以紅細胞作為載體延長蛋白質藥物的體內半衰期的方法

專利名稱：以紅細胞作為載體延長蛋白質藥物的體內半衰期的方法
技術領域：
本發明涉及一種用紅細胞作為載體延長蛋白質藥物半衰期的方法。
背景技術：
近年來，由于基因工程的普及應用，蛋白質類藥物在臨床上(包括心血管疾病的治療)的應用越來越廣。但由于本身理化性質的原因，大多數蛋白質藥物不太穩定，在體內的半衰期很短，很多藥物需要每天給藥。同時，由于消化道中蛋白酶的存在，蛋白質藥物很難通過口服給藥，連續的滴注給藥或持續的注射給病人帶來精神和肉體上的雙重折磨。因此越來越多的研究機構將精力集中在蛋白質藥物的劑型研究上，主要是研究長效藥物和口服、噴霧給藥等。
目前有關長效藥物的研究主要集中在以下幾個方面1.蛋白質的修飾主要是PEG修飾和糖基的修飾。其中，PEG化的IFN(干擾素)、G-SCF(粒細胞集落刺激因子)已經研究成功，并且在美國成功上市。而Amgen公司通過改變EPO(紅細胞生成素)的糖基化位點增加重組人EPO的唾液酸修飾從而使EPO的半衰期延長了幾倍。
2.融合蛋白的方式研究表明一些小分子蛋白通過與白蛋白、免疫球蛋白Fc段融合的方式增加了蛋白分子量，延長了蛋白在體內的半衰期。
3.劑型的改變兩性酶素的脂質體劑型研究成功給蛋白質藥物的研究給了很多啟示。研究者用脂質體包埋蛋白質藥物，防止蛋白酶的降解和延緩在體內的代謝。此外，還有借用凝膠等物質將藥物植入體內，然后藥物通過凝膠緩慢的釋放。
4.借用機械的方式實現藥物的緩慢釋放通過微泵的方式實現藥物在體內的緩慢的可控的釋放。
紅細胞承擔著給機體輸送氧氣的任務，血液中血細胞絕大多數為紅細胞，紅細胞的體內平均壽命在120天左右，而且紅細胞一般局限在血液系統內循環。因此，有人嘗試使用紅細胞作為藥物載體以傳送藥物。國內對此也有一定的研究。南京鼓樓醫院麻醉醫師汪小海、駱璇等經過兩年的研究，發明了一種優化藥物生物效應的新技術——紅細胞包蔽嗎啡溶液用于病人術后鎮痛，即運用自身紅細胞作為藥物載體，在病人手術麻醉前，抽取其3毫升靜脈血，采用高滲法將鎮痛藥物嗎啡包裹于紅細胞內，在病人手術完成時，把包蔽嗎啡的血液重新輸回到病人體內，使得嗎啡藥物在人體內緩慢釋放，從而達到了術后長效鎮痛的目的。新的止痛方法，具有較好的安全性并且費用低廉。
但是，以上研究局限于用藥物進入紅細胞內，然后再緩慢釋放，這種技術不大適合蛋白質類藥物，因為蛋白質類藥物分子量較大，很難進入細胞內部。
近年來，生物技術的發展給眾多的心血管疾病患者帶來福音，已經上市的溶栓藥物尿激酶、鏈激酶、組織纖溶酶原激活物等挽救了許許多多的心肌梗塞及中風病人。但溶栓以后往往會出現出血以及再栓塞等反應。如何防止溶栓后的再栓塞及降低出血反應成為一個十分重要的研究課題。

發明內容
如上所述，本領域仍需要一種技術，該技術能將蛋白質藥物傳送到體內，并能延長該藥物的體內半衰期。本發明即能滿足這種需求。
因此，本發明的一個目的是提供一種延長蛋白質藥物在體內半衰期的方法，該方法采用化學交聯或標記后親和作用的方式將蛋白質藥物連接在紅細胞表面，從而延長了藥物的體內半衰期。
本發明所述的蛋白質藥物指直接在血液系統中起作用的蛋白質，包括但不限于水蛭素、尿激酶、鏈激酶、尿激酶原、蝮蛇抗栓酶等藥物。本發明的蛋白質藥物優選溶栓藥物和抗凝藥物，如尿激酶原、鏈激酶、水蛭素等。其中，水蛭素是迄今為止發現的最強有力的凝血酶抑制劑，還有很強的抗血栓作用，對多種實驗性血栓模型有阻抑作用。其中對凝血酶或內毒素所致的彌散性血管內微血栓形成作用最強。其次，對靜脈阻塞所致的頸靜脈血栓也有較強的抗血栓作用。此外，水蛭素對血管內膜損傷及旁路循環的動脈血栓形成、化學損傷所致的冠脈血栓形成以及電流刺激所致的冠脈血栓的產生、實驗性冠脈血栓經鏈激酶溶栓再通后血栓性再阻塞的發生有明顯阻抑作用。重組水蛭素的抗凝效力與其在血液中的濃度相關。水蛭素在體內不降解，在組織中無沉積，攝入后主要分布于細胞外的空間，經腎小球過濾，以活性組分的形式通過腎臟排出體外，經對鼠、家兔和狗的靜脈注射發現，重組水蛭素半衰期為1小時左右。因此，要更好地發揮水蛭素的預防血栓作用，延長其半衰期是必要的。
