專利名稱：一種免疫性疾病的醫藥組合物及其制備方法
技術領域：
本發明是關于一種用于治療過敏性疾病的醫藥組合物及其制造方法，特別是一種用于治療過敏性氣喘的中草藥醫藥組合物及其制造方法。
背景技術：
過敏原所造成的疾病，例如氣喘，仍然是世界上嚴重的健康問題之一。近來這些過敏相關的免疫疾病，也傾向年輕的族群。換言之，更多的兒童及青少年發生過敏造成的免疫性疾病癥狀。眾多醫生與科學家相信，這些早發的過敏相關免疫性疾病，是由于環境污染所造成的。
盡管受影響的族群比例及其病征的嚴重性不斷地增加，造成此一現象的確實原因卻還不甚明了。因此，目前治療氣喘的方法仍然主要依靠經驗法則與意外尋得的方法為主，而非利用科學方法。現今抗氣喘的藥物治療主要著重在改善現今的治療方式(如拮杭白三烯素(antl-leukotriene)，或是由抑制發炎相關的細胞激素來減緩與消除發炎反應(如吸入類固醇)。然而，有濕疹與枯草熱病史的兒童也特別容易受到氣喘的威脅，而所產生的問題是，會經常發作的慢性氣喘病患需要每天服用抗氣喘的藥物，并長年服用。為了回應這類的問題，測試傳統中草藥的療效是有必要的，尤其是許多文獻均指出這些草藥對于過敏性疾病如過敏性皮膚炎具有良好的效果。
傳統的中草藥已被使用來治療遺傳的過敏性皮膚炎及氣喘病。結果顯示，使用傳統的中草藥后，大部分患者的一般性癥狀均獲得改善，但少部分患者仍因為不明的原因，無法治愈。有些草藥能在短期內顯現效果，且只有少數的副作用，但對于預防疾病的長期療效則仍須更多的科學研究。因此，需要傳統中草藥的更進一步研究。下列文獻指出草藥具有調節免疫反應的功能，但其中大部分仍有明顯的不確定因子，并需要仔細的研究。
以美國專利第09/949,610號申請案為例，該發明公開一種用于鼻炎的醫藥組合物，其包括麥冬(Tuber Ophlopogon)、半夏(Tuber Pinelliae)、甘草(Radix Glycyrrhizae)與西洋參(Radix Pancis Quinquefoli)的水溶液萃取物，以及Herba Tridacls procumbentis的50％乙醇萃取物。該處方包含5種草藥，并具有消炎的良好效果。然而，由于該配方僅具有短期舒緩癥狀的效果，因此不容易控制它的長期療效。
WO 02/78723 A1公開一種制備具補腎以及抗氣喘效果的中草藥成分，該中草藥包括紫蘇(Perilla Frutescens)、苦杏仁(Prunus Armeniaca)、甘草(Glycyrrhiza Uralensis)、黃苓(Scutellaria Baicalensis)、黃連(CoptisChinesis)、款冬(Tusilago Farfara)、直立百部(Stemona Sessllifolia)、貝母(Fritllaria Cirrhosa)、參還毛蚓(Pheretima Aspergillum)、補骨脂(PsoraleaCorylifolia)、黨參(Codonopsis Pilosula)、六列大麥(Hordeum Vulgara)、六曲(Massa Fermentata Medicalis)、五味子(Schisandra Chinensis)以及石膏(Gypsum)。由于這個處方包含15神不同的草藥，因此草藥萃取物的品質很難掌握。而且不容易觀察處方中每個成分各自的藥理反應。
WO 02/32440公開一種治療氣喘的九里香(Murraya koenigii)萃取物。
GB 2274059公開一種可舒緩氣喘的醫藥組合物，其成分中包含芍藥。這些發明使用單一植物成分來治療或舒緩急性的氣喘癥狀，但均無法維持長期的療效。
因此，提供一種更簡單的組合物及其制備方法，能夠使有效成分在治療疾病之前不會變化，并能改善治療免疫疾病的長期療效，以排除前述問題的方法是值得研究的。
有些具有抗發炎反應效果的中草藥，可能對治療免疫失調疾病有效果。例如，早在公元二世紀以前，中國就有以黃芩(Scutellarla Baicalensis)抗發炎的文獻紀錄，尤其是作為治療濕熱證(hot&damp)類疾病如痢疾與腹瀉的主要成分之一。然而，文獻并無記載如何將其制成可長期保存的均質粉末，以及應該如何使用來治療過敏性氣喘。因此，本發明公開一制程，以最少的步驟來制備包含黃芩(Scutellaria Baicalensls)及其他三種草藥萃取物的有效成分，并由活體外及活體內實驗，顯示其良好的效果。換句話說，黃芩(Scutellaria Baicalensis)與其他三種草藥萃取物的組合可以提供延長數種活性成分穩定性的優點，并顯示出對于抗過敏性氣喘的效果，以及降低藥物對人體的毒性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種免疫性疾病的醫藥組合物，可緩和過敏性氣喘，并可有效地治療病患的過敏性氣喘。
