑量而言，VII因子或VII因子-相關多肽的劑量范圍對應于約0.05mg至約500mg/天的野生型VII因子，例如約1mg至約200mg/天，或例如約5mg至約175mg/天，具體劑量取決于受試者的體重、病癥和病癥的嚴重程度。
就70-kg受試者的荷載和維持劑量而言，IX因子或IX因子-相關多肽的劑量范圍對應于約0.01mg至約500mg/天的野生型IX因子，例如約1mg至約200mg/天，或例如約5mg至約175mg/天，具體劑量取決于受試者的體重、病癥和病癥的嚴重程度。
當治療IX因子水平降低的受試者時，優選以下劑量當所給劑量使IX因子或IX因子-相關多肽的血漿活性水平達正常IX因子活性的10％時優選VII因子或VII因子-相關多肽水平15-300微克/kg體重更優選VII因子或VII因子-相關多肽水平30-250微克/kg體重最優選VII因子或VII因子-相關多肽水平60-180微克/kg體重當所給劑量使IX因子或IX因子-相關多肽的血漿活性水平達正常IX因子活性的30％時優選VII因子或VII因子-相關多肽水平15-300微克/kg體重更優選VII因子或VII因子-相關多肽水平30-250微克/kg體重最優選VII因子或VII因子-相關多肽水平60-180微克/kg體重當所給劑量使IX因子或IX因子-相關多肽的血漿活性水平達正常IX因子活性的50％時優選VII因子或VII因子-相關多肽水平10-300微克/kg體重更優選VII因子或VII因子-相關多肽水平20-200微克/kg體重最優選VII因子或VII因子-相關多肽水平40-140微克/kg體重當所給劑量使IX因子或IX因子-相關多肽的血漿活性水平達正常IX因子活性的80％時優選VII因子或VII因子-相關多肽水平5-300微克/kg體重更優選VII因子或VII因子-相關多肽水平10-180微克/kg體重最優選VII因子或VII因子-相關多肽水平60-120微克/kg體重當所給劑量使IX因子或IX因子-相關多肽的血漿活性水平達正常IX因子活性的100％時優選VII因子或VII因子-相關多肽水平5-300微克/kg體重更優選VII因子或VII因子-相關多肽水平10-180微克/kg體重更優選VII因子或VII因子-相關多肽水平30-120微克/kg體重最優選VII因子或VII因子-相關多肽水平60-120微克/kg體重然而，幾乎無法超過能達到正常IX因子活性的80％的IX因子或IX因子-相關多肽的最大劑量，因為較高的替代水平與血栓形成并發癥的發病率增加有關。
通過假定每kg體重1個單位的FIX替代使血漿活性提高約0.01U/ml(1％)，即可計算出劑量。通過以適當的間隔取出血液樣品并分析IX因子活性，可以監測患者的IX因子水平(見上文說明書)。
檢測法VIIa因平活性試驗可以以簡單的初步體外試驗進行適當檢測法，用于檢測VIIa因子活性從而選擇出適當的VIIa因子變體體外水解試驗可以檢測天然(野生型)VIIa因子和VIIa因子變體(下文皆稱為“VIIa因子”)的比活性。也可以平行地進行檢測以直接比較它們的比活性。在微滴板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進行試驗。將終濃度為1mM的生色底物D-Ile-Pro-Arg-p-硝基酰苯胺(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到含VIIa因子(終濃度為100nM)，0.1M NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4中。在SpectraMaxTM340平板讀數儀(Molecular Devices，USA)中連續測定405nm下的光吸收值。用20分鐘保溫過程中產生的光吸收值減去不含酶的空白孔中的光吸收值，得數用于計算變體和野生型VIIa因子活性之間的比率
比率＝(A405nmVIIa因子變體)/(A405nmVIIa因子野生型)基于此，可以鑒定出活性約等于或高于天然VIIa因子的VIIa因子變體，例如變體活性和天然VII因子(野生型FVII)活性之間的比率約等于對大于1.0的變體。
也可以使用適當濃度為100-1000nM的生理底物，如X因子測定VIIa因子或VIIa因子變體的活性，其中在加入適當的生色底物(如S-2765)之后測定所產生的Xa因子。另外，在生理溫度下進行活性試驗。