本發明所述的化學交聯作用包括使用化學交聯劑，較佳是作用條件溫和的雙交聯劑，在體外通過化學反應將紅細胞與蛋白質偶聯成復合物。所述化學交聯劑優選異型雙功能交聯劑，選自但不限于N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、N-羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)-苯甲酸酯(SMB)等。
SPDP可以通過分子中的活潑酯成分與氨基反應，同時引入巰基，然后通過巰基交換反應或巰基加成反應與另一分子交聯，同類的交聯劑還有N-羥基琥珀酰亞胺基-(4-α-甲基-α-(2-砒啶基二硫代甲基)-苯甲酸酯(SMPT)、N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丁酸酯(SPDB)，通過在二硫鍵的α位引入阻性基團如甲基，增加交聯物的穩定性。
N-羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯的活潑酯成分和α位活潑鹵素可以分別與蛋白分子的巰基及氨基反應，實現分子間的交聯，形成的硫醚鍵在血漿中十分穩定。
SMB的N-羥基琥珀酰亞胺基可以和蛋白的氨基反應，引入馬來酰亞胺基，然后馬來酰亞胺基與另一含有游歷巰基的分子如紅細胞上的蛋白通過巰基對雙鍵的加成反應連接起來。
本發明所述的標記后親和作用包括在紅細胞和蛋白質上分別作分子標記，利用標記物之間或標記物與同一分子作用使紅細胞與蛋白質形成復合物。具體而言，標記后親和作用涉及生物素、親和素和/或鏈霉親和素的使用。
生物素又稱輔酶R或維生素H，在機體內以輔酶形式參與各種羧化酶反應。生物素分子量244.31，分子式C10H16O3N2S，有兩個環狀結構，其中I環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的唯一結構。利用生物素的羧基加以化學修飾可制成各種活性基團的衍生物，稱為活化生物素，以適合與各種生物大分子結合的需要。主要有標記蛋白質氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(NHS-biotin)和生物素對硝基酚酯(pBNP)。
親和素亦稱抗生物素蛋白、卵白素或親和素，是從卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白；等電點10-10.5，含糖約10％，分子量為68kDa。親和素由四個相同的亞基組成，能結合4個分子的生物素。親和素與生物素之間具有非常強的親和力，其親和常數高達1015mol-1，比抗原抗體結合的親和常數(105-11mol-1)至少高10萬倍，因此二者能快速結合，具有高度特異性和穩定性。
鏈霉親和素(SA)是鏈霉菌(Streptomyces avidinii)在培養過程中分泌的一種蛋白質產物。SA的分子量為65kD，由4條序列相同的肽鏈組成。鏈霉親和素與生物素的親和常數亦為1015mol-1。SA的每條肽鏈含159個氨基酸殘基，等電點為6.0，不帶任何糖基。SA在檢測應用中出現的非特異中結合遠低于親和素。而且SA在大腸桿菌中已獲得高效表達。
生物素與親和素(或鏈霉親和素)在分析系統中已廣泛應用，主要優點有(1)親和素和生物素之間非常強的親合力；(2)可以將生物素連接到許多探針或配體上，而不改變它們的生物活性和生理特性；(3)存在許多商品化的生物素化試劑以及含親和素的探針。
生物素標記蛋白目前已得到廣泛的應用，生物素標記的抗體被廣泛地應用于診斷及蛋白檢測，生物素標記相對比較溫和，可以保留原蛋白的生物活性。親和素及鏈霉親和素標記蛋白也有很多的應用，比如親和素及鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶及堿性磷酸酯酶已經在檢測中廣泛應用。