為實現上述目的，本發明提供的醫藥組合物，包括一山藥(Radix Dioscorea)萃取物；一澤瀉(Rhizoma Alismatis)萃取物；一茯苓(Poria cocos(schw)Wolf)草取物；以及一黃芩(Scutellaria Baicalensis)萃取物。
其中山藥，澤瀉以及茯苓萃取物是以0-95％的乙醇萃取。
其中黃芩萃取物是以40-99％的乙醇萃取。
其中該山藥萃取物、澤瀉萃取物、茯苓萃取物以及黃芩萃取物，分別萃取自山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩。
其中該山藥萃取物、澤瀉萃取物、茯苓萃取物以及黃芩萃取物，是同時萃取自山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的混合物。
其中還包含一賦形劑。
其中該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的重量比為1∶1-2∶0.5-2∶1-3。
其中該醫藥組合物用于治療過敏性氣喘病患。
本發明還提供了制備上述醫藥組合物的方法，包含下列步驟分別以乙醇萃取山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的萃取物；分別過濾并濃縮該萃取物，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃琴的濃縮物；以及將該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的濃縮物混合一起；其中，該乙醇濃度為40-95％。
該方法還包括分別或共同濃縮該各濃縮物，以進行山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的混合干燥制粒。
該方法還包括在形成顆粒前，添加一賦形劑至該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩濃縮物。
其中該顆粒是以膠囊包覆。
其中該乙醇濃度為0-90％。
其中該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的重量比分別為1∶1-2∶0.5-2∶1-3。
本發明的制備方法還可以是下列步驟混合山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩以產生一混合物；以乙醇萃取該混合物，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的乙醇萃取物；以及過濾并濃縮該萃取物，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的濃縮物，其中，該用以萃取的乙醇濃度為0-95％。
還包括將該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩濃縮物，以噴霧-干燥法制成顆粒。
還包括在形成顆粒前添加一賦形劑、淀粉與磷酸鈣(Ca3(PO4)2)至該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的濃縮物。
其中該顆粒是以膠囊包覆。
其中該萃取用的乙醇濃度為0-50％。
其中該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩濃縮物的重量比分別為1∶1-2∶0.5-2∶1-3。
圖1為一種造成過敏性氣喘的可能機制的示意圖(引自‘Nature’402，12-17(1999)，P.G.Holt，C.Macabas，PA.Stumbles與P.D.Sly)；其中IL-4是分泌自Th2細胞的主要細胞激素，與重要的脂肪介質-白三烯素，同時在急、慢性過敏發炎反應中扮演重要角色；圖2a顯示以各種組合物抑制細胞株EL-4與THP-1分泌IL-4與TNF-alpha的體外實驗結果圖。圖示下方文字中的符號“aq”代表草藥的水溶液萃取物，符號“et”則是代表草藥的乙醇萃取物；圖2b顯示不同濃度TCM-B抑制RBL-1細胞分泌半胱胺酰基白三烯素(cysteinyl-leukotrienes，c-LTs)及其細胞毒性的體外實驗結果圖；圖3a是以MTT實驗檢測不同濃度TCM-B抑制BEAS-2B細胞分泌eotaxin及細胞存活率(細胞毒性)的體外實驗結果圖；圖3b是顯示以包含36％淀粉與1.9％磷酸鈣(Ca3(PO4)2)的TCM-B粉劑，測試EL-4細胞株分泌IL-4的影響。