體外蛋白酶解試驗可以平行檢測天然(野生型)VIIa因子和VIIa因子變體(下文皆稱為“VIIa因子”)以直接比較它們的比活性。在微滴板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進行試驗。將100μl含有VIIa因子(10nM)和X因子(0.8μM)，0.1M NaCl，5mMCaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4保溫15分鐘。然后加入50μl含有0.1M NaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mMHepes，pH7.4以終止X因子裂解。通過加入終濃度為0.5mM的生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基酰苯胺(S-2765，Chromogenix，Sweden)，測定所產生的Xa因子的量。在SpectraMaxTM340平板讀數儀(Molecular Devices，USA)中連續測定405nm下的光吸收值。用10分鐘內產生的光吸收值減去不含FVIIa的空白孔中的光吸收值，得數用于計算變體和野生型VIIa因子蛋白酶解活性之間的比率比率＝(A405nm VIIa因子變體)/(A405nm VIIa因子野生型)基于此，可以鑒定出活性約等于或高于天然VIIa因子的VIIa因子變體，例如變體活性和天然VII因子(野生型FVII)活性之間的比率約等于對大于1.0的變體。
凝血酶產生試驗可在含有具有生理濃度的所有相關凝結因子和抑制劑以及活化的血小板的試驗中，測定VII因子或VII因子-相關多肽(例如變體)或IX因子或IX因子-相關多肽(例如變體)產生凝血酶的能力(如Monroe等(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547中的第543頁所述，列入本文作為參考)。
IX因子活性試驗
可以以例如Wagenvoord等，Haemostasis 1990；20(5)276-88所述的簡單的體外試驗(“生色試驗”)進行適當的檢測法，用于檢測IX因子活性從而提供選擇適當的IX因子變體以用于本發明的方法。
也可以按照例如Nilsson等，1959(Nilsson IM，Blombaeck M，Thilen A，yon Francken I.，Carriers of haemophilia A-A laboratory study，Acta Med Scan1959；165357)所述，通過測定制品校正缺乏IX因子的血漿的凝血時間的能力，來定量測定IX因子的生物活性。在此試驗中，生物活性被表示為單位/ml血漿(1個單位相當于正常的血漿收集物中存在的FIX的量)。
本發明的方面一方面，本發明涉及藥物組合物，其含有FVII多肽和FIX多肽作為僅有的有活性的凝結因子。在一個實施方案中，FVII多肽是人重組FVIIa。在一個實施方案中，FIX多肽是人重組FIX。在一個實施方案中，FVII多肽和FIX多肽被混合使用。在一個實施方案中，FVII多肽和FIX多肽被放置在獨立的容器中。在一個實施方案中，組合物供家庭治療用。
另一方面，本發明涉及用于治療出血發作的試劑盒，其含有a)第一種單位劑量形式的有效量的FVII多肽，以及任選還含有藥物可接受載體；b)第二種單位劑量形式的有效量的FIX多肽，以及任選還含有藥物可接受載體；和c)含有所述第一和第二種劑量形式的容器。
在一個實施方案中，FVII多肽是人重組FVIIa。在一個實施方案中，FIX多肽是人重組FIX。在一個實施方案中，試劑盒供家庭治療用。另一方面，本發明涉及FVII多肽和FIX多肽用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療患有FIX反應性綜合征的受試者的出血。另一方面，本發明涉及FVII多肽和FIX多肽用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療FIX水平降低的受試者的出血。在一個實施方案中，所述藥物可治療A型血友病患者的出血發作。在一個實施方案中，所述藥物含有FVII多肽和FIX多肽的混合物。在一個實施方案中，以含有FVII多肽的第一種劑量形式和含有FIX多肽的第二種劑量形式制備藥物。在一個實施方案中，FVII多肽是人重組FVIIa。在一個實施方案中，FIX多肽是人重組FIX。