生物素標記紅細胞的方法相對比較成熟。Magnani M.等(Biotechnol.Appl.Biochem.，20335-345，1994)用NHS-Biotin(與紅細胞膜蛋白的氨基結合)和生物素酰肼(biotin hydrazide，可引起紅細胞膜的酰基氧化)使紅細胞生物素化。通過比較發現，用NHS-Biotin進行標記具有更高的體外恢復率(＞90％)，并在循環中24小時不受損害。相反，生物素酰肼標記的細胞恢復率僅為5-30％，24小時內幾乎消失。由于NHS-Biotin是脂溶性物質，只能用脂類物質來溶解，從而不可避免地帶來了在標記過程中脂類物質對紅細胞及動物體的毒副作用。在體外標記實驗中，常用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)來作為溶劑。DMF的毒性通過測量清洗標記紅細胞后的上清液中DMF的濃度來確定。Hoffmann-Fezer等(Ann.Hematol.74231-238，1997)用氣相色譜法測得上清液中DMF濃度遠遠低于由生理毒性動力模型計算的工作場所暴露在10ppmDMF氣體中的劑量，因此，用DMF溶解NHS-Biotin標記紅細胞并經過清洗后，再將紅細胞注入動物體內，不會發生危險。在體內標記實驗中，常用DMSO和DMA(二甲基乙酰胺)，雖然DMSO的毒性被描述過(狗LD50＝2.5g/kg)，但它與DMA相比毒性較低，而且作為NHS-Biotin的溶劑效果更好。在實驗中，通常給動物注射硫酸阿托品來抵消DMSO的潛在的副作用。Suzuki等(Blood，70(3)791-795，1987)發現將NHS-Biotin與紅細胞共同孵育會引起紅細胞的棘化，在用琥珀酰化的BSA(succinylated BSA)處理后，阻止了紅細胞的形變，使之保持與對照紅細胞相同的形態。Cavill等(Br.J.Haematol.70491-493，1988)用NHS-LC-biotin和51Cr標記，測量19人的紅細胞體積，發現兩種標記之間沒有差異。將紅細胞同時標記上NHS-Biotin和14C，并用14C標記對照紅細胞，在一定時間間隔內監外周血中生物素標記和14C標記的紅細胞的百分數，發現兩種標記的紅細胞具有相同的生存能力。Russo等(Biotechnol.Appl.Biochem.，20335-345，1994)用流式細胞計證明了標記紅細胞具有正常的生存周期。
在本發明的一個實施例中，用生物素分別標記紅細胞和水蛭素，然后用鏈霉親和素將兩者連在一起，形成紅細胞與水蛭素的復合物。
在本發明的另一實施例中，先用生物素標記紅細胞，然后用化學交聯的方法將鏈霉親和素與水蛭素連接，然后通過生物素與鏈霉親和素的親和作用使兩者形成復合物。此復合物中，每個紅細胞表面將有幾千到上萬個水蛭素分子。
本發明還提供了將尿激酶原連接于紅細胞表面的實施例，用生物素標記尿激酶原與紅細胞，然后通過鏈霉親和素將二者連接在一起，得到尿激酶與紅細胞的復合物。
本發明的另一目的是提供一種蛋白質藥物-紅細胞復合物，其中，復合物中的蛋白質通過化學交聯作用或標記后親和作用的方法連接于紅細胞上。所述化學交聯作用包括使用化學交聯劑，較佳是作用條件溫和的雙交聯劑，在體外通過化學反應將紅細胞與蛋白質偶聯成復合物。所述化學交聯劑優選異型雙功能交聯劑，選自但不限于N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、N-羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)-苯甲酸酯(SMB)等。所述標記后親和作用包括在紅細胞和蛋白質上分別作分子標記，利用標記物之間或標記物與同一分子作用使紅細胞與蛋白質形成復合物。具體是通過生物素、親和素和/或鏈霉親和素之間的相互作用，使它們所比較的蛋白質藥物和/或紅細胞相連。
為此，本發明提供了一個優選的蛋白質藥物-紅細胞復合物，具體為由生物素標記的紅細胞通過鏈霉親和素與生物素標記的水蛭素連接而形成的水蛭素-紅細胞復合物。
本發明還提供另一優選的蛋白質藥物-紅細胞復合物，具體為由生物素標記的紅細胞與鏈霉親和素標記的水蛭素通過生物素與鏈霉親和素之間的連接而形成的復合物。
在又一實施例中，本發明還提供了尿激酶原-紅細胞復合物和鏈激酶-紅細胞復合物。