橫座標顯示粉劑的濃度，賦形劑淀粉與磷酸鈣已事先測試過不干擾EL-4細胞株分泌IL-4的現象；圖4a顯示各種組合物及TCM-B混合物抑制腹膜部位的巨嗜細胞分泌TNF-alpha的體外實驗結果；圖4b顯示以MTT實驗檢測各種組合物及TCM-B混合物作用于腹膜部位的巨嗜細胞的細胞毒性；圖5顯示測定肺功能時，壓力增加的訊號，(B)圖中Penh值從0.9至3.95，顯示出實驗用的過敏老鼠其肺功能衰退，是檢測老鼠時一完全不同的參數(引用自E.Hamelmann and E.W.Gelfand in Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons，Inc.，edited by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Matgulies，E.M.Shevach，and W.Strober，Vol.3，Chapter15，18，1-18.13(1999))；圖6顯示與正常生理食鹽水，TCM-B，及去除澤瀉萃取物后的TCM-A相比，TCM-B可防止因乙酰丑甲基膽素(methacholine)的劑量從低到高，所造成的肺功能衰退；圖7是在5組實驗老鼠血清中，IgE的滴定值；圖8是在5組實驗老鼠的血清以及BAL沖洗液中，IL-5的濃度；圖9是在5組實驗老鼠的血清以及BAI沖洗液中，IFN-γ的濃度；圖10是在5組實驗老鼠中，TCM-B(1217B)提升血液中調節T細胞能力的結果圖。
具體實施例方式
抗原或過敏原引起的氣喘是由慢性發炎反應引起的呼吸疾病。發炎反應是由細胞釋放的發炎因子，如血小板活化因子(platelet activationfactor)、組織胺(histamine)、前列腺素(prostaglandin)以及白三烯素(leukotriene)所調控。發炎反應會刺激T淋巴細胞，尤其是CD4+細胞的抗原反應。主要有兩種CD4+細胞。CD4+細胞中的T助手細胞1(Th1)分泌細胞激素如IFN-γ，T助手細胞2(Th2)則分泌干擾素(interleukin)如IL-4及IL-5。分析過敏性氣喘病患的血液、支氣管肺泡灌洗液與支氣管黏膜樣本，發現Th2細胞活性較強。過敏原刺激Th2細胞產生過量的IL-4，促使B淋巴細胞制造并分泌IgE，如圖1所示。氣管上皮細胞所分泌的eotaxin同時吸引眾多的eosmophils聚集于該發炎發生位置。本發明醫藥組合物可預防發炎因子與IL-4的釋出。
以下說明僅為本發明實施例，不應作為本發明范圍的即制。
實施例1醫藥組合物TCM-A的制備一種醫藥組合物，由下列五個步驟制得(1)取400公克的山藥(Radix Dioscorea)莖或根、300公克的茯苓(Poriacocos(schw)Wolf)以及500公克的黃芩(Scutellaria Baicalensis)，分別切碎成小片。
(2)將山藥與茯苓分別浸泡于2000毫升水中，黃芩浸泡于70％乙醇中30分鐘。每種溶液分別以85℃加熱60分鐘。之后分別得到山藥、茯苓以及黃芩的萃取物。
(3)萃取物冷卻后，將其分別以篩網過濾(約100目)。收集過濾液，并在真空條件下(30torr)，以50至60℃進行濃縮而獲致藥草濃縮液。
(4)在將每種濃縮液冷凍干燥之前，添加作為賦形劑的足量羧基甲基纖維素(carboxyl methylcellulose)，然后將其分別制成顆粒狀粉末。
(5)再將個別的粉末混合均勻，所形成的混合顆粒，稱為TCM-A，并將其制成膠囊。
實施例2醫藥組合物TCM-B的制備一種醫藥組合物，可經由下列五個步驟制備(1)取400公克山藥的莖或根、400公克的澤瀉、300公克的茯苓以及500公克的黃芩，分別切碎成小片。
(2)山藥與茯苓分別浸泡于2000毫升的水中，澤瀉浸泡于50％乙醇中，而黃芩則另外浸泡于70％乙醇中各30分鐘。每種溶液分別于85℃加熱60分鐘，之后分別得到山藥、澤瀉、茯苓以及黃琴的萃取物。
(3)等萃取物冷卻后，將其分別以篩網過濾(約100目)成過濾液。個別的過濾液經收集后，在真空條件下(30torr)，以50至60℃進行濃縮，得到各草藥的萃取濃縮液。
(4)于各濃縮液進行冷凍干燥前，添加足量羧基甲基纖維素(作為賦形劑)，并分別制成顆粒狀。
(5)將各草藥顆粒進行混合，形成混合的顆粒即為TCM-B，并進行膠囊制成。
實施例3醫藥組合物TCM-C的制備一種醫藥組合物，可經由下列步驟制備(1)取400公克山藥的莖或根、400公克的澤瀉、300公克的茯苓以及500公克的黃芩，分別切碎成小片。
(2)將前三種草藥一起浸泡于2000毫升的50％乙醇中，而黃芩另外浸泡于70％乙醇中。乙醇溶液加熱30分鐘后，得到山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的乙醇萃取物。
(3)等萃取物冷卻后，將其以篩網過濾(約100目)，并混合形成一過濾液。該過濾液在真空條件下(30torr)，以50至60℃進行濃縮。然后在真空條件下，將濃縮液以冷凍干燥法制成粉末。