另一方面，本發明涉及與用FIX作為唯一的凝結蛋白質來治療患有FIX反應性綜合征的受試者時相比，能增強所述受試者的止血能力的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與用FIX作為唯一的凝結蛋白質來治療FIX水平有所降低的受試者時相比，能增強所述受試者的止血能力的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與用FIX作為唯一的凝結蛋白質來治療患有FIX反應性綜合征的受試者時相比，能增強所述受試者的凝血酶形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與用FIX作為唯一的凝結蛋白質來治療FIX水平有所降低的受試者時相比，能增強所述受試者的凝血酶形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與以FIX作為唯一的凝結蛋白質施用給患有FIX反應性綜合征的受試者時所需的給藥次數相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥次數的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與以FIX作為唯一的凝結蛋白質施用給FIX水平有所降低的受試者時所需的給藥次數相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥次數的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與以FIX作為唯一的凝結蛋白質施用給患有FIX反應性綜合征的受試者時所需的給藥量相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥量的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及與以FIX作為唯一的凝結蛋白質施用給FIX水平有所降低的受試者時所需的給藥量相比，能減少所述受試者完成止血所需的凝結因子蛋白質給藥量的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和有效量的FIX多肽。
另一方面，本發明涉及治療患有FIX反應性綜合征的受試者的出血的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和FIX多肽。
另一方面，本發明涉及治療FIX水平降低的受試者的出血的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的FVII多肽和FIX多肽。
在所述方法的一個實施方案中，FVII多肽是人重組FVIIa。在一個實施方案中，FIX多肽是人重組FIX。在一個實施方案中，受試者患有B型血友病。
以下將通過實施例進一步闡明本發明，然而，這些實施例并不能限制保護范圍。上述描述和下述實施例中公開的特征獨立地、和以任何組合形式成為以多種多樣的方式了解本發明的素材。
實施例實施例1體內治療顱內出血的血友病患者當用商購的FIX產品治療遭遇顱內出血的不含抑制劑的B型血友病患者時，一般需要8至16次FIX注射或灌注才能使其止血。FIX灌注欲使最初的FIX血漿濃度至少為正常水平的80％，接著使血漿濃度為50％達一周。
用1個劑量，即90-180μg/kg體重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同時給藥的FIX產品治療所述患者，或間隔一段時間，如5分鐘，依次用1個劑量，即90-180μg/kg體重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FIX產品治療所述患者。通過相同的靜脈內入口注射這兩種產品。患者止血所需的時間減少，維持止血所需的注射次數減少。該治療方案導致止血所用的凝結因子蛋白質的總量減少。
實施例2體內治療彌散性上胃腸道出血的慢性肝病患者患者因不明病因的出血性胃炎而遭遇彌散性胃出血。患者因慢性丙型肝炎導致肝功能降低，使得依賴于維生素K的凝結因子，尤其是VII和IX因子的量減少。已給患者輸入紅血細胞，靜脈內注射用液體和含有凝結因子IX的新鮮冷凍血漿。
用1個劑量，即90-120μg/kg體重的FVIIa和同時給藥的FFP產品治療所述患者，或間隔一段時間，如5分鐘，依次用1個劑量，即90-120μg/kg體重的FVIIa和FFP產品治療所述患者。通過相同的靜脈內入口注射這兩種產品。患者胃部多個出血點止血所需的時間減少，維持止血所需的注射次數減少。該治療方案導致止血所用的凝結因子蛋白質的總量減少，并能改善存活。
實施例3具有區室綜合征癥狀的胳膊出現肌肉出血的不含-抑制劑的B型血友病患者該患者是不含-抑制劑的B型血友病患者，其具有區室綜合征癥狀的右胳膊出現嚴重的創傷性肌肉出血。