本發明的一個優點是，通過使蛋白質藥物與紅細胞連接，延緩了該藥物被腎小球濾過，從而延長了藥物在體內的作用時間。同時通過紅細胞將藥物限制在血管內作用，降低藥物在其他組織中的分布，不僅可以防止藥物在其他組織中的副反應，而且可以通過降低藥物的表觀分布體積來減少藥物的用量，從而降低藥物的副反應。
本發明的水蛭素-紅細胞復合物與單獨的水蛭素相比，在保留了與單獨的水蛭素相當的強抗凝、抗栓效果的同時，大大延長了體內半衰期。由于一個紅細胞上可以標記有幾千到上萬個生物素，然后與幾千到上萬個鏈霉親和素結合，而每個鏈霉親和素有4個生物素結合位點，即還有3個空余的位點與生物素化的水蛭素結合。因此，實際形成的復合物中，每個紅細胞上最終連接有幾萬個水蛭素。
將尿激酶、鏈激酶、水蛭素等藥物連接于紅細胞表面，也獲得了類似的效果。即，所形成的蛋白質藥物-紅細胞復合物，其作用時間得到延長，藥物劑量減少，而且防止了藥物進入血管外、引起出血的危險。
本發明的另一優點是，使用本發明的蛋白質藥物-紅細胞復合物(包括水蛭素、EPO、G-CSF等藥物與紅細胞形成的復合物)可以避免藥物的每天注射，既減輕了病人的痛苦，還可以增加一些新的臨床應用。
以下以實施例的方式進一步闡述本發明。但是，并不能認為本發明限制于以下的優選實施例。
具體實施例方式
實施例1 水蛭素與紅細胞復合物的制備1.1 紅細胞的生物素標記抽取全血，加肝素抗凝，然后離心收集紅細胞，用pH 7.4磷酸緩沖液(PBS，125mM NaCl+20mM PB)洗滌三次，按10％紅血球容積懸浮于PBS-G(PBS+5mMglucose)。將NHS-biotin按200mg/ml溶解于90％的DMSO中，然后按每毫升紅細胞加0.055mg的NHS-biotin混勻，37℃保溫1小時，然后用PBS洗滌三次，得到標記好的紅細胞。
1.2 水蛭素的生物素標記用DMF將NHS-Biotin配成1mg/ml溶液，然后用0.1M，pH 9.0NaHCO3將水蛭素稀釋成1mg/ml。將NHS-Biotin與水蛭素按重量比1∶7左右混合，室溫攪拌下反應4小時，裝入透析袋，對0.05M pH 7.2 PBS在4℃透析過夜，去除未反應的NHS-biotin。
1.3 水蛭素-紅細胞復合物的制備先將生物素化的水蛭素與鏈霉親和素按摩爾數比1∶1混合，室溫攪拌下反應30分鐘，然后加入生物素化的紅細胞，輕輕搖動反應30分鐘，離心收集紅細胞-水蛭素復合物。
1.4 水蛭素比活性的測定水蛭素的測活方法為水蛭素抗凝血酶法100μL含水蛭素的溶液中，加入0.2ml 0.5％纖維蛋白原的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中，混勻后，在室溫下逐滴加入標準凝血酶溶液(100NIH-U/ml)，每次5μL，邊加邊震蕩，然后放置，如果纖維蛋白原在1分鐘內凝固，即滴定完畢，由消耗的凝血酶量計算出水蛭素的活性。然后將活性除以水蛭素的蛋白量得到水蛭素的比活。
用上述方法測定未標記的水蛭素、生物素化的水蛭素及水蛭素-紅細胞復合物中水蛭素的比活，發現標記后比活略有降低，但仍保持絕大部分抗凝血酶活性。
實施例2 水蛭素與紅細胞復合物的制備2.1 紅細胞的生物素標記同實施例1的步驟1.1。
2.2 水蛭素的鏈霉親和素標記將凍于的水蛭素溶解在含有1.25％戊二醛的0.1M pH 6.8PB緩沖液中，終濃度為10mg/ml，室溫作用過夜；裝入透析袋，對0.05M pH 7.2PBS在4℃透析12小時；取出透析物，每毫升水蛭素溶液加入15mg鏈霉親和素和0.5ml 1M pH 9.5Na2CO3，置4℃結合24小時；加入50ul 0.2M賴氨酸室溫2小時終止反應；裝入透析袋，對0.05M pH 7.2PBS在4℃透析過夜。離心去除大分子聚合物，得到鏈霉親和素標記的水蛭素。
2.3 水蛭素-紅細胞復合物的形成將生物素化的紅細胞與鏈霉親和素標記的水蛭素(按每個生物素化紅細胞結合10000個鏈霉親和素標記的水蛭素計算)進行混合，在室溫下輕輕搖動反應30分鐘，離心收集紅細胞-水蛭素復合物。
2.4 水蛭素的比活性測定測定方法參照1.4。結果發現鏈霉親和素標記的水蛭素及與紅細胞形成的復合物仍具有與未標記的水蛭素可比的抗凝血酶活性。