(4)添加足量羧基甲基纖維素或磷酸鈣(Ca3(PO4)2)(作為賦形劑)至干燥粉末中并混合均勻。將全部的混合物以冷凍干燥法制成顆粒狀，并命名為TCM-C。
(5)將顆粒于干燥環境下制成膠囊，并充氮裝瓶。
實施例4醫藥組合物TCM-D的制備一種醫藥組合物，可經由下列步驟制備(1)取400公克的山藥莖或根、400公克的澤瀉、300公克的茯苓以及500公克的黃芩，分別切成小碎片，再混合成一混合物。
(2)將前述四種草藥的混合物一起浸泡于6000毫升的50％乙醇。將該乙醇溶液加熱60分鐘后，得到混合山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的乙醇萃取物。
(3)等該萃取物冷卻后，將其以篩網過濾(約100目)。收集過濾液，并在真空條件下(30torr)，以50至60℃進行濃縮。將獲得的濃縮液于真空下進行冷凍干燥。
(4)添加足量的羧基甲基纖維素或磷酸鈣(Ca3(PO4)2)(作為賦形劑)到干燥粉末中，并混合均勻。將整個混合物以冷凍干燥法制成顆粒，并命名為TCM-D。
實施例5活體外試驗以下將測試幾種草藥抑制IL-4的效果。如圖2a、2b及圖3所示，清楚地顯示山藥、澤瀉以及黃芩可抑制IL-4、TNF-alpha以及eotaxln的釋放。
(A)抑制培養的細胞株產生細胞激素(1L-4，TNF-alpha)于實驗日程中，草藥于細胞培養液中，稀釋成終點濃度(0.5ug/ml、5ug/ml或視所需的適當濃度配置)。分別測量每種草藥組成物或其混合物對IL-4、TNF-alpha產生的影響，并測量半胱胺酰基白三烯素(cysteinyl-leukotrienes，c-LTs)。
A1以EL-4細胞株評估IL-4將老鼠胸腺細胞株EL-4培養于每種組合物或混合物2小時，再以100ng/ml的A23187以及PMA進行刺激。組織培養液的樣本在細胞培養24小時后收取，并保存于攝氏零下負70度直至進行分析試驗。
采用商品化可購得的ELISA檢驗套組(R&D Systems，Minneapolis，Minn)，并依照其使用指示，進行細胞激素的評估。簡言之，在含有預先布放的抗細胞激素抗體的微量滴定盤中，分別于每個滴定孔中加入100ul試驗溶液，再加入依照實驗需求稀釋過的標準/樣本溶液100ul，培養于室溫。2小時后，將該滴定盤以洗劑沖洗3次，二次抗體及偵測用抗體以稀釋劑稀釋為1∶200后，加入100ul于每個滴定禮中，將滴定盤封緊，室溫培養2小時。之后分別于每個滴定孔中加入以稀釋劑稀釋至1∶200的streptavidin-HRP反應受質，于黑暗室溫下培養20分鐘。每個滴定孔在將未結合于孔內的streptavidin-HRP吸除并洗凈后，加入受質反應液(TMB)，于黑暗室溫下培養30分鐘，再分別加入50ul 2N的硫酸溶液以終止反應。以微量滴定盤讀取機于450nm波長下檢測其光學反應數據。
評估TNF-alpha的步驟輿前述IL-4的方法完全相同，僅將培養的細胞株由EL-4替換為THP-1，而所評估的活性是以抗TNF-alpha的抗體。
如圖2a所示，由于澤瀉以及黃芩的乙醇萃取物的抑制作用，IL-4與TNF-alpha的表現量顯著地降低(分別為90％的TNF-alpha、17％的IL-4以及78％的TNF-alpha、47％的IL-4)。在濃度0.2mg/ml的條件下，山藥的乙醇萃取物分別抑制40％的IL-4以及20％的TNF-alpha。大部分萃取物抑制細胞激素的效果與其使用的劑量有關，而當細胞激素的濃度如同細胞培養液般降低時，蛋白質分解即增加。至少就某部分而言，如同草藥萃取物在體內具有免疫抑制效果一樣，體外試驗中，細胞激素產量的降低亦起因于EL-4與THP-1細胞株生長量的減少。
除了將細胞株改為THP-1，并以RPMI為培養液，其他實驗步驟均與前述評估IL-4的相同。滴定孔中的上清液包含TNF-alPha的抗體，并經由ELISA方法確定TNF-alpha的分泌量。
A2以MTT法檢測每個滴定孔中各草藥的細胞毒性以EL-4細胞分解MTT的能力，評估各種組合物或混合物的細胞毒性。MTT(3′，5′-Dimethyl-thiazol-2y1-2，5-diphenyltetrazolium bromide)，是一種黃色化合物，可被粒腺體酵素分解為紫色結晶產物(稱為formazan)，并可提供或引發細胞的相容性或細胞毒性。
由前述方法評估IL-4、TNF-alpha c-LTs，可以得知EL-4、THP-1與RBL-1細胞株的細胞毒性。將5mg/ml的MTT(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO.)溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，以制備MTT濃縮液。在指定的條件下培養21小時后，將5ul的MTT加入每一個培養滴定孔中。再經過4小時培養后，加入DMSO以停止反應。以Molecular Device的微量滴定盤讀取機，560nm的波長量測樣品的光學密度。資料為測量樣品的光學密度與未處理的對照組的比例。