當用商購的FIX產品治療該患者時，一般需要8至16次FIX注射或灌注才能使其止血。FIX灌注欲使最初的FIX血漿濃度至少為正常水平的80％，接著使血漿濃度為50％達一周。
用1個劑量，即90-180μg/kg體重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同時給藥的FIX產品治療所述患者，或間隔一段時間，如5分鐘，依次用1個劑量，即90-180μg/kg體重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FIX產品治療所述患者。通過相同的靜脈內入口注射這兩種產品。
相對于僅施用NovoSeven或FIX產品的效果而言，NovoSeven和FIX產品的這種組合在止血時間、外周神經和血管損害的程度以及外科干預的大小和復雜程度方面提供了改良的效果。
實施例4檢測不含-抑制劑的B型血友病患者的凝血狀況該患者是遭遇出血，例如顱內出血的不含-抑制劑的B型血友病患者。
當用商購的FIX產品治療該患者時，一般需要8至16次FIX注射或灌注才能使其止血。FIX灌注欲使最初的FIX血漿濃度至少為正常水平的80％，接著使血漿濃度為50％達一周。
用1個劑量，即90-180μg/kg體重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同時給藥的FIX產品治療所述患者，或間隔一段時間，如5分鐘，依次用1個劑量，即90-180μg/kg體重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FIX產品治療所述患者。通過相同的靜脈內入口注射這兩種產品。施用兩種凝結蛋白質中的后一種之后10分鐘，取血樣，使用臨床上與凝血狀況相關的標準化試驗，即凝血彈性描記法進行全血凝結分析(參見例如Meh等，BLOOD COAGULATION &FIBRINOLYSIS 2001；12627-637)。使用讀自該試驗的標準參數，闡明了增強的血纖蛋白塊形成；增加的血塊強度和延長的血塊裂解時間。連續血樣的檢測結果闡明了在注射VII因子和IX因子產品之后，作為時間的函數存在的這些參數的變化。
實施例5用VIIa因子和IX因子的組合縮短凝血時間方法凝血試驗按現有的描述(Persson等，J Biol Chem 27629195-9，2001)，在一-步驟試驗中測定缺乏或存在多種濃度的血漿純化的人IX因子(FIX)時，重組人凝結因子VIIa(rFVIIa)的特定凝血活性。簡單地說，將包含在50mMPipes，100mM NaCl，2mM EDTA，1％BSA，pH7.2中的(55μl)rFVIIa等分試樣(0.2-3μg/ml，Novo Nordisk貯存物)與等體積的緩沖液混合，所述緩沖液含有50mM CaCl2和磷脂酰膽堿/磷脂酰絲氨酸載體(總磷脂濃度100μM；80％磷脂酰膽堿/20％磷脂酰絲氨酸)，通過加入55μl添加有多種濃度的FIX(10，50和80％血漿濃度，Haematologic Technologies)的缺乏FIX的血漿(Helena LabsHelena Labs#5793)以開始凝血過程。使用標準的APTT方法，在ACL 300Research凝血檢測儀(Instrumentation Laboratory，Milan，Italy)中持續凝血500秒。
結果凝血試驗在缺乏FIX的血漿中分開和組合地添加rFVIIa和FIX，測定凝血時間。在加入rFVIIa/FIX之前，兩種血漿的凝血時間都長于500秒的監測時間。圖1顯示了缺乏和存在FIX時rFVIIa的縮短凝血時間的效果。
結論這些結果表明rFVIIa和FIX的組合能縮短缺乏FIX的血漿的凝血時間，其效果優于分開添加蛋白質時所觀察到的效果。
權利要求
1.藥物組合物，其含有VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子-相關多肽。
3.根據權利要求2的組合物，其中所述VII因子-相關多肽是VII因子氨基酸序列變體。
4.根據權利要求2或權利要求3的組合物，其中當按照本說明書中描述的“體外水解試驗”檢測時，所述VII因子-相關多肽的活性與天然人VIIa因子(野生型FVIIa)的活性之間的比率至少約為1.25。
5.根據權利要求1的組合物，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子多肽。
6.根據權利要求5的組合物，其中所述VII因子是人VII因子。
7.根據權利要求6的組合物，其中所述VII因子多肽是重組人VII因子。