實施例3 水蛭素-紅細胞復合物與單獨的水蛭素的體內半衰期比較取新西蘭家兔30只，分成六組，分別靜脈注射水蛭素或水蛭素-紅細胞復合物，劑量(按水蛭素的蛋白重量計算)分高(0.4毫克/公斤)、中(0.2毫克/公斤)、低(0.1毫克/公斤)三組，然后在注射后5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時取血，然后用夾心ELISA檢測水蛭素濃度。所得數據用P87軟件計算T1/2(α相不計算，只計算β相)。結果表明，水蛭素與紅細胞融合后半衰期大大延長。
實施例4 尿激酶原-紅細胞復合物的制備方法參照實施例1，但是使用尿激酶原替換水蛭素，制得尿激酶原-紅細胞復合物。測得所制得的尿激酶原-紅細胞復合物中的尿激酶原仍保持絕大部分抗凝血酶活性。按照實施例3所述的方法測試本實施例的尿激酶原-紅細胞復合物，結果表明，尿激酶原與紅細胞融合后其半衰期大大延長。
實施例5 鏈激酶-紅細胞復合物的制備方法參照實施例1，但使用鏈激酶替換水蛭素，制得鏈激酶-紅細胞復合物。測得所制得的鏈激酶-紅細胞復合物中的鏈激酶仍保持絕大部分抗凝血酶活性。按照實施例3所述的方法測試本實施例的鏈激酶-紅細胞復合物，結果表明，鏈激酶與紅細胞融合后其半衰期大大延長。
權利要求
1.一種延長蛋白質藥物體內半衰期的方法，其特征在于，該方法包括，采用化學交聯作用或標記后親和作用的方法將所述蛋白質藥物連接于紅細胞表面，形成蛋白質藥物-紅細胞復合物。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述化學交聯作用包括使用化學交聯劑在體外通過化學反應將紅細胞與蛋白質偶聯成復合物。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述標記后親和作用包括在紅細胞和蛋白質上分別作分子標記，利用標記物之間或標記物與同一分子作用使紅細胞與蛋白質形成復合物。
4.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述標記物選自生物素和親和素或鏈霉親和素。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白質藥物選自水蛭素、尿激酶、鏈激酶、尿激酶原和蝮蛇抗栓酶。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白質藥物是水蛭素。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括用生物素分別標記紅細胞和水蛭素，用鏈霉親和素將標記的紅細胞與標記的水蛭素連在一起，形成紅細胞-水蛭素復合物。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括用生物素標記紅細胞，用化學交聯的方法將鏈霉親和素與水蛭素連接，然后通過生物素與鏈霉親和素的親和作用使兩者形成復合物。
9.一種蛋白質藥物-紅細胞復合物，其特征在于，該復合物中的蛋白質藥物通過化學交聯作用或標記后親和作用的方法連接于紅細胞上。
10.如權利要求9所述的蛋白質藥物-紅細胞復合物，其特征在于，所述蛋白質藥物-紅細胞復合物為生物素或鏈霉親和素標記的水蛭素、尿激酶、鏈激酶、尿激酶原或蝮蛇抗栓酶與生物素標記的紅細胞形成的蛋白質藥物-紅細胞復合物。
全文摘要
本發明涉及用紅細胞作為載體延長蛋白質藥物在體內的半衰期的方法。此方法不僅可以延長藥物在體內的半衰期，還可以降低藥物用量，防止藥物擴散到血管外，從而降低藥品的副作用。本發明還涉及一種蛋白質藥物－紅細胞復合物，該蛋白質藥物以紅細胞為載體而被傳送至體內。
文檔編號A61K38/55GK1628844SQ20031010948
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月17日 優先權日2003年12月17日
發明者倪健, 楊子義, 楊武劍 申請人:上海富純中南生物技術有限公司