A3以RBL-1細胞株評估半胱胺酰基白三烯素(Cysteinyl-leukotrienes，c-LTS)以0.1ug/ml甲酸(Retinoic acid)刺激RBL-1細胞株(大鼠嗜堿性淋巴球-1細胞)16小時，以活化細胞內LTC4合成酶。然后將草藥組成混合物加入培養液中，并于37℃培養2小時。隨后再加入10uM的A23187，以刺激制造c-LTs。培養15分鐘后，終止實驗，并收集上清液100ul。細胞上清液中c-LTs的濃度以一ElISA檢驗套組(Cayman Chemical，Michigan，USA)，依照其使用手冊進行評估。
A4以老鼠腹膜巨噬細胞評估TNF-alpha腹膜巨噬細胞是取自事先進行腹腔注射3％Brewer thioelycolate培養液的6-8周大的雄性Balb/c老鼠。7天后，以冰的RPMI-1640培養液與10％FBS灌洗腹腔，收集腹膜細胞，并將其培養于37℃，2小時。非附著性的細胞將會被沖洗下來，并作為TNF-alpha試驗用。在該試驗中，一特殊的P-38 MAP激酶的抑制劑-SB203580，將作為各試驗的正對照組(positive control)。如圖4a所示，由SB203580引起的抑制反應，亦可做為細胞對LPS反應的指標。
(B)抑制人類BEAS-2B細胞分泌eotaxin本實驗所使用的BEAS-2B細胞是取自美國菌種保存中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)。BEAS-2B上皮細胞分離自非死于癌癥的尸體的人類支氣管上皮細胞。
本實驗包括兩個部分，細胞毒性測試，以及抑制eotaxin分泌測試。每一種醫藥組合物及混合物將會先進行細胞毒性的測試，說明如下，并以細胞的存活百分比表示。如圖3a所示，百分比越高，代表測試的物質對細胞而言是無毒性的。通常，無毒性的草藥混合物的細胞存活率高達80％以上，該混合物將被用來進行抑制eotaxin分泌的試驗。
在eotaxin分泌試驗中，BEAS-2B細胞以DMEM/F12培養液培養于96孔滴定盤中，在37℃環境下培養一天。BEAS-2B細胞培養于添加特定濃度的草藥混合物的培養液中，37℃，2小時；再添加含100ng/ml IL-13以及100ng/ml TNF-α的PBS 20ul，于37℃培養72小時，以刺激BEAS-2B細胞。之后，收集上清液100ul，以ELISA法檢測eotaxin的含量。未添加任何草藥混合物或是垂體腺苷酸化酶勝肽(pituitary adenylate cyclasepolypeptides，PACAP)的培養液，其細胞分泌etotain的量為基本值。添加0.001uM的PACAP所抑制eotaxln的量，則作為驗證實驗正確性的正對照組。
圖3a的資料顯示，包括山藥、澤瀉、茯苓、黃芩的TCM-B混合物0.5ug/ml，可以明顯抑制BEAS-2B分泌eotaxin，同時并不會對細胞產生毒性作用。圖3b的數據則顯示TCM-B對于EL-4細胞株分泌IL-4的抑制情形。此抑制反應與劑量相關，最高劑量500ug/ml即對EL-4細胞株的生長發生影響。以包含36％淀粉與1.9％磷酸鈣(Ca3(PO4)2)的TCM-B粉劑，測試EL-4細胞株分泌IL-4的影響。此測試同時也用以檢驗一般賦形劑，如淀粉與磷酸鈣，對于EL-4細胞株分泌IL-4是否發生影響。結果顯示，賦形劑，如淀粉與磷酸鈣，對于EL-4細胞株分泌IL-4的現象并沒有影響。含TCM-B與賦形劑的粉劑，對于EL-4細胞株分泌IL-4的現象具有一致的抑制效果，因此淀粉與磷酸鈣在草藥粉末制備成顆粒的過程中加入，作為賦形劑。
圖4a顯示，50ug/ml濃度的TCM-B對于腹膜巨嗜細胞分泌TNF-alpha的現象具抑制效果。但TCM-B的抑制效果與等量的澤瀉萃取物相比，較不明顯。然而，如圖4b所示，50ug/ml濃度的澤瀉萃取物對于腹膜巨噬細胞卻具有一定程度的細胞毒性。在抑制BEAS-2B細胞分泌eotaxln，增加細胞存活率的實驗中，也發生相同狀況。因此，混合山藥、澤瀉、茯苓、黃芩的組合物TCM-B，不只可以維持其抑制TNF-alpha分泌的效果，也可以降低TCM-B對所培養的細胞株所可能產生的細胞毒性。
Example 6.活體內實驗(A)實驗動物雄性Balb/c老鼠是來自國家實驗動物中心，并飼養于無特定病原的環境。這些老鼠均為6-8周大。依照處理方式不同，6只老鼠分為一組，每組的老鼠均分開飼養。重組的Dermatophoides pteronyssinus group 2(Derp 2)是由蔡博士提供，而傳統中藥A(Traditional Chinese Medicine A，TCM-A，圖7、8、9與10中的1217A)以及傳統中藥B(Traditional ChineseMedicine B，TCM-B，圖7、8、9與10中的1217B)則來自臺灣新竹的工研院生醫中心。