8.根據權利要求1至7中任一項的組合物，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽為其活性形式。
9.根據權利要求8的組合物，其中所述VII因子多肽是重組人VIIa因子。
10.根據權利要求1至9中任一項的組合物，其中所述IX因子或IX因子-相關多肽是IX因子-相關多肽。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述IX因子-相關多肽是IX因子氨基酸序列變體。
12.根據權利要求10或權利要求11的組合物，其中當按照本說明書中描述的“生色試驗”檢測時，IX因子-相關多肽的活性與天然人IX因子(野生型FIX)的活性之間的比率至少約為1.25。
13.根據權利要求1至9中任一項的組合物，其中所述IX因子或IX因子-相關多肽是IX因子多肽。
14.根據權利要求13的組合物，其中所述IX因子是人IX因子。
15.根據權利要求14的組合物，其中所述IX因子多肽是重組人IX因子。
16.根據權利要求1至15中任一項的組合物，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽和所述IX因子或IX因子-相關多肽以質量比約為100∶1至1∶100VII因子∶IX因子的比率存在。
17.含有治療出血發作的藥物的、由多部分組成的試劑盒，其含有a)以第一種單位劑量形式存在的、有效量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和藥物可接受載體；b)以第二種單位劑量形式存在的、有效量的IX因子或IX因子-相關多肽制品和藥物可接受載體；和c)容納所述第一和第二種劑量形式的容器裝置。
18.根據權利要求17的試劑盒，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子-相關多肽。
19.根據權利要求18的試劑盒，其中所述VII因子-相關多肽是VII因子氨基酸序列變體。
20.根據權利要求18或權利要求19的試劑盒，其中當按照本說明書中描述的“體外水解試驗”檢測時，所述VII因子-相關多肽的活性與天然人VIIa因子(野生型FVIIa)的活性之間的比率至少約為1.25。
21.根據權利要求17的試劑盒，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽是VII因子多肽。
22.根據權利要求21的試劑盒，其中所述VII因子是人VII因子。
23.根據權利要求22的試劑盒，其中所述VII因子多肽是重組人VII因子。
24.根據權利要求17至23中任一項的試劑盒，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽為其活性形式。
25.根據權利要求24的試劑盒，其中所述VII因子多肽是重組人VIIa因子。
26.根據權利要求17至25中任一項的試劑盒，其中所述IX因子或IX因子-相關多肽是IX因子-相關多肽。
27.根據權利要求26的試劑盒，其中所述IX因子-相關多肽是IX因子氨基酸序列變體。
28.根據權利要求26或權利要求27的試劑盒，其中當按照本說明書中描述的“生色試驗”檢測時，IX因子-相關多肽的活性與天然人IX因子(野生型FIX)的活性之間的比率至少約為1.25。
29.根據權利要求17至25中任一項的試劑盒，其中所述IX因子或IX因子-相關多肽是IX因子多肽。
30.根據權利要求29的試劑盒，其中所述IX因子是人IX因子。
31.根據權利要求30的試劑盒，其中所述IX因子多肽是重組人IX因子。
32.根據權利要求17至31中任一項的試劑盒，其中所述VII因子或VII因子-相關多肽和所述IX因子或IX因子-相關多肽以質量比約為100∶1至1∶100VII因子∶IX因子的比率存在。
33.VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備治療受試者出血發作的藥物的用途。
34.根據權利要求1至16中任一項的組合物用于制備治療受試者出血發作的藥物的用途。
35.VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備縮短凝血時間的藥物的用途。
36.根據權利要求1至16中任一項的組合物用于制備縮短凝血時間的藥物的用途。
37.VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備延長血塊裂解時間的藥物的用途。