(B)引發過敏性氣管發炎反應老鼠于分別第0天與笫7天，以腹腔注射的方式，注射以4ug/0.062ml氧化鋁(aluminum hydroxide，Al(OH)3，Whitehall Lab Ltd，Punchbowel，Australia)乳化的1ug/0.1ml Der p 2使其發生免疫反應。之后，以TCM喂食老鼠3周。不同組別的老鼠，分別喂食地塞吳松(Dexamethasome)(每鼠每天1ug)，TCM-A(每鼠每天20mg)，TCM-B(每鼠每天20mg)或是一般的生理食鹽水每鼠每天500ul。在第28與35天時，將老鼠以60mg/kg劑量的苯巴比妥鈉(sodium pentobarbital，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)經由腹膜注射使輕微麻醉后，自氣管接種1ug/50ul的Der p 2。并于第二次接種后24小時，測量肺功能，隨后將老鼠犧牲。
(C)測定肺功能將每只老鼠故于氣壓體積測量儀(Buxco electronics，Troy，NY)中。該測量儀包括有兩個空室一個是主室，或稱為動物室(內徑7.5公分，3.5公分高)；另一個則為參考室(內徑7.5公分，3.5公分高)。一壓力差轉移器被用來偵測前述兩個空室的壓力差。該壓力差經由模擬/數字訊號轉換放大后，將訊號傳送至一載有BioSystem XA系統(Buxco，Electronics，Troy，NY)的電腦，并進行樣品的呼吸參數分析。與Hamelmann等人(1997)的報告相似，增強性間歇(enhanced pause，Penh)，間歇(pause)，潮氣量(tidalVolume，VT)，呼吸頻率(breathing frequency，f)，最高吸氣量(peak inspiratoryflow，PIF)，最高呼氣量(peak expiratory flow，PEF)，吸氣未間歇(end-inspiratory pause，EIP)以及呼氣未間歇(end-expiratory pause，EEP)等參數將可測得，結果如圖5所示。
將5毫升的食鹽水或乙酰丑甲基膽素(methacholine，1.56至50.00mg/ml)溶液置于超音波霧化機(ultrasonic nebulizer，DeVilbiss，Somerset，PA)中，可產生霧氣，并經由三向管連接至氣壓體積測量儀的動物室。霧氣的平均大小約為3um，依據不同制造商的規格，其大小范圍自1至5um。通常在15至20秒內，霧氣可以充滿空室。開始時，先讓老鼠吸入食鹽水氣3分鐘，再測量其呼吸參數3分鐘。然后，以乙酰丑甲基膽素替換食鹽水氣，并讓老鼠吸入3分鐘。曝氣后，立即將空室內的霧氣排除。吸入乙酰丑甲基膽素霧氣后，測量呼吸參數3分鐘。乙酰丑甲基膽素劑量-反應曲線是由低劑量至高劑量來表示。如圖5所示，TCM-B與地塞美松可以改善肺功能以及過敏動物的免疫發炎反應。每兩次曝氣之間，有15分鐘的間隔。數據為平均值±SEM。不同組之間參數的差異，將分析其變數。如果，不同組之間有顯著的差異，將以Newman-Keuls法分析任兩組間的統計上的差異。曝氣于食鹽水或乙酰丑甲基膽素之前或之后的數值差異，將以成對t法分析。食鹽水對照組與未實驗組之間的差異，將以非成對t法分析。若是p值小于0.05，該差異視為顯著。
(D)樣品收集與制備測量肺功能后，支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)將依下列方法進行。分2次注射1毫升消毒、無內毒素的食鹽水，自氣管注射至鼠肺中。回收大約1.8毫升的BAL沖洗液。該帶有氣體的BAL沖洗液在實驗前保存于-70℃。于全白血球計數后，100毫升BAL沖洗液經過細胞離心，以Liu染劑染色(Tonyar Diagnostic Inc，Taipei shien，Taiwan)并分別計算細胞。結果顯示于圖6與下面表1，TCM-A與TCM-B均可降低BAL沖洗液中有發炎反應的細胞數。血液樣本采自眶賓(orbitalsinus)，而取得的血清在實驗前保存于-70℃。
表1
(E)測定具Der p 2專一性的TgG1、IgG2a與IgE抗體在實驗開始與結束前后，自眼窩(retro-orbital venous plexus)取血。由ELISA法，測定血清中抗Der p 2的IgE、IgG1以及IgG2a的效價。將微量滴定盤(Nunc Lab，IL，USA)表面覆上濃度為0.5ug/ml的100ul Der p 2，置放于4℃冰箱中隔夜。滴定盤以PBS-Tween-20(PBST)沖洗三次，并保存于-70℃直到使用。添加老鼠血清以1∶5稀釋的IgE，1∶100稀釋的IgG1，及1∶5稀釋的IgG2a后，將淌定盤置放于4℃中隔夜，在添加抗體(HRP-鍵結的山羊抗老鼠的抗體，其中抗IgE與抗IgG2a的抗體為1∶800稀釋，抗IgG1抗體為1∶2000稀釋，購自Southern Biotech Assoc，Inc，Birmingham，AL，USA)前清洗3次。在37℃培養1小時后，以PBST沖洗3次，再添加酵素反應受質ABTS(2，2″-Azion-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid)diammonilum salt，Bio-Rad，USA)。15分鐘后，加入50ul 4NH2SO4以終止反應，并以多波長的分光光度計(A-5682，SLT Lab Instruments，Salzburg，Austria)以450nm波長測量光度。結果以ELISA單位(EU)表示。一個EU定義為血清稀釋后的倒數，所測得的光度值為1.0。該結果均落在稀釋曲線的線性部分。為了確認再現性，在每次實驗中將一個已知的血清作為標準值。圖7是為試驗血清中，IgE的滴定濃度。
(F)老鼠樣本中的細胞激素試驗以商品購得的ELISA檢驗套組測量IFN-γ與IL-5，并使用老鼠的單株抗體，以決定細胞激素表面不同的抗原決定位(epitopes)。最低的檢測范圍是10pg/ml。結果如圖8、9所示。
(G)支氣管肺泡灌洗所得的淋巴球的培養，免疫螢光染色以及流式細胞分析(flow cytometry analysis)依照Assenmacher等人(1994)提出的方法，可以流式細胞分析測量老鼠T助手細胞活化的細胞激素。雙染色法被用來分析在CD4或CD8細胞IFN-γ與IL-5的表現。來自周邊血液的白血球，是經過PMA(50ng/ml)、ionomycin(2uM)與GolgiStop(Cytofix/Cytoperm Plus Cat No.2076KK，Pharmingen，San Diego，CA)5小時的刺激，再以PBS沖洗2次。在室溫下，細胞以CD4-FITC或CD8-FITC染色30分鐘，再加以清洗。細胞于室溫下，以cytofix/cytoperm固定30分鐘，再以抗細胞激素的抗體染色30分鐘，再沖洗。將細胞重新懸浮于含有0.1％疊氮化鈉(sodium azide)的0.5mlPBS中。以Becton Dickinson flow cytometry(Becton Dichnson，CA，USA)讀取螢光值。每個樣本將分析2000個細胞。參照圖10，顯示TCM-B具有較佳調節血液中T細胞的能力。
(H)統計分析結果是以算數平均數±SEM來表現。組別的差異是以Mann-WhitineyU法來分析。若P值小于0.05，則視為統計上的顯著差異。
前述的例子著重于評估本發明的醫藥組合物的療效。該配方可以抑制呼吸道的免疫性發炎反應，改善肺功能，降低血液中IgE含量，并防止氣喘發生。
雖然本發明由最佳實施例說明內容，但在不背離本發明的精神與范疇下，均可對本發明有種種改變及修飾，以適用于種種用途與情況。換言之，對本發明中配方的形式與細節的省略、修飾、減損、與改變，在不背離本發明的精神與范疇下，均可由熟習本項技術加以進行。
不須再進一步詳述，相信上述說明已能充分表達本發明，他人可在對組成本發明必要的特征不忽略的情形下，對本發明有種種改變。
權利要求
1.一種免疫性疾病的醫藥組合物，包括一山藥(Radix Dioscorea)萃取物；一澤瀉(Rhizoma Alismatis)萃取物；一茯苓(Poria cocos(schw)Wolf)草取物；以及一黃芩(Scutellaria Baicalensis)萃取物。
2.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中山藥，澤瀉以及茯苓萃取物是以0-95％的乙醇萃取。
3.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中黃芩萃取物是以40-99％的乙醇萃取。
4.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中該山藥萃取物、澤瀉萃取物、茯苓萃取物以及黃芩萃取物，分別萃取自山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩。
5.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中該山藥萃取物、澤瀉萃取物、茯苓萃取物以及黃芩萃取物，是同時萃取自山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的混合物。