38.根據權利要求1至16中任一項的組合物用于制備延長血塊裂解時間的藥物的用途。
39.VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備增加血塊強度的藥物的用途。
40.根據權利要求1至16中任一項的組合物用于制備增加血塊強度的藥物的用途。
41.VII因子或VII因子-相關多肽制品和IX因子或IX因子-相關多肽制品的組合用于制備增強血纖蛋白塊形成的藥物的用途。
42.根據權利要求1至16中任一項的組合物用于制備增強血纖蛋白塊形成的藥物的用途。
43.根據權利要求33至42中任一項的用途，其中受試者患有IX因子反應性綜合征。
44.根據權利要求33至43中任一項的用途，其中受試者在治療前具有降低的IX因子水平。
45.根據權利要求43或權利要求44的用途，其中受試者患有A型血友病。
46.根據權利要求33至45中任一項的用途，其中藥物為單一劑量形式。
47.根據權利要求33至45中任一項的用途，其中以含有VII因子或VII因子-相關多肽制品的第一種劑量形式，和含有IX因子或IX因子-相關多肽制品的第二種劑量形式的方式制備所述藥物。
48.治療受試者的出血發作的方法，所述方法包括給需要治療的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效治療出血。
49.縮短受試者的凝血時間的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效縮短凝血時間。
50.增強受試者止血能力的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強止血。
51.減少使受試者停止出血并維持止血所需凝結因子蛋白質的給藥次數的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效停止出血和維持止血。
52.減少使受試者停止出血并維持止血所需凝結因子蛋白質的給藥量的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效停止出血和維持止血。
53.使受試者的血塊裂解時間延長的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效延長血塊裂解時間。
54.增加受試者的血塊強度的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增加血塊強度。
55.增強受試者的血纖蛋白塊形成的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用第一種量的VII因子或VII因子-相關多肽制品和第二種量的IX因子或IX因子-相關多肽制品，其中第一和第二種量合起來能有效增強血纖蛋白塊形成。
56.根據權利要求48至55中任一項的方法，其中受試者患有IX因子反應性綜合征。
57.根據權利要求48至56中任一項的方法，其中受試者在治療前具有降低的IX因子水平。
58.根據權利要求56或權利要求57的方法，其中受試者患有A型血友病。
59.根據權利要求48至58中任一項的方法，其中以單一劑量形式施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。
60.根據權利要求48至58中任一項的方法，其中以含有VII因子或VII因子-相關多肽制品的第一種劑量形式，和含有IX因子或IX因子-相關多肽制品的第二種劑量形式的方式施用VII因子或VII因子-相關多肽和IX因子或IX因子-相關多肽。
61.根據權利要求60的方法，其中以不超過15分鐘的時間間隔施用第一種劑量形式和第二種劑量形式。
62.含有治療出血發作的藥物的試劑盒，其含有d)以一個單位劑量形式存在的、有效量的VII因子或VII因子-相關多肽和有效量的IX因子或IX因子-相關多肽制品和藥物可接受載體；和e)容納所述一個單位劑量形式的容器裝置。
全文摘要
本發明涉及含有VII因子或VII因子－相關多肽和IX因子或IX因子－相關多肽的藥物制品。本發明還涉及VII因子或VII因子－相關多肽和IX因子或IX因子－相關多肽用于制備藥物的用途，以及預防或治療受試者的出血發作的方法。
文檔編號A61K38/22GK1499981SQ02807619
公開日2004年5月26日 申請日期2002年2月5日 優先權日2001年2月5日
發明者詹斯·B·克努德森, 詹斯 B 克努德森, 烏拉·赫德納, 赫德納, 拉斯穆斯·羅杰克杰爾, 斯 羅杰克杰爾 申請人:諾沃挪第克健康護理股份公司