6.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中還包含一賦形劑。
7.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的重量比為1∶1-2∶0.5-2∶1-3。
8.如權利要求1所述的醫藥組合物，其特征在于，其中該醫藥組合物用于治療過敏性氣喘病患。
9.一種制備權利要求1所述醫藥組合物的方法，包含下列步驟分別以乙醇萃取山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的萃取物；分別過濾并濃縮該萃取物，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃琴的濃縮物；以及將該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的濃縮物混合一起；其中，該乙醇濃度為40-95％。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，還包括分別或共同濃縮該各濃縮物，以進行山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的混合干燥制粒。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，還包括在形成顆粒前，添加一賦形劑至該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩濃縮物。
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于，該顆粒是以膠囊包覆。
13.如權利要求9所述的方法，其特征在于，該乙醇濃度為0-90％。
14.如權利要求9所述的方法，其特征在于，該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的重量比分別為1∶1-2∶0.5-2∶1-3。
15.一種制備權利要求1所述醫藥組合物的方法，包含下列步驟混合山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩以產生一混合物；以乙醇萃取該混合物，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的乙醇萃取物；以及過濾并濃縮該萃取物，以產生山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的濃縮物，其中，該用以萃取的乙醇濃度為0-95％。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，還包括將該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩濃縮物，以噴霧-干燥法制成顆粒。
17.如權利要求15所述的方法，其特征在于，還包括在形成顆粒前添加一賦形劑、淀粉與磷酸鈣(Ca3(PO4)2)至該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的濃縮物。
18.如權利要求15所述的方法，其特征在于，其中該顆粒是以膠囊包覆。
19.如權利要求15所述的方法，其特征在于，其中該萃取用的乙醇濃度為0-50％。
20.如權利要求15所述的方法，其特征在于，其中該山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩濃縮物的重量比分別為1∶1-2∶0.5-2∶1-3。
全文摘要
一種免疫性疾病的醫藥組合物及其制備方法，包括山藥、澤瀉、茯苓以及黃芩的乙醇萃取物。本發明制程包括以一特定濃度范圍乙醇進行熱萃取，過濾，調節酸堿值，純化，濃縮，適度地混合，并經冷凍干燥制成顆粒狀粉末。本發明進行活體外與活體實驗，以驗證特定藥用植物萃取物組合療效。藥草萃取物組合物可以增加抗發炎反應，并調節細胞激素如eotaxin以及干擾素－4(1L－4)等分泌。本發明醫藥組合物運用于氣喘發生時，具有緩解咳嗽，增加肺功能，降低血液中特定過敏原IgE的作用，預防氣喘。
文檔編號A61P11/06GK1611235SQ20031010294
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月31日 優先權日2003年10月31日
發明者呂榮銘, 潘一紅, 羅吉孟, 江淑芬, 蘇曉霓, 申仕政, 許乃云, 吳信頡, 賴義隆, 蔡肇基, 李連滋 申請人:財團法人工業技術